Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Общая характеристика молочнокислых бактерий 19
1.1.1. Скрининг изолятов молочнокислых бактерий из различных экологических ниш
1.1.2. Идентификация молочнокислых бактерий классическим методом, генотипированием и MALDI–TOF MS
1.1.3. Обмен веществ молочнокислых бактерий 28
1.1.4. Антагонистическая и пробиотическая активность молочнокислых бактерий
1.2. Лактобактерии в модельной системе на основе 39
растительных соков
1.3. Молочнокислые бактерии в растительно-бактериальных ассоциациях фило- и ризосферы сельскохозяйственных культур
1.3.1. Эпифитная микрофлора культурных растений 42
1.3.2. Значение ризосферных бактерий в развитии культурных растений
1.4. Применение культур молочнокислых бактерий при ферментации растительных масс
1.4.1. Микробиологические процессы при консервировании 55
растительных масс
1.4.2. Биологические и химические методы ферментации кормовых культур
1.4.3. Химический состав и питательность готового корма 59
1.4.4. Индивидуальные штаммы молочнокислых бактерий для 63
создания биологических консервантов
2. Материалы и методы исследований 73
2.1. Методики исследований 75
2.2. Статистическая обработка данных 97
3. Результаты исследований и их обсуждение
3.1. Фило- и ризосфера многолетних бобовых трав как источники выделения молочнокислых бактерий
3.1.1. Микрофлора филосферы 98
3.1.2. Микрофлора ризосферы 101
3.2. Характеристика выделенных изолятов молочнокислых бактерий
3.2.1. Родовая идентификация штаммов молочнокислых бактерий 105
3.2.2. Осмотолерантность лактобактерий 109
3.2.3. Протеолитическая активность штаммов молочнокислых бактерий
3.2.4. Генотипирование кислотообразующих бактерий 113
3.2.5. Масс–спектрометрический анализ штаммов молочнокислых бактерий
3.3. Изучение биотехнологических свойств молочнокислых бактерий в модельной системе
3.3.1. Состав растительных субстратов 117
3.3.2. Динамика численности молочнокислых бактерий при ферментации растительных соков
3.3.3. Изменение активной кислотности среды при сбраживании соков бобовых трав
3.3.4. Концентрация молочной кислоты на завершающем этапе ферментации растительных соков
3.3.5. Количественное содержание витаминов А и Е 128
3.3.6. Результаты совместного культивирования молочнокислых бактерий и Candida scotti
3.4. Анализ результатов опытного консервирования высокобелковых трав
3.4.1. Определение эффективности интродуцированных рифампицин–устойчивых штаммов молочнокислых бактерий в процессе консервирования многолетних трав
3.4.2. Численность основных групп сопутствующих микроорганизмов в ходе ферментации растительных масс
3.4.3. Изменение активной кислотности субстрата 161
3.4.4. Состав органических кислот в процессе консервирования многолетних трав
3.5. Изучение и анализ устойчивости микробных сообществ в прикорневой зоне многолетних культур
3.5.1. Количественная характеристика основных групп ризосферных микроорганизмов бобовых трав разного года пользования
3.5.2. Состав и структура сообщества микромицетов прикорневой 178
зоны многолетних трав
3.5.3. Биологическая активность и агрохимическая оценка 180
ризосферной почвы многолетних кормовых культур
3.6. Производственные испытания Универсальной силосной 192
закваски при ферментации бобовых трав
3.6.1. Сенажирование клевера с микробиологическим препаратом и добавлением патоки
3.6.1.1. Характеристика растительного сырья и схема опыта 193
3.6.1.2. Значение кислотности и состав органических кислот в 194
ферментируемой массе
3.6.1.3. Состав аминокислот в сенаже клевера 197
3.6.1.4. Питательность ферментированного корма 200
3.6.2. Силосование люцерны с использованием биологического и химических консервантов
3.6.2.1. Характеристика зеленой массы, основные химические показатели и питательность люцернового силоса
3.6.2.2. Оценка затрат на применение биологического и химических 206
консервантов
3.7. Внедрение и эффективность микробиологического 209
препарата «Универсальная силосная закваска – БИОАГРО»
3.7.1. Производственные испытания в агрохозяйствах 209
3.7.2. Регламент и методика применения микробиологического 213
препарата «Универсальная силосная закваска – БИОАГРО»
3.8. Схема и технологический регламент производства 216
микробиологического препарата «Универсальная силосная закваска – БИОАГРО»
3.8.1. Опытно–промышленный регламент производства 216
биологического консерванта
3.8.2. Технологическая схема промышленного производства 218
микробиологического препарата
3.8.3. Технические условия для промышленного производства 221
Универсальной силосной закваски
4. Заключение 225
5. Выводы 239
6. Предложения производству 243
7. Список литературы
- Антагонистическая и пробиотическая активность молочнокислых бактерий
- Статистическая обработка данных
- Протеолитическая активность штаммов молочнокислых бактерий
- Характеристика зеленой массы, основные химические показатели и питательность люцернового силоса
Введение к работе
Актуальность работы. Молочнокислые бактерии (МКБ) относятся к группе бактерий, играющих разностороннюю роль в жизни человека. МКБ широко используются в сельскохозяйственном производстве при биоконсервировании органической массы, при этом они обеспечивают сохранение основных биологических свойств зеленых растений, а также способствуют повышению энергетической ценности и питательности готового корма в сравнении с исходным материалом [Квасников Е.И. и соавт., 1968б, 1975; Мак-Дональд П., 1985; Победнов Ю.А., 2005;. Панкратов В.В, 2009; Победнов Ю.А. и соавт., 2013; McDonald P. et al., 1991; Giraffa G. et al., 2010; Yang J. et al., 2010; Arasu M.V. et al., 2014a; Corsetti A. et al., 2015]. Известно, что общий уровень производства грубых и сочных кормов за последние 20 лет уменьшился более чем в 4 раза. Только 50–60% растительных кормов кондиционные, которые соответствуют 1 и 2 классу и их основным недостатком является низкое содержание протеина [Ситников Н., 2012; Косолапов В.М. и и соавт., 2014б].
