Содержание к диссертации
Введение
II. Литературный обзор 9
1. Введение .9
2. Сахарный диабет 1-го типа: причины возникновения и иммунологические аспекты развития 10
2.1. Экспериментальные модели для исследования СД1 11
2.1.1. Токсический диабет 11
2.1.2. Спонтанный диабет 12
2.2. Стадии развития диабета 1-го типа 12
2.2.1. Инсулиты 14
2.2.2. Медиаторы воспаления 15
2.2.3. Аутоантитела при диабете 1-го типа
2.3. Диагностика сахарного диабета 1-го типа 18
2.4. Дистальная полинейропатия 19
2.5. Нейрональные антитела при СД1 21
3. Структура и функции человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) 22
3.1. Окислительно-восстановительное состояние альбумина 23
3.2. Гликирование альбумина
3.2.1. Ранние продукты гликирования 26
3.2.2. Конечные продукты гликирования 27
3.3. Гликирование белков плазмы крови 29
3.3.1. Фибриноген 29
3.3.2. Коллаген 30
3.3.3. Ig G
3.4. Методы определения гликированного альбумина 31
3.5. Исследование гликированного альбумина
3.5.1. Влияние гликирования и окисления на структуру и свойства альбумина .34
3.5.2. Исследование сайтов связывания с глюкозой 37
III. Экспериментальная часть .39
1. Исследование альбумина in vitro и в сыворотке крови 39
2. Формирование групп пациентов с диагнозом СД1 43
3. Определение проинсулина в сыворотке крови детей с СД1 .45
4. Электромиографическое исследование (ЭМГ) 45
5. Определение аутоантител к нейрональным белкам в сыворотке детей с СД1 46
6. Экспериментальная модель диабета (СТЗ-крысы) .46
7. Статистическая обработка данных 47
IV. Результаты и обсуждение .47
1. Содержание проинсулина у детей с диабетом 1- го типа 47
2. Исследование гликированного альбумина in vitro 51
2.1. Окислительное гликирование альбумина in vitro 52
2.1.1. Определение содержания кетоамина, SH-групп и карбонильных групп в молекуле альбумина, инкубированного в присутствии физиологических концентраций глюкозы 52
2.1.2. Определение сайтов гликирования в альбумине, предварительно гидролизированном трипсином, методами MALDI –TOF и HPLC/MS/MS 54
2.1.3. Флуоресценция ЧСА и содержащегося в нём пентозидина 58
2.1.4. Анионообменная ВЭЖХ различных препаратов альбумина 61
2.2. Гликирование ЧСА в нефизиологических условиях 64
3. Определение гликированного альбумина в сыворотке крови .68
3.1. Подбор методик для выделения альбумина из сыворотки 68
3.2 Определение гликированного альбумина у детей с диабетом 1-го типа 74
4. Выявление дистальной полинейропатии у детей с диабетом 1-го типа
5. Определение аутоантител к нейрональным белкам у детей с диабетом 1-го типа .87
6. Определение нейрональных аутоантител у крыс с диабетом, вызванным стрептозотоцином .90
V. Заключение 94
VI. Выводы .96
Список опубликованных научных работ по теме диссертации 97
Благодарности 98
Литература
- Экспериментальные модели для исследования СД1
- Гликирование альбумина
- Определение проинсулина в сыворотке крови детей с СД1
- Определение содержания кетоамина, SH-групп и карбонильных групп в молекуле альбумина, инкубированного в присутствии физиологических концентраций глюкозы
Экспериментальные модели для исследования СД1
СД1 – аутоимунное заболевание, при котором под действием активированных (т. н. диабетогенных, т.е. направленных против поджелудочной железы) Т-лимфоцитов разрушаются -клетки в островках Лангерганса поджелудочной железы. В период разрушения -клеток заболевание протекает бессимптомно, а процесс этот может занимать несколько лет. Заболевание диагностируется, когда 90% -клеток уже разрушено, и появляются симптомы — потеря веса, жажда, полиурия, запах ацетона изо рта. Возможны также тяжелые состояния – кетоацидоз, кома. В качестве лечения назначается экзогенный инсулин. Причина возникновения аутоиммунной атаки неизвестна. Здесь играют роль совокупность как факторов окружающей среды, таких как вирусная инфекция, стресс, токсины, так и генетическая предрасположенность [5, 6]. Генетическим факторам придается большое, но не решающее значение в патогенезе СД1. Восприимчивость к СД1 ассоциирована c несколькими генами, расположенными в различных локусах. Наиболее выражено сцепление с генами главного комплекса гистосовместимости MHC класса II, в частности, с аллелями HLA-DR и HLA-DQ [7]. В группу высокого генетического риска попадают ближайшие родственники больных СД1, однако, чаще всего заболевают дети с неотягощенной наследственностью по СД1. В нашей практике из 260 детей с СД1 только 4 имели родственников с этим заболеванием. По литературным данным частота встречаемости СД1 у идентичных близнецов составляет 40% [8]. Следовательно, не-генетические факторы также играют важную роль в развитии болезни. Поиск «агента», который мог бы быть причиной аутоиммунной атаки затруднен тем, что между началом процесса и его последствиями – клиническими проявлениями – проходит много времени (месяцы или даже годы). К этому моменту «следы» агента могут быть потеряны.
