Введение к работе
Актуальность вопроса. Микробиологическое производство аминокислот является одной из ведущих отраслей современной биотехнологической промышленности. Дальнейшее ее развитие обусловлено уровнем знаний по получению и применению новых перспективных продуцентов аминокислот, разработкой эффективных путей управления их биосинтезом, а также выработкой новых препаративных форм.
Мировой уровень производства аминокислот е высокоразвитых странах высок. В Армении создана достаточно крупная микробиологическая промышленность аминокислот. В республике усилиями большого коллектива специалистов были созданы крупномасштабное производство кормового лизина и мелкомасштабные производства некоторых аминокислот: пролина, валина, гистидина, фенилаланина, аргинина и
ДР-
Аргинин находит широкое применение в медицине, особенно в
составе инфузионных растворов для лечения рака крови, до- и послеоперационного лечения больных, при лучевой болезни и как крово-заменитель, в пищевой промышленности и в сельском хозяйстве [Levere et а!..19913. Промышленное производство L-аргинина в мире преимущественно основано на микробиологическом синтезе. В СНГ крупномасштабное производство L-аргинина отсутствует, в то же время потребность в этой аминокислоте все растет.
Дели я задачи исследования. Основной целью данной работы является изучение физиологических характеристик штамма-продуцента L-аргинина Escherichia coli LGE-28 СПетросян и др. ,19943, сконструированного в НИИ Биотехнологии МЛ РА . и разработка оптимальных технологических параметров, обеспечивающих сверхсинтез L-аргинина в ферментаторе.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие конкретные задачи:
- разработка и оптимизация составов посевных и ферментационных сред для культивирования продуцента в лабораторных и опытно-промышленных условиях;
-4.-
разработка условий культивирования, применение и хранение посевного материала, обеспечивающих максимальный вькод L-аргинина;
оптимизация параметров стерилизации посевных и ферментационных сред, обеспечивающих рост биомассы и интенсивную продукцию L-аргинина;
обоснование материально-энергетического баланса культуры Е. coli при биосинтезе L-аргинина, с определением путей, обеспечивающих наиболее высокий выход L-аргинина, с наименьшей затратой субстратов для повышения экономического коэффициента;
изучение влияния различных технологических параметров (рН, температура, аэрация ) на биосинтез L-аргинина и разработка оптимальных условий для сверхсинтеза.
Научная новизна. Впервые разработан микробиологический способ получения L-аргинина с использованием генно-инженерного штамма-продуцента Е.coli LGE-28, сконструированного в НИИ Биотехнологии МП РА.
Разработаны оптимальные посевные и ферментационные среды, условия их стерилизации и культивирования, которые обеспечивают, как максимальный рост культуры, так и сверхсинтез L-аргинина.
Обоснован материально-энергетический баланс культуры Е. cola при биосинтезе L-аргинина и для каждого пути биосинтеза вычислены некоторые коэффициенты оценки процесса.
Практическая значимость. На основе полученных данных разработаны лабораторный и опытно-промышленный регламенты получения L-аргинина, что дает возможность развернуть как опытное, так и крупномасштабное производство, с обеспечением выхода целевого продукта до 35 г/дм3, что находится на уровне современного производства в развитых странах.
Опытно-промышленный регламент используется для организации производства L-аргинина на Воронежском заводе кровезаменителей.
Основные положения, выносимые на защиту:
- генно-инженерный штамм Е.coli LGE-28 является высокопродук
тивным продуцентом L-аргинина, обеспечивающим в оптимальных усло
виях биосинтез целевого продукта в пределах 35 г/дм1 ;
на процесс биосинтеза L-аргинина определяющее влияние оказывают сахароза, рыбный гидролизат и источники фосфорного питания;
экономический коэффициент процесса биосинтеза L-аргинина находится в прямой зависимости от активности ФШ-карбоксилазы и/или "яблочного фермента" и в обратной - от активности изоцит-ратлиазы;
режимы стерилизации, соответствующие, значениям критерия стерилизации, равному 33-100, обеспечивают гарантированную стерильность, причем наиболее эффективной может считаться высокотемпературная стерилизация с кратковременной выдержкой;
регуляция рН среды в процессе биосинтеза L-аргинина при помощи аммиачной воды снимает ингибирование по азоту и приводит к увеличению накопления целевого продукта в культуральной жидкости;
- биосинтез L-аргинина наиболее продуктивен при 31 С.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены
на Ученом совете НИИ Биотехнологии Г Ереван. 1993] и производственном совещании лаборатории микробиологической технологии совместно с лабораторией селекции продуцентов биологически активных веществ НИИ Биотехнологии [Ереван, 1995].
Публикации. Основные результаты исследований изложены в 7 публикациях, в том числе 1 авторское свидетельство.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения,
обзора литературы, экспериментальной части, заключении, выводов, практических предложений и списка литературы. Работа изложена на V" страницах машиннописного текста, иллюстрирована 25 рисунками и 15 таблицами. Список иопс.чьссбпнлсй литературы включает 101 наименование.
''Сг.-, литературы обобщает современное состояние вопроса о биосинтезе L-аргинина, используемых штаммах-продуцентах и питательных средах с критическим рассмотрением влияния факторов внешней среды и ултппл --7":тт.. :,ч.і;', np:;> :.?:..