В настоящее время использование чистых штаммов молочнокислых бактерий или их консорциумов в целях улучшения процесса консервирования и повышения качества кормов, полученных из различных однолетних и многолетних культур, является одним из основных направлений исследований [Зубрилин А.А., 1964; Квасников Е.И. и соавт., 1968б, 1975; Чуканов Н.К. и соавт., 1986; Победнов Ю.А., 2005, 2008;. Победнов Ю.А и соавт., 2013; McDonald P. et al., 1991; Nadeau E. et al., 2000; Contreras-Govea F.E. et al., 2013; Avila C.L.S. et al., 2014; Arasu M.V. et al., 2015]. Для ферментации при заготовке растительных кормов на территории Российской Федерации разработаны и предложены более двадцати биологических консервантов, однако практика их применения не всегда гарантирует получение доброкачественного корма. [Панов А.А и соавт., 1988; Schmidt R.J. et al., 2009]. Известно, что решение проблемы промышленного производства микробиологических препаратов (биологических заквасок) для консервирования различных кормовых культур связано с поиском, подбором и анализом эффективных штаммов молочнокислых бактерий [Квасников Е.И., 1960; Квасников Е.И. и соавт., 1967, 1968а;. Победнов Ю.А, 2003; Победнов Ю.А. и соавт. 2013; Pang H. et al., 2011а; O'Donnell M.M. et al., 2013].
Для процесса ферментации высокобелковых бобовых растений необходимы стартовые культуры молочнокислых бактерий, которые тщательно подобранны по определенным признакам. Это – гомоферментативность, осмотолерантность, интенсивность роста с доминированием над сопутствующими микроорганизмами в консервируемой массе, высокая скорость ацидогенеза, синтез органических кислот, низкая протеолитическая активность, антагонистический эффект и аэробная стабильность корма [Квасников Е.И. и соавт., 1975; Мак-Дональд П., 1985; Определитель Берги, 1997; Победнов Ю.А., 2011; McDonald Р. et al., 1991; Valerio F. et al., 2004; De Vos P. et al., 2009; Weinberg Z.G. et al., 2010; Heinritz S.N. et al., 2012; Vikova E. et al., 2012].
С учетом приведенных особенностей молочнокислых бактерий следует обратить внимание на молочнокислую микрофлору из естественных экологических ниш (филосфера, растительный сок, ризосфера и др.).
Филосферные микроорганизмы приспособлены к негативным условиям окружающей среды, а также их количество значительно изменяется в течение суток [Morris C.E., 2001; Pang H. et al., 2012]. Известно также, что аборигенная молочнокислая микрофлора из таких природных экологических ниш, находящаяся под постоянным давлением стабилизирующего отбора, которая наиболее приспособлена к физико–географическим условиям региона и отличается стабильностью проявляемых свойств [Буряко И.А. и соавт., 1997; Рамонова Э.В., 2011].
Выделенные из эпифитной микрофлоры лактобактерии различаются по своим физиолого– биохимическим свойствам, так среди них более активны лактобациллы и менее – лактококки [Pang H. et al., 2012]. Изолированные штаммы молочнокислых бактерий идентифицированы как Lactobacillus plantarum и L. buchneri, которые обладают крайне высокой способностью к кислотообразованию [Квасников Е.И. и соавт., 1975].
В связи с этим можно заключить, что поиск штаммов молочнокислых бактерий, способных доминировать над нежелательной спонтанной микрофлорой и обеспечивать чистоту процесса ферментации кормов, будет более успешным в надземной части растений.
Тестирование отобранных штаммов молочнокислых изолятов непосредственно в производственном силосовании, по завершении скрининга и идентификации является сложным и длительным по времени процессом, в связи с этим необходимо создание модельных систем для изучения как самого процесса консервирования, так для подбора и применения силосного инокулята [Tanaka O. et al., 1994b, 1998; Gardner N. et al., 2001; Niderkorn V. et al., 2007; Sharma V. et al., 2014].
С учетом приведенных исследований в настоящее время перспективна разработка модельной схемы по выделению и созданию банка штаммов молочнокислых бактерий с ценными биотехнологическими признаками, которая может служить методической базой для решения проблем консервирования как бобовых трав, так и их травосмесей.
Степень разработанности проблемы. Исследования по разработке микробиологических препаратов и определению их эффективности при биоконсервировании растительных ресурсов ведутся более ста лет. В России такие исследования организованы в начале 30–х годов, которые продолжаются и по настоящее время.
В отношении результатов применения чистых культур молочнокислых бактерий в
ферментации кормов особого внимания заслуживают работы Е.И. Квасникова с соавторами
[1975]. Автор, подводя итоги результатов собственных многолетних экспериментальных работ
по использованию лактобактерий в Средней Азии и на Украине [Квасников Е.И., 1960, 1967;
Квасников Е.И. и соавт., 1968а, 1968б; 1975], а также обобщая опыт ряда отечественных и
зарубежных исследователей сформулировал основные принципы и подходы управления
микробиологическими процессами при сбраживании растительных субстратов, которые
необходимо учитывать при разработке и создании эффективных микробиологических силосных
заквасок. Важной стороной биоконсервирования растительных масс, особенно высокобелковых и
трудносилосуемых, является введение в производственный процесс специально
отселекционированных культур гомоферментативных молочнокислых бактерий в стадии высокой физиологической активности и с достаточно высокой скоростью размножения.
В дальнейшем исследования других авторов по молочнокислым бактериям в основном касались вопросов разработки и практического применения биологических консервантов в агротехнологиях, затрагивая отдельные конкретные вопросы, порой хаотично и, как правило, без учета основополагающих подходов микробиологического процесса ферментации зеленой массы.
В настоящее время в России разработаны и предложены различные бактериальные препараты для силосования, история применения которых свидетельствует об очень разной степени их эффективности [Победнов Ю.А. и соавт., 1997а, 1997б; Победнов Ю.А., 2010]. Анализируя создавшуюся ситуацию с применением заквасок для силосования, некоторые авторы [Буряко И.А. и соавт., 2000; Lynch J.P. et al., 2012] приходят к заключению, что их использование не всегда гарантирует получение доброкачественного корма.
Вместе с тем, как справедливо указывал Квасников Е.И. и соавт., [1975], трудно согласиться с заключением о том, что вопрос об эффективности применения микробиологических препаратов для консервирования растительных масс следует оценивать, как дискуссионный, особенно в агропроизводстве на территории Российской Федерации.
Анализ литературных источников показал, что в РФ производство большей части заквасок для заготовки объемистых кормов осуществляется кустарно и с нарушением элементарных требований, выработанных и применяемых при культивировании микроорганизмов. Поэтому вопрос об использовании чистых культур в процессе биоконсервирования растительного сырья не нашел еще конструктивного, технологического и организационного решения.
Цель и основные задачи исследований. Цель – совершенствование процесса
биоконсервирования растительных ресурсов путем создания эффективного
микробиологического препарата на основе штаммов молочнокислых бактерий, выделенных из
различных природных источников. Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
1. Определить состав и структуру микробного сообщества филосферы исследуемых бобовых
трав.