Вирусам как причине возникновения СД1 в литературе уделено очень много внимания. В качестве кандидатов рассматриваются цитомегаловирус, ротавирус и другие [9-11], но наиболее вероятным называют вирус Коксаки B4 из семейства энтеровирусов [12-15]. Самое раннее предположение о связи вируса Коксаки и СД1 датируется 1969 годом. Такой вывод был сделан на основании данных о высоком титре антител к вирусу Коксаки у пациентов с впервые выявленным диабетом по сравнению со здоровыми донорами [16]. В дальнейшем теория была подтверждена более современным методом – ПЦР [17] и на животной модели [13]. Одним из подтверждений данного предположения является факт обнаружения вируса в клетках островков поджелудочной железы [15], [18]. Вирусная теория базируется на способности вирусов к молекулярной мимикрии [19]. Так, было обнаружено сходство в строении белковых эпитопов вирусов и белков -клеток – GAD и IA-2 [20].
Ещё одна пристально изучаемая теория возникновения диабета – нейрональная. Ведущие исследователи в этой области, учёные из Канады, опираются на сходство в строении нейрональной ткани и ткани эндокринной части поджелудочной железы, а именно оболочки, окружающей островок Лангерганса, состоящей из шванновских клеток. По этой теории, исследуемой на модельной системе СД1 – мышах со спонтанным диабетом (Non-obese diabetic, NOD-мыши,) шванновские клетки экспрессируют белки, имеющие нейрональную природу: S100, глиальный фибриллярный кислый белок (ГФКБ) и декарбоксилазу глутаминовой кислоты (GAD). Эти аутоантигены могут являться первичной мишенью для Т-лимфоцитов, разрушающих -клетки [21-23].
В качестве других потенциальных природных факторов рассматриваются бактерии, белки коровьего молока [24, 25], протеины пшеницы [26], недостаточность витамина D [27]. Впрочем, эти теории не получили особого распространения.
Животные модели широко используются для исследования диабета. Ранние опыты с панкреатэктомией у собак подтвердили главную роль поджелудочной железы в гомеостазе глюкозы, что привело к открытию инсулина. Сегодня большинство исследований проводится на грызунах. Нехирургические методы исследования основываются на введении токсинов – стрептозотоцина и аллоксана. Другая модель – врожденный диабет у мышей без ожирения – NOD-мыши. Модельные системы диабета позволяют исследовать осложнения, гестационный диабет, действие лекарственных препаратов, трансплантацию островковых клеток.