2. Исследовать микрофлору ризосферы многолетних бобовых трав как одну из основных
естественных экологических ниш молочнокислых бактерий.
3. Выделить из различных природных источников штаммы молочнокислых бактерий и
идентифицировать изоляты микробиологическим, молекулярно–генетическим и MALDI–TOF
методами.
4. Оценить в модельном опыте физиолого–биохимическую активность природных штаммов
молочнокислых бактерий и их способность к ферментации растительного субстрата.
-
Провести опытное консервирование клевера лугового и козлятника восточного с интродукцией маркированных по рифампицину природных молочнокислых бактерий и оценить эффективность штаммов в процессе ферментации посредством использования микробиологических и биохимических показателей.
-
Разработать микробиологический препарат с оптимальными биотехнологическими свойствами для консервирования высокобелковых и других кормовых культур.
7. Провести оценку эффективности ферментации растительных масс созданным
микробиологическим препаратом, определить химический состав и питательность полученных
кормов (силос, сенаж) в производственных условиях.
8. Разработать и утвердить в соответствии с действующим законодательством нормативно–
техническую документацию микробиологического препарата для его производства и применения
в промышленных масштабах.
Научная новизна работы. Впервые создана региональная коллекция штаммов молочнокислых бактерий, изолированных из фило – и ризосферы бобовых трав, растительных соков, кукурузного силоса с ценными биотехнологическими свойствами и способных обеспечить решение проблемы консервирования традиционных и перспективных высокобелковых бобовых трав. С использованием молекулярно–генетического метода и MALDI–TOF MS четыре штамма молочнокислых бактерий идентифицированы как Lactobacillus plantarum.
Впервые создана биотехнологическая модельная система оценки свойств микроорганизмов, с помощью которой продемонстрирована принципиальная возможность проведения исследований с большим количеством изучаемых штаммов молочнокислых бактерий и ферментируемых растений в регламентируемых условиях лабораторного эксперимента [Патент RU № 2309605 от 10.11 2007].
Впервые установлено, что гомоферментативные штаммы Lactobacillus plantarum RS3 и L. plantarum RS4, выделенные из филосферы бобовых трав, в значительной степени способствуют росту и развитию спонтанной молочнокислой микрофлоры в процессе консервирования растительных масс и обладают высокой скоростью кислотообразования в сочетании с осмотолерантностью, низкой протеолитической активностью и антагонистическим эффектом.
Впервые обозначены перспективы поиска биотехнологичных ассоциаций молочнокислых бактерий и селекция высокоактивных штаммов из природных источников, использование которых при консервировании растительного субстрата способны обеспечить оптимальную биологическую ферментацию кормов с сохранением основных питательных элементов, а также преобразование высокомолекулярных органических соединений в более доступные для животных формы.
Впервые проведено опытное консервирование высокобелковых бобовых трав клевера лугового и козлятника восточного с инокуляцией рифампицин–устойчивых (RifR) природных штаммов молочнокислых бактерий с мониторингом их физиолого–биохимической активности в процессе ферментации по сравнению с сопутствующей молочнокислой микрофлорой.
Впервые предложены основные биотехнологические критерии оценки эффективности молочнокислых бактерий, используемых для создания биологических консервантов. Определено, что концентрация лактобактерий не может быть использована в качестве интегрального
показателя при подборе молочнокислых бактерий для ферментации ресурсов. Необходимо
проведение комплексной оценки используемых стартовых культур лактобактерий (численность
рифампицин–устойчивых молочнокислых бактерий, концентрация лактата, стадия
физиологического цикла, активная кислотность среды и антагонистический эффект).
На основе гомоферментативных осмотолерантных природных молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum RS3 и L. plantarum RS4 создан микробиологический препарат «Универсальная силосная закваска – БИОАГРО» (далее по тексту препарат), прошедший испытания в промышленных условиях. Указанный опыт использован при разработке Инвестиционного проекта для постройки предприятия по производству микробиологических средств для агрохозяйств Поволжья, одобренный специальным решением Экспертного Совета Национального Фонда малого и среднего бизнеса при Совете Федерации РФ (от 09.01.2015 г. за № 341/13) (Приложение № 12).
Практическая значимость работы. При создании активных культур или ассоциаций микроорганизмов с заданными свойствами, конвертирующих соответствующие компоненты растительного сырья, необходимо не только обладать информацией о метаболизме этих компонентов и действующих на них ферментов, а также следует учитывать особенности действия стабилизирующего отбора среды, из которой происходит выделение штаммов молочнокислых бактерий. Получение активных гомоферментативных осмотолерантных штаммов из указанных источников, особенно из эпифитной микрофлоры бобовых растений (клевер, люцерна), а также изучение микробиологических и биохимических процессов консервирования высокобелковой растительной массы с их применением становится особенно актуальным как с позиции сельскохозяйственной микробиологии, так и прикладной биотехнологии. Только при таком подходе возможно создание высокоэффективных биотехнологических систем и препаратов, позволяющих экономически оправданно получать высококачественные корма для животноводства и другие необходимые продукты биологической конверсии.
Основной практический вклад проведенных исследований связан с решением задач по
усовершенствованию технологии консервирования трудносилосуемых бобовых трав
посредством использования биотехнологичных штаммов молочнокислых бактерий, а также оптимизации и увеличения заготовки качественных объемистых кормов.
Полученные в результате работы штаммы молочнокислых бактерий депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) Федеральном государственном бюджетном учреждении науки института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина (ФГБУН ИБФМ, г. Пущино Московская область) под номерами: ВКМ В-2341 Д – Lactobacillus sp. RS2, ВКМ В-2342 Д – Lactobacillus sp. RS3, ВКМ В-2343 Д – Lactobacillus sp. RS4, ВКМ В-2344 Д – Lactobacillus sp. RS7. На базе указанных штаммов создан музей молочнокислых бактерий рода Lactobacillus, органически связанных с бобовыми культурами Республики Татарстан.
Проведен молекулярно–генетический анализ четырех природных штаммов молочнокислых бактерий, их видовая принадлежность установлена с помощью секвенирования гена 16S рРНК и гена pheS. Выявлено, что штаммы относятся к виду Lactobacillus plantarum. Нуклеотидные последовательности данных штаммов аннотированы в базе данных GenBank NCBI (США) под следующими номерами: Lactobacillus plantarum RS3 – KR779536 и 779532, L. plantarum RS4 – KR779537 и KR779533, L. plantarum RS6 – KR779538 и KR779534, L. plantarum RS7 – KR 779539 и KR779535. Результаты масс–спектрометрии (MALDI–TOF MS) рибосомных белков подтвердили идентичность их с данными ПЦР–генотипирования, о чем свидетельствует высокий уровень совпадения спектров изучаемых и типичных штаммов Lactobacillus plantarum (показатель Score 2.0).
Обоснованные в работе приемы создания коллекции природных штаммов молочнокислых бактерий с оптимальными и стабильными биотехнологическими свойствами являются основой для решения проблем консервирования различных растительных ресурсов не только на территории Республики Татарстан, но и применительно к другим регионам РФ.
Результаты работ по моделированию системы оценки физиологических возможностей микроорганизмов и консервируемости растений позволяют исследователям определить набор штаммов молочнокислых бактерий для создания биологических консервантов, оптимально соответствующих для ферментации зеленой массы, исключая трудоемкий процесс промышленных испытаний.
С применением природных штаммов молочнокислых бактерий осуществлено опытное силосование высокобелковых трав, которое продемонстрировало эффективность ферментации растительных ресурсов для получения качественного корма.
Результаты исследований позволили создать микробиологический препарат
«Универсальная силосная закваска – БИОАГРО» и рекомендовать его для промышленного применения при консервировании различных растительных масс.
Основные положения, выносимые на защиту:
– направленный скрининг молочнокислых бактерий из различных природных источников, включивший фило– и ризосферу бобовых культур, и силоса, позволяет получить семь штаммов молочнокислых бактерий рода Lactobacillus, обладающих повышенной способностью к продукции молочной кислоты и эффективные для биоконсервирования растительных масс, и особенно трудносилосуемых;
– моделирование молочнокислого сбраживания соков бобовых растений обеспечивает сравнительную оценку эффективности предварительно отобранных природных штаммов лактобактерий как потенциальных компонентов стартовых культур, и создание банка данных о биотехнологичных штаммах молочнокислых бактерий и силосуемости растений;
– по результатам классического, молекулярно–генетического и масс–спектрометрического методов определения четыре выделенных природных штамма молочнокислых бактерий Lactobacillus sp. RS3, Lactobacillus sp. RS4, Lactobacillus sp. RS6 и Lactobacillus sp. RS7 относятся к виду Lactobacillus plantarum;
– использование показателей численности (титр), концентрации молочной кислоты, рН среды, физиологического состояния микроорганизма и антагонистических свойств позволяет получить комплексную оценку биотехнологических свойств стартовых культур молочнокислых бактерий;
– интродукция природных лактобацилл Lactobacillus plantarum RS3 RifR и L. plantarum RS4 RifR обеспечивает оптимальный режим консервирования высокобелковых культур для получения качественного и сбалансированного растительного корма;
– разработанный микробиологический препарат соответствует требованиям, предъявляемым к силосным закваскам и эффективен в производственных испытаниях при ферментации бобовых и бобово–злаковых трав и обладает значительным преимуществом от существующих биологических и химических консервантов;
– применение в качестве биологического консерванта, разработанного нового
микробиологического препарата «Универсальная силосная закваска – БИОАГРО» для ферментации растительных масс позволяет получить от 70 до 93% силоса и сенажа из многолетних бобовых и других трав, соответствующих 1 классу по ГОСТ 23637, 23638 и ГОСТ Р 55452 и 55986, от общего объема заготовленных кормов.
Личный вклад автора заключается в формировании новых этапов при подборе
молочнокислых бактерий для создания биологических консервантов, постановке цели и задач
исследований, непосредственном планировании экспериментов и выполнении исследований,
обобщении, интерпретации результатов и применения их на производстве, разработке
нормативной документации. Результаты диссертационной работы являются совокупностью
многолетних научных исследований, проведенных в ФГБНУ «ТатНИИСХ» лично автором и при
его непосредственном участии в качестве ответственного исполнителя. Шурхно Равиля
Абдулловна лично участвовала при производстве и внедрении созданного микробиологического препарата.
Достоверность результатов исследований подтверждается соответствием теоретических данных с полученными результатами экспериментальных исследований и производственных испытаний. Полученные результаты, обоснованность научных положений и выводов не
противоречат и с достаточной степенью точности согласуются с существующими концепциями, апробированы и подтверждены в промышленных условиях.
Внедрение результатов работы. Полученные данные о биотехнологических свойствах культур молочнокислых бактерий использовали в качестве основы для оформления патента на изобретение (Патент РФ № 2309605, 2007 г., бюллетень № 31 «Способ диагностики силосуемости растений» (Приложение № 1).
В соответствии с действующим природоохранным законодательством составлена научно– техническая документация применения микробиологического препарата: технологический регламент; рекомендации для агрохозяйств; технические условия, утвержденные в установленном порядке (Микробиологический препарат «Универсальная силосная закваска – БИОАГРО» ТУ 9291-001-48672370-2015, номер регистрации 058 / 347675. Приложение № 2).
Производственное силосование с применением микробиологического препарата
«Универсальная силосная закваска – БИОАГРО» внедрено в десяти агрохозяйствах Республики Татарстан. Произведено и использовано 15 тонн микробиологического препарата. Заготовлено силоса и сенажа в количестве 225 тысяч тонн (в основном первого класса) по ГОСТ 23637, 23638 и ГОСТ Р 55452 и 55986. Протоколы анализов качества кормов, акты внедрения и справка МСХиПр РТ представлены в Приложениях № 3–9.
По результатам исследований разработано учебно–методическое пособие «Основы биоконверсии растительного сырья» Р.А. Шурхно, Р.З. Агзямов, А.А. Халилова, Е.В. Перушкина, В.Б. Борисова, А.С. Сироткин. – Казань: Изд-во КНИТУ, 2014. – 100 с., предназначенное для бакалавров и магистров по направлению «Биотехнология», а также по смежным специальностям и направлениям, связанными с технологиями переработки растительного сырья.
Основные результаты работы нашли применение при разработке автором лекционного
курса «Технология биоконверсии растительного сырья» для подготовки студентов ФГБОУ ВПО
Казанского национального исследовательского технологического университета по
специальности 24090165 «Биотехнология», специализации «Технология биоконверсии растительного сырья».
Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на заседаниях Методического и Ученого советов ФГБНУ «ТатНИИСХ» (2000–2015 гг.). Основные положения и результаты исследований диссертационной работы доложены на 18–ти международных, российских и региональных конференциях и симпозиумах: на III Международной научно– производственной конференции «Интродукция нетрадиционных и редких сельскохозяйственных растений» (Пенза, 2000), на 9ой и 10ой Международных Пущинских школах–конференциях молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2005, 2006), на Всероссийской научно– практической конференции «Агроэкологические проблемы сельскохозяйственного производства в условиях техногенного загрязнения агроэкосистем» (Казань, 2004), на Всероссийской научно– практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2004), на 2ой Международной научно–практической конференции «Перспективы развития биотехнологий в России» (Пущино, 2005), на Всероссийской научно–практической конференции «Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития» (Киров, 2007), на Республиканской научно–практической конференции молодых ученых «Научные основы технологий производства сельскохозяйственной продукции» (Казань, 2008), на VII Международном научно–практическом симпозиуме «Перспективные ферментные препараты и биотехнологические процессы в технологиях продуктов питания и кормов» (Москва, 2014), на XIV Международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2015), на Международной научной конференции «Актуальные вопросы зоотехнии и ветеринарной медицины: опыт, проблемы и пути их решения» (Казань, 2015), на Всероссийской научно–практической конференции «Повышение эффективности АПК в современных условиях» (Казань, 2015).
С результатами исследований автор выступала на семинарах в Казанском (Приволжском) федеральном университете, на школе молодых ученых во ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Пушкин, Санкт–Петербург), в Казанском государственном аграрном
университете, в Казанском национальном исследовательском технологическом университете, в Агрофизическом НИИ (г. Санкт–Петербург), в Аграрном институте Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева.
Связь работы с научными программами. Исследования выполнены в Центре
аналитических исследований в лабораториях сельскохозяйственной микробиологии,
хроматографического и атомно–абсорбционного анализа, агрохимического анализа почв и зоотехнического анализа кормов Татарского научно–исследовательского института сельского хозяйства. Работы проводились в рамках Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации на 2001–2005 / 2006–2010 гг. (РАСХН). В 2001–2005 гг. исследования осуществлялись по заданию 2.2.16. «Дать комплексную оценку различным видам и сортам многолетних бобовых трав на основе изучения агроэкологической, энергетической, средообразующей, зоотехнической ценности и семенной продуктивности в условиях Республики Татарстан» и по заданию 2.2.17. «Разработать ресурсосберегающие, экологически безопасные способы консервирования растительного сырья разного состава, обеспечивающие получение высококачественных кормов, стабильную сохранность питательных веществ и их биоконверсию в полноценную животноводческую продукцию». В 2006–2010 гг. работа велась в рамках задания 04.17.04. «Разработать эффективные, экологически безопасные, низкозатратные способы консервирования и технологии приготовления объемистых кормов при высокой сохранности энергетической и протеиновой питательности растительного сырья, обеспечивающие максимальную трансформацию питательных веществ в полноценную животноводческую продукцию».
Экспериментальные работы проводились в ТатНИИСХ на полевых участках лаборатории многолетних трав. Часть исследований, связанные с классическим методом идентификации по Берги изолятов молочнокислых бактерий, проводились в лаборатории биологии плазмид ФГБУН ИБФМ им. Г.К. Скрябина. Молекулярно–генетическую идентификацию природных штаммов молочнокислых бактерий с помощью секвенирования гена 16S рРНК и гена pheS проводили в отделе сельскохозяйственной биотехнологии (к.б.н. С.Г. Вологин) ТатНИИСХ (г. Казань) и в ЗАО «Евроген Ру» (г. Москва). Идентификацию штаммов молочнокислых бактерий методом MALDI–TOF MS проводили в междисциплинарном центре коллективного пользования Института фундаментальной медицины и биологии (к.б.н. А. Тойменцева) КПФУ (г. Казань).
Публикации. По теме диссертационной работы подготовлено и опубликовано 46 печатных работ, их них 16 статей в журналах, рекомендуемых ВАК, 1 патент.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, 8 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, основных выводов, предложений производству, списка литературы и приложения. Общий объем работы – 309 страниц, в том числе таблиц - 22, рисунков– 35 и 12 приложений. Список использованной информации содержит 601 наименование.
Антагонистическая и пробиотическая активность молочнокислых бактерий
Штаммы молочнокислых бактерий (закваски для пищевой промышленности, препараты–пробиотики, биологические консерванты для животноводства), отобранные для конкретных задач должны, обладать определенными физиолого–биохимическими свойствами (интенсивность роста и размножения, подавление аборигенной микрофлоры; гомоферментативный тип брожения с образованием максимального количества молочной кислоты, ацидотолерантность [Giraffa G. et al., 2010], антагонистическая активность [Batish V.K. et al., 1989; Dogi C.A. et al., 2013; Arasu M.V.et al., 2013]. Молочнокислые микроорганизмы в составе стартовых культур способны подавлять нежелательную микрофлору за счет синтеза различных антибактериальных метаболитов, таких как органические кислоты (молочная кислота), диоксид углерода, диацетил и бактериоцины. Получены результаты, которые показывают, что среди проверенных штаммов некоторых семейств есть микроорганизмы как с разной интенсивностью синтеза бактериоцинов, так и с разным спектром ингибирования санитарно–показательной микрофлоры. Это говорит о том, что способность синтезировать бактериоцины является не видовой, а штаммоспецифической характеристикой микроорганизмов [Машенцева Н.Г. соавт., 2006; Vogel R.F. et al.,1993]. Выделены и подвергнуты фенотипическому, а также генетическому анализу 65 штаммов молочнокислых бактерий из некачественного, плохо сохраненного травяного силоса. Согласно исследованиям изоляты разделены на 13 групп, которые включали Enterococcus gallinarum, Lactobacillus acidipiscis, L. coryniformis subsp. coryniformis, L. coryniformis subsp. torquens, L. curvatus, L. paraplantarum, L. plantarum subsp. argentoratensis, L. plantarum subsp. plantarum, L. sakei subsp. carnosus, Lactococcus garvieae, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Leuconostoc pseudomesenteroides, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Weissella hellenica, Weissella paramesenteroides и Carnobacterium divergens. И наиболее часто встречаемым штаммом молочнокислой бактерии из всех обработанных образцов явился Lactobacillus plantarum [Tohno M. et al., 2012b]. В научно–исследовательских институтах Японии (Мie and Okayama) изучалось выживание молочнокислых бактерий в силосе и в пищеварительном тракте молочных коров. Их количество, видовой состав и ферментативная активность оказались более значительными в рубцовой жидкости по сравнению с другими отделами пищеварительной системы подопытных животных [Han H. et al., 2014].
Важным моментом при создании биологических консервантов является подбор молочнокислых бактерий и их последующая постоянная селекция для оптимального силосования кормов. Аборигенная молочнокислая микрофлора из естественных источников, подвергнутая стабилизирующему отбору, является наиболее подходящей для этих целей. Поэтому предпочтительным источником выделения активных штаммов для их последующей интродукции в ферментируемую массу являются соответствующие растительные субстраты (филосфера, соки, силос и сенаж) и почва (ризосфера) [Квасников Е.И. и соавт., 1975; Заварзин Г.А., 1987; Форстер К.Ф. и соавт.,1990; Буряко А.И. и соавт., 1997; Pahlow G. et al., 1986; Ries R. ,1988; Lin C. et al., 1992b; Tanaka O. et al., 1994a; Pang H. et al., 2011b, 2012; O Donnell M.M. et al., 2013].
При определении штаммов лактобактерий подбор основной среды и адекватных подходов в целях выяснения реакции бактерий к испытуемому компоненту является решающим фактором. Молочнокислые бактерии включают значительное число видов, как палочковидных, так и кокковых форм, которые отличаются по многим признакам и широко распространены в природе [Квасников Е.И. и соавт., 1975; Краткий определитель Берги, 1980; Мак-Дональд П., 1985; Whittenbury R., 1961; Axelsson L.T., 1993; Holzapfel W.H. et al., 1998; Salminen S., 1998; Salminen S. et al., 2004; Lahtinen S. et al., 2011; Pang H. et al., 2011a]. Исследования в области систематики МКБ позволили определить их филогенетическое родство и даже при удаленности друг от друга отдельных представителей их искусственно объединяют в одну группу, возможно, это оправдано только сходными физиологическими свойствами данных микроорганизмов, где основным продуктом брожения углеводов является молочная кислота [Мак-Дональд П., 1985; Orla-Jensen S., 1919; Dellaglio F. et al., 1986; McDonald P. et al., 1991; Axelsson L.T., 1993, 1998, 2004; Amrane A., 2000].
При идентификации молочнокислых палочковидных бактерий изучаются многие признаки (морфолого–культуральные и физиолого–биохимические, потребности в источниках питания, ферментные системы и другие), но одновременно с этим не все их свойства используются (состав клеточных стенок, антигенные признаки и другие) [Квасников Е.И. и соавт., 1975; Hammes W.P. et al., 1995; De Vos P. et al., 2009; Reis J.A. et al., 2012].
Чистые культуры молочнокислых бактерий культивируются на селективных средах, исследуются на характерные признаки и свойства (форма и размер клеток, подвижность, окраска по Граму, наличие каталазы, способность восстанавливать нитраты в нитриты, отсутствие содержащихся цитохром дыхательных систем) [Мак-Дональд П., 1985; Kandler O. et al., 1986; Axelsson L.T., 1998; Amrane A., 2000; Cai Y. et al., 2012].
Статистическая обработка данных
Образцы фило– и ризосферы растений, силосов. В целях выделения молочнокислых изолятов из надземной части вегетирующих бобовых растений, их ризосферы или силосов получали навески проб (5 г), которые помещали в 45 мл стерильной водопроводной воды. Взвешенную смесь интенсивно встряхивали на качалке при 120 об/мин в течение 30 мин. Из полученной пробы готовили серию разведений. Затем брали определенный объем (0.1 или 1.0 мл) из приготовленного ряда разведений и осуществляли посев на жидкую или агаризованную питательные среды (агар с CaCO3, где вокруг колоний молочнокислых изолятов образуется зона растворения мела) с последующим выделением микроорганизмов в чистую культуру. Далее все выделенные в чистую культуру бактериальные изоляты культивировали на жидкой питательной среде MRS с последующим поверхностным пересевом их на агаризованную среду MRS соответствующего состава. Среди морфологически идентичных колоний (по окраске, форме, текстуре) для выделения в чистую культуру выбирали одну с точным учетом количества всех тождественных ей признаков и культивировали на плотной среде Рогозы с последующей идентификацией молочнокислых изолятов.
Рифампицин–устойчивые (МКБ–RifR) штаммы молочнокислых бактерий получали путем поверхностного посева 18 часовых культур молочнокислых бактерий на среде МRS–агар с содержанием рифампицина 10 мкг/мл и культивировали при 37 С. Отдельные колонии пересевали в жидкую среду МRS с той же дозой антибиотика и инкубировали аналогично, с последующим посевом на среду MRS–агар с содержанием рифампицина 25 мкг/мл. Колонии рифампицин–устойчивых штаммов пересевали в жидкую среду MRS с той же дозой ксенобиотика. Процедуру повторяли с концентрациями рифампицина 50, 75, 100 мкл/мл. Полученные антибиотико–резистентные (100 мкл/мл) штаммы молочнокислых бактерий использовали при опытном консервировании растительных масс.
Численность микроорганизмов других физиологических групп определяли методом посева на плотные питательные среды из различных разведений растительной, силосной и почвенной суспензий, а также растительных соков. Идентификацию до рода проводили по морфолого–культуральным признакам [Методы почвен. …, 1980; Колешко О.И., 1981; Cкворцова И.Н., 1983, 1984; Мирчинк Т.Г., 1988; Методы почвен. …, 1991; Теппер Е.З. и соавт., 1993; Егоров Н.С., 1995; Зенова Г.М. и соавт., 2002; Гусев В.М. и соавт., 2003; Теппер Е.З. и соавт., 2004; Лангелера Й. соавт., 2005; Нетрусов А.И., 2005; Терещенко Н.Н. и соавт., 2011; Rogosa M. et al., 1951; Man J.C. et al., 1960]. Численность микроорганизмов выражали в количестве колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г воздушно–сухого субстрата (зеленая растительная масса, силос, сенаж, почва) после ее высушивания при 105 С или для растительных соков КОЕ/мл. Количество КОЕ микроорганизмов в пересчете на 1 г воздушно– сухой растительной массы, силоса, сенажа и почвы рассчитывали по формуле: а = б в г , где д а – число клеток микроорганизмов в 1 г воздушно–сухого образца; б – среднее число выросших колоний; в – соответствующее разведение; г – количество капель в 1 мл суспензии; д – вес воздушно–сухого образца [Теппер Е.З. и соавт., 1993]. Идентификация молочнокислых изолятов Идентификацию молочнокислых бактерий проводили на основе классических физиолого–биохимических тестов [Краткий определитель Берги, 1980; Определитель Берги, 1997; Kandler O. et al., 1986; Axelsson L.T., 1998, 2004; De Vos P. et. al., 2009]. Тесты на каталазную активность, восстановление нитратов, сбраживание сахаров, газообразование, наличие элементов дыхательной цепи, рост при различных температурах и другие признаки определяли с применением стандартных методов [Методы общ. бактериол., 1983; ГОСТ 10444.11]. Провели молекулярно–генетический анализ четырех природных штаммов молочнокислых бактерий. Видовую принадлежность штаммов установили с помощью секвенирования гена 16S рРНК и гена pheS [Лукашов В.В., 2009; Беспоместных К.В. и соавт., 2010; Weisburg W.G. et al., 1991; Naser S.M. et al., 2005, 2007] и масс–спектрометрическим анализом рибосомальных белков (MALDI–TOF MS) с привлечением данных библиотеки масс–спектров [Ильина Е.Н., 2009; Belkum A. et al., 2012; Croxatto A. et al., 2012]. Морфологические признаки. Морфологию колоний (форма, диаметр, цвет, рельеф, прозрачность) культивированных штаммов молочнокислых бактерий (18–24 часа) изучали на селективной агаризованной среде Рогозы. Морфологию клеток, окрашивание по Граму, подвижность исследовали путем микроскопирования при увеличении 1350 [ГОСТ 18963]. Культуральные свойства. Рост культур определяли на селективной среде Рогозы (жидкой и агаризованной) со значением рН среды равной 5.5.
Физиолого–биохимические свойства. Образование каталазы определяли по образованию пузырьков при обработке колоний МКБ на чашках 3% раствором перекиси водорода. Выявление дыхательных систем, содержащих цитохром, определяли бензидиновой реакцией. Один грамм бензидина солянокислого растворяли в 20 мл ледяной уксусной кислоты, добавляли 30 мл дистиллированной воды и медленно нагревали, после охлаждения вносили в него 50 мл 95 этилового спирта и хранили в холодильнике в течение месяца. Выросшие на чашке 24–28 часовые колонии бактерий заливали раствором солянокислого бензидина и по мере того как раствор пропитывал культуру в чашку прибавляли приблизительно такой же объем 5% Н2О2. В испытуемой бактериальной культуре, содержащей железо–порфириновые соединения, появляется голубовато–зеленая или ярко–голубая окраска, но молочнокислые бактерии такой краски не образуют.
Восстановление нитратов в нитриты. Для определения данного процесса молочнокислые бактерии, выросшие на жидкой среде MRS, культивировали в течение 6–7 суток при 37 С на среде ББЛ [Квасников Е.И. и соавт., 1975]. После инкубации каплю культуральной жидкости помещали на стекло и добавляли по капле реактивов 1 (содержит 2 г сульфаниловой кислоты в 250 мл 5 н. уксусной кислоты) и 2 (содержит 1.5 мл диметил––нафтиламина в 250 мл 5 н. уксусной кислоты). Розовый или красный цвет свидетельствует о наличии редуктазы.
Протеолитическая активность штаммов молочнокислых бактерий
Определение активности выделенных природных штаммов молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum RS3 и L. plantarum RS4 проводили в условиях полупроизводственного силосования растительной массы клевера лугового и козлятника восточного. Известно, что в процессе ферментации участвует сообщество, включающее две группы микроорганизмов, различающихся по характеру воздействия на растительный субстрат [McDonald P. et al., 1991; Merry R.J. et al., 2000]. Одни микроорганизмы (молочнокислые бактерии и дрожжи) интенсивно сбраживают растворимые углеводы, другие (в основном аммонифицирующие бактерии) метаболизируют азотсодержащие, в том числе белковые вещества. Характер их взаимоотношений варьирует от симбиотических до антагонистических, в зависимости от природы ферментируемого материала, воздушного и температурного режимов и других условий.
Количество и соотношение молочнокислой и сопутствующей микрофлоры исходной и силосуемой растительной массы относятся к решающим факторам, определяющим ход процесса консервирования. Поэтому микробиологический мониторинг брожения включал не только оценку развития молочнокислых бактерий, но также и характеристику изменения численности аэробных гетеротрофов, аммонификаторов и дрожжей.
Дифференцированный учет интродуцированных бактерий в консервируемой массе проводили с использованием их устойчивости к рифампицину (МКБ–RifR) (рис.13,14). Необходимо отметить, что приведенная маркировка используется в основном при оценке развития и роста внесенных микроорганизмов в изучаемый субстрат. Для подобной цели применяются, например, маркеры резистентности к рифампицину и стрептомицину, поскольку гены устойчивости к этим антибиотикам редко встречаются у молочнокислых бактерий [Tompson J.K. et al., 1997; Vilkova E. et al., 2012]. По мнению Льюин Б. [1987], введение маркера устойчивости к рифампицину – пример деликатного подхода, поскольку поведение RifR–штамма в физиологическом плане не отличается от исходного штамма.
Изменение величин численности спонтанных молочнокислых бактерий и интродуцированных штаммов МКБ–RifR при консервировании клевера представлены на Рисунке 15. В начале опыта величина численности эпифитной молочнокислой микрофлоры растительной массы клевера составляла 30.2106 КОЕ/г, интродуцированной МКБ–RifR – 1106 КОЕ/г (рис.15). Количество молочнокислых лактобацилл в контрольном варианте аналогично опытному равнялось 30.2106 КОЕ/г. 146
Максимальная численность сопутствующих молочнокислых бактерий была достигнута на десятые сутки консервирования во всех вариантах как опыта, так и в контроле. Для штамма Lactobacillus plantarum RS3 RifR величина этого показателя составляла 298106 КОЕ/г, L. plantarum RS4 RifR - 272106 КОЕ/г, L. plantarum BS933 RifR – 226106 КОЕ/г и Streptococcus faecium 500 RifR – 158106 КОЕ/г. В контроле на десятые сутки силосования количество молочнокислых бактерий составляло 195106 КОЕ/г.
Значения максимальной численности местной микрофлоры молочнокислых бактерий на десятые сутки в вариантах опыта со штаммами Lactobacillus plantarum RS3 RifR и L. plantarum RS4 RifR оказались более высокими по сравнению с приведенными показателями для штаммов L. plantarum BS933 RifR в 1.3 и 1.2 раза и Streptococcus faecium 500 RifR в 1.9 и 1.7 раза и контролем в 1.5 и 1.4 раза, соответственно (рис.15). В варианте с Lactobacillus plantarum BS933 RifR число спонтанных молочнокислых бактерий на десятые сутки консервирования оказалось в 1.2 раза выше по сравнению с контролем. В тоже время, в варианте опыта для Streptococcus faecium 500 RifR количество эпифитных молочнокислых бактерий через десять суток ферментации было в 1.2 раза ниже по сравнению с контролем (рис.15).
Наибольшая концентрация интродуцированных молочнокислых бактерий во всех вариантах с указанными штаммами приходилась на третьи сутки: Lactobacillus plantarum RS3 RifR – 180106 КОЕ/г, L. plantarum RS4 RifR – 172106 КОЕ/г, L. plantarum BS933 RifR – 204106 КОЕ/г и Streptococcus faecium 500 RifR – 92106 КОЕ/г (рис.15).
Необходимо подчеркнуть, что численность штаммов лактобацилл Lactobacillus plantarum RS3 RifR, L. plantarum RS4 RifR и L. plantarum BS933 RifR на третьи сутки консервирования заметно превосходила аналогичное значение штамма лактококка Streptococcus faecium 500 RifR (рис.15). Как показал анализ, в завершающей стадии ферментации клевера лугового (45 суток) количество интродуцированных молочнокислых бактерий штаммов
Характеристика зеленой массы, основные химические показатели и питательность люцернового силоса
Молочнокислые бактерии составляют гетерогенную группу бактерий, которые встречаются в различных экологических нишах, включая микрофлору кишечника человека, млекопитающих, эпифитную и ризосферную микрофлору растений [Van de Guchte M. et al., 2002]. Полагают, что группа этих микроорганизмов в процессе эволюции была глубоко взаимосвязана с растениями [Квасников Е.И. и соавт., 1975]. Известны положительные результаты применения культур МКБ при консервировании кормов, особенно трудносилосующихся [Зубрилин А.А., 1964; Квасников Е.И. соавт., 1975; Мак-Дональд П., 1985; Чуканов Н.К. и соавт., 1986; Бондарев В.А., 1996; Лаптев Г.Ю. и соавт., 2002; Шурхно Р.А. и соавт., 2006б, 2014, 2015а, 2015б; Хохрин С.Н., 2013; Driehuis F. et al., 2000].
Растительный белок считается наиболее дешевым. Применение растительного протеина в рационах животных является одним из основных и эффективных направлений. В связи с этим, при заготовке кормов бобовым культурам принадлежит решающая роль, поскольку они являются основными источниками белка. В составе бобовых трав содержится протеина в 1.5 3 раза больше, чем у злаковых. Белок бобовых кормовых трав полноценен по химическому составу и содержит значительное количество незаменимых аминокислот. Кроме того, бобовые при благоприятных условиях выращивания формируют экологически чистый протеин, в основном за счет фиксации атмосферного азота ризосферными микроорганизмами–симбионтами [Жеруков Б.Х. и соавт., 2003].
Поскольку, бобовые культуры обладают высокой кормовой ценностью поиск технологий сохранности питательных веществ этих культур и качества полученного корма после консервирования представляет собой чрезвычайно актуальную задачу. Одновременно продолжалось выполнение основной цели исследования, подбор из выделенных природных штаммов наиболее оптимальных лактобацилл (или их сочетания) с учетом индивидуальных признаков МКБ и специфики ферментируемой культуры, для создания в дальнейшим биологического консерванта с универсальными свойствами.
В качестве силосуемой культуры использовали клевер луговой (Trifolium pratense L.) сорт Ранний–2, обладающего высокими продуктивными качествами и способного решать проблему производства высокобелковых и дешевых кормов [Шурхно Р.А. и соавт., 2001; Надежкин С.Н. и соавт., 2006; Гибадуллина Ф.С., 2005б, 2007]. В процессе работы оценивали состав и питательность зеленой массы клевера лугового в фазе начала цветения. В этом эксперименте в качестве консерванта (с условным обозначением «Универсальная силосная закваска») (УСЗ) применялся биологический препарат, созданный на основе природного штамма Lactobacillus plantarum RS4 и выделенный из филосферы клевера лугового [Шурхно Р.А. и соавт., 2015а]. В этот период у клевера лугового величина обменной энергии составляла 2.14 МДж/кг. Количество сухого вещества в зеленой массе составляло 220 г/кг, сырого протеина, жира и клетчатки – 43.9, 8.0 и 61.1 г/кг, соответственно, растворимых углеводов – 14.2 г/кг, кальция и фосфора – 4.5 и 0.7 г/кг и каротина – 44.7 мг/кг (все значения приведены в натуральном состоянии).
В ходе исследования ставилась задача оценить влияние интродуцированного штамма молочнокислой бактерии на формирование состава и количества органических кислот, а также сохранность питательных веществ в процессе сенажирования клевера с добавлением патоки. Схема опыта включала следующие варианты консервирования: контрольный вариант (провяленная масса клевера без добавок) и опытные варианты ферментации с УСЗ (0.07 мл/кг) в чистом виде и совместно с патокой (40 г/кг). Известно, что добавление патоки или мелассы (продукт неполного кислотного или ферментативного гидролиза крахмала) увеличивает концентрацию сухих веществ и усиливает фунцкии МКБ по синтезу молочной кислоты, что вызывает снижение рН и позволяет ингибировать развитие нежелательной микрофлоры. Применение патоки целесообразно при сенажировании культур с низким содержанием водорастворимых углеводов, однако, ее необходимо использовать в относительно высоких дозах (около 40–50 г/кг и более) [Мак-Дональд П., 1985; Чуканов Н.К. и соавт., 1986]. Для сенажирования использовали провяленную растительную массу. Содержание сухого вещества в провяленной массе клевера составило 400 г/кг для контрольный варианта, 388 г/кг – Lactobacillus plantarum RS4 и 402 г/ кг – Lactobacillus plantarum RS4 + патока.
При использовании культур с высоким содержанием протеина и относительно низким содержанием сахара необходимо стимулировать развитие молочнокислых бактерий, обеспечивающих синтез лактата [Квасников Е.И. и соавт., 1975; М-Дональд П., 1985; Kung Jr.L., 1996]. Молочная кислота очень важна для процесса ферментации, так как она обладает высокой константой диссоциации (К=0.0138) по сравнению с уксусной (К=0.0018) и другими кислотами. Молочная кислота обладает сильным антимикробным действием и может являться достаточно перспективной альтернативой антибиотикам при кормлении животных. Лактат, будучи естественным метаболитом, бесследно ассимилируется в организме животного, принося ему пользу в виде дополнительной энергии, а также улучшает органолептические показатели консервированного корма [McDonald P. et. al., 1991; Клименко В.П. и соавт., 2013].