Токсический диабет основан на способности некоторых химических веществ вызывать селективную деструкцию панкреатических -клеток. Стрептозотоцин (рис. 1А) наиболее часто применяется для моделирования диабета 1-го типа у крыс. Это производное нитрозомочевины, был выделен из Streptomyces achromogenes, грамм-положительной бактерии, как антибиотик широкого спектра действия и противоопухолевый препарат. Стрептозотоцин является мощным алкилирующим агентом и благодаря своей структуре, схожей с молекулой глюкозы, транспортируется внутрь клетки, подавляет функцию глюкокиназы, вызывает множественные разрывы в цепи ДНК [28]. Однократное введение стрептозотоцина в большой дозе (70-80 мг/кг веса) или ввдение малых доз (40 мг/кг веса) в течение нескольких дней вызывает инсулинопению и диабет у крыс. На фоне токсического воздействия также имеет место аутоиммунная деструкция -клеток, приводящая к инсулитам [28].
Аллоксан (мезоксалипомочевина, эритровая кислота, 2,4,5,6-пиримидинэтетрон) – обладает способностью избирательно уничтожать -клетки, что используется для моделирования СД1 у грызунов. Аллоксан накапливается в -клетках посредством поглощения с помощью транспортера GLUT2 глюкозы и вызывает окисление ДНК и белков за счет образования активных форм кислорода. Действие свободных радикалов приводит к деструктивному процессу -клеток [29].
На моделях токсического диабета были зафиксированы признаки аутоиммунного диабета – гипоинсулинемия, гипергликемия, появление островковых аутоантител [30, 31] и характерные для диабета нейрональные нарушения [32-35].
Диабетические мыши без ожирения (NOD-мыши) также часто используются как модели с медленно развивающимся диабетом, имеющим сходство с диабетом 1-го типа человека.
NOD-мыши впервые были выведены для изучения катаракты. Они имеют полиморфизм в гене, который кодирует MHC II. В возрасте 4-5 недель у мышей развивается инсулит, а затем происходит субклиническая деструкция -клеток с образованием инсулитов, т.е. инфильтрации лимфоцитов в область островка. Клинический диабет развивается на 12-30 неделе. У NOD-мышей обнаруживаются аутоантитела к инсулину [36, 37] и к островковым клеткам [38] и развиваются нейропатии [39, 40].
Гликирование альбумина
Для получения гликированного ЧСА оба препарата (40 мг/мл) инкубировали с глюкозой (0, 5 и 50 мМ) в фосфатно-солевом буфере (1.47 мМ KH2PO4, 5.2 мМ Na2HPO4, 145 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, азид натрия 0,05%; рН 7.4) при 37 С. Аликвоты для отбирали после 1 и 3-х недель инкубации, предварительно каждую порцию диализовали против фосфатно-солевого буфера в течение 12 часов, три раза меняя буфер, чтобы удалить несвязавшуюся глюкозу. До исследования образцы хранили при -70 С.
Гликирование в нефизиологических условиях Для получения гликированного ЧСА белок (20 мг/мл) инкубировали с глюкозой 1,6 М и в отсутствие глюкозы в фосфатно-солевом буфере при 37 С в течение 3-х недель. ЧСА окисляли перманганатом калия (1 мМ, 72 ч.) при комнатной температуре. Определение количества белка, кетоамина, SH-групп и карбонильных групп. Кетоамин определяли с помощью колориметрического метода с применением ТНС по методу [136], количество SН-групп – по методу [187] с помощью реактива Эллмана (5,5 -дитиобис-(2-нитробензойной кислота)). Карбонильные производные определяли по методу [188] с помощью 2,4-динитрофенилгидразина. Количество белка определяли методом Бредфорда [189] и по оптической плотности при =280 нм. Коэффициент экстинции использовали =34445 М-1см-1. Оптическую плотность измеряли на планшетном ридере (Anthos 2010, Австрия) и на спектрофотометре «Carry» (США).
Спектр флуоресценции ЧСА и его гликированных форм определяли на флуориметре (Varian Cary Eclipse, США) при возбуждения =285, испускания =290-500 нм; концентрация белка во всех образцах была одинакова - 2 мг/мл. Флуоресценцию пентозидина измеряли при возбуждения=325; испускания =330-550 нм; концентрация белка составила 4 мг/мл. Образцы находились в фосфатно-солевом буфере, pH 7,4.
Разделение ЧСА с помощью ВЭЖХ. Ионообменную хроматографию альбумина проводили на хроматографе Varian (США) c анионообменной колонкой Mini Q 4.6/50 PE (GE Healthcare Швейцария) размером 4,6x50 мм. Размер частиц носителя полистерол/дивинил бензол 3 мкм. В качестве подвижной фазы А использовали буфер, содержащий 0,04 М фосфорной кислоты и 0,04 М уксусной кислоты в соотношении 1:1. До pH 6,4 доводили 25% аммиаком. Подвижная фаза В содержала этот буфер и 1 М NaCl. Градиент 1 М NaCl по буферу А: 1 мин. – 100%, 2 мин. – 99,5%, 3 мин. – 99,5%, 4 мин. – 95%, 6 мин – 95%, 6,5 мин. – 90 %, 8 мин. – 90%, 8,5 мин. – 80%, 9,5 мин. – 80%, 11 мин. – 50%, 11,5 мин. – 50%, 12,5 мин. – 0%, 14 мин. – 0%. Скорость потока 1,5 мл/мин. Белок регистрировали по флуоресценции при возбуждения = 285 нм и испускания = 340 нм и по поглощению при = 280 нм.
Электрофоретическое разделение сывороточных белков в агарозе проводили с помощью диагностического кита (Cormay gel protein 100, Польша) в течение 15 минут при 100V. Выделение альбумина из сыворотки крови с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ) проводили согласно методике Mashiba S. [136]. Для подбора оптимального соотношения сыворотки и ПЭГ смешивали 150 мкл сыворотки здорового донора и 15, 30 и 60 мг ПЭГ6000 (Sigma, США); затем центрифугировали при 2000 x g 15 минут на центрифуге (Hermle, Германия). Надосадочную жидкость анализировали методом электрофореза в агарозном геле.
Выделение альбумина из сыворотки крови с помощью ТХУ/спирта Метод выделения альбумина, описанный в статье Debro J.R. [190], основан на том, что растворимость альбумина практически во всех растворителях выше растворимости белков сыворотки. В связи с этим выделение альбумина проводят в условиях, когда прочие белки сыворотки образуют нерастворимый осадок, а альбумин остаётся в растворе. В статье предлагается выделять альбумин из 3 мл сыворотки крыс. Мы адаптировали эту методику под те объёмы сыворотки крови детей, которыми располагаем.
К 150 мкл сыворотки при постоянном помешивании добавляли по капле 450 мкл 1,5% трихлоруксусной кислоты (ТХУ) (Sigma, США) в 96% этаноле. Суспензию покачивали 30 мин при комнатной температуре и затем центрифугировали при 10 тыс. об./мин. при 4 С. Супернатант отделяли от осадка и к 400 мкл добавляли 400 мкл подвижной фазы А (см. выше) и 40 мкл 25% NH4OH для нейтрализации ТХУ. Затем выпаривали спирт на роторном испарителе (Eppendorf, Германия) до первоначального объёма 400 мкл (таким образом, заменяли спирт на подвижную фазу А и подготавливали образец для нанесения на ионообменную колонку)
Выделение альбумина из сыворотки крови с помощью голубого геля Для выделения ЧСА из сыворотки с помощью аффинной хроматографии на голубом геле (Affi gel blue, Bio Rad, США) использовали методику, предложенную производителями, с нашей модификацией. Перед нанесением образца 2 мл геля уравновешивали 4 мл 20 мМ фосфатного буфера (pH 7,2), сыворотку разбавляли в 2 раза тем же буфером и пропускали через гель 500 мкл, затем все белки, кроме альбумина, элюировали тем же буфером, содержавшим 0,2 и 0,4 М NaCl (по 2 мл каждый). Альбумин смывали 4 мл 20 мМ фосфатным буфером с 1,5 М NaCl. Далее образец диализовали, концентрировали с помощью ультрацентрифужных фильтров Amicon-Ultra 30 kDa (Merck Millipore, Германия) и определяли следующие показатели: количество белка, содержание кетоамина, содержание SH-групп в молекуле альбумина. Определение сайтов связывания в гликированном альбумине
В работе использовали 2,5- дигидроксибензойную кислоту (Bruker Daltonics, Германия), бикарбонат аммония (NH4HCO3), ТФУ, муравьиную кислоту, соли и другие реактивы (Sigma-Aldrich, США), свиной модифицированный трипсин (Promega, США).
Сайты гликирования определяли в образцах восстановленного и окисленного альбумина, инкубированных в присутствие 50 мМ глюкозы 3 недели при 37 С. Для данного исследования образцы альбумина подвергали гидролизу трипсином. К 5 мкл каждого образца добавляли 50 мкл 50 мМ бикарбонатного буфера, содержавшего 20 мкг/мл трипсина. Время реакции составляло от 15 мин до 24 часов. Реакции останавливали добавлением к реакционным смесям 20 мкл 7% (об./об.) ТФУ.
Для регистрации масс-спектров MALDIOF (времяпролетная матрично активированная лазерная десорбция/ионизация) в качестве матрицы использовали DHB, 10 мг/мл в 50% ацетонитриле и 0,3% ТФУ. 0,5 мкл полученных продуктов гидролиза смешивали с 0,5 мкл раствора матрицы, высушивали на воздухе и помещали в масс-спектрометр для регистрации спектров. Масс-спектры регистрировали на масс-спектрометре MALDIOF Bruker Ultraflex TOF/TOF II (Bruker Daltonics, ФРГ), оснащенном Nd:YAG- лазером (=337 нм), оборудованном системой задержки экстракции ионов Bruker PAN и аппаратурой для регистрации тандемных масс-спектров LIFT. Масс-спектры регистрировали в диапазоне m/z от 500 до 2000 с измерением положительных ионов в рефлекторном режиме с ускоряющим напряжением 25 кВ. Каждый спектр получали суммированием 500–1500 единичных спектров, регистрируемых после одного лазерного импульса. Пики автолиза трипсина и теоретически рассчитанные молекулярные массы пептидов альбумина использовали для внутренней калибровки полученных спектров, что обеспечило точность определения масс не хуже 20 мд. Для обработки и анализа полученных спектров использовали пакет программ Bruker FlexAnalysis (Bruker Daltonics, ФРГ).
Анализ аминокислотных последовательностей белков и расчет теоретических масс пептидов, образованных при гидролизе исходных белков трипсином, теоретических масс пептидов с возможными модификациями, обусловленными гликированием, а также масс b- и y-фрагментов отдельных пептидов проводили при помощи программы GPMAW (Lighthouse data, Дания). Идентификацию белков по массам пептидов - продуктов гидролиза трипсином - и по спектрам фрагментации отдельных пептидов проводили при помощи системы идентификации белков Mascot (MatrixSciense, Великобритания) и по базе данных NCBInr Национального центра биотехнологической информации США (NCBI). При поиске в базе данных в качестве специфической протеазы указывали трипсин и возможность неполного гидролиза (до трех основных остатков в пептидах). Конфигурация сервера Mascot была изменена и дополнена известными вариантами КПГ, модифицирующими лизин и аргинин (рис. 11). При работе с базой данных учитывалось до 7 модификаций, что вызвано ограничениями системы Mascot из-за вероятности получения ложноположительных результатов.
Определение проинсулина в сыворотке крови детей с СД1
Для более полной идентификации пиков I и II относящиеся к ним фракции были собраны отдельно и исследованы методом MALDIOF. Оказалось, что в обеих фракциях присутствует белок с м.м. 66439, т.е. пики относятся к мономеру альбумина. К сожалению, концентрация белка в обеих фракциях была недостаточна для оценки SH-групп.
Анализ ЧСА с различной степенью гликирования методом анионообменной ВЭЖХ Для оценки влияния гликирования ЧСА на его тиоловый статус методом ионообменной хроматографии исследовали два препарата белка, содержащих разное количество кетоамина. Для этого оксиальбумин (20 мг/мл) инкубировали в условиях гипергликемии и при нефизиологических концентрациях глюкозы - 50 мМ и 1,6 М 3 недели при 37 С. После инкубации реакционную смесь диализовали и определяли содержание кетоамина, количество сульфгидрильных и карбонильных групп. Установили, что препараты содержали кетоамин в количестве 1,5 М и 20 М на моль белка соответственно; по 0,4 М SH-групп и по 0,5 М карбонильных групп. Из хроматограмм, представленых на рисунке 24, видно, что увеличение содержания кетоамина в молекуле белка приводит к увеличению площади пика, который соотносится с окисленной формой (пик II), в то время как содержание SH-групп остаётся неизменным.
Как уже отмечалось выше, гликирование протекает в основном по боковым NH2 группам остатков лизина и аргинина. Присоединение гидрофильного остатка глюкозы приводит к изменению гидрофобно-гидрофильного баланса белка и к уменьшению числа положительных зарядов. Это влияет на скорость прохождения через анионобменную колонку. Следовательно, метод анионообменной хроматографии разделяет не только белок с различным содержанием сульфогрупп, но и зарядов на молекуле, обусловленных наличием свободных боковых групп аминокислот.
Отношение площадей пиков I и II Итак, полученные с помощью анионообменной хроматографии пики I и II отражают окислительно-гликированный статус альбумина, причём пик I отвечает за «нормальную» форму альбумина, а пик II – за «изменённую». Исходя из этого, можно предположить, что коэффициент отношения площадей пиков (AreaI/AreaII, или AI/AII) можно рассматривать как параметр, отражающий глико-окислительное состояние альбумина (рис. 25). Числовые значения коэффициента АI/АII приведены в подписи к рисунку.
Итак, из рисунка 25 видно, что для меркаптоальбумина, содержащего нормальные количества кетоамина и SH-групп, коэффициент AI/AII имеет самое высокое значение – 4,70, а для супероксиальбумина и альбумина, инкубированного с глюкозой 1,6 М – самые низкие – 0,5 и 0,06 соответственно. Причём, первый содержит нормальное количество кетоамина и очень низкое – SH-групп, а второй – нефизиологическое количество кетоамина (20 М/М) и количество SH-групп, возможное при окислительном стрессе. Таким образом, коэффициент AI/AII сообщает информацию об «общем» состоянии альбумина, подверженного как окислению, так и гликированию. В перспективе это направление может быть предложено для клинических исследований с целью оценки глико-окислительного состояния альбумина сыворотки крови, поэтому представляется интересным выяснить референсные значения коэффициента.
Для того чтобы наглядно продемонстрировать, как изменяются молекулярная масса ЧСА и содержание кетоамина в результате гликирования, было изучено взаимодействие белка с глюкозой при нефизиологических концентрациях (1,6 М) при 37 С в течение 1, 3 и 5 недель. Контрольный ЧСА инкубировался без глюкозы. После инкубации реакционную смесь диализовали, анализировали методом электрофореза в агарозном геле и в ПААГ в денатурирующих условиях, определяли размер масс-иона (m+/z) белка методом MALDIOF и содержание кетоамина c помощью ТНС; флуоресценцию альбумина измеряли при возбуждения =285, испускания =290-500 нм, пентозидина при возбуждения=325; испускания =330-550 нм.
На масс-спектре ЧСА, приведённом на рисунке 26 присутствует основной пик мономера альбумина с зарядом +1 (m+/z 66 405) и два дополнительных пика белка, на молекуле которого заряд равен +2 и +3 (m+/z 33 203 и m+/z 22 077 соответственно). Рисунок 26. Масс-спектры оксиальбумина (1) и ЧСА, инкубированного с 1,6 M глюкозой в течение одной недели (2) , трех недель (3) и пяти недель (4). Изменение молекулярной массы белка относительно содержания кетоамина продемонстрировано на рисунке 27. Рисунок 27. Изменение молекулярной массы гликированного ЧСА (1) и контрольного ЧСА (3) и изменение количества кетоамина (2) в зависимости от продолжительности инкубации с глюкозой (указаны значения масс-иона, m+/z и кетоамина, М/М). При инкубации белка в присутствии 1,6 М глюкозы в течение трёх недель молекулярная масса белка увеличивается до 71 570 Да, т.е. более, чем на 5000 Да, а содержание кетоамина возрастает до 55 молекул на молекулу белка, т.е. в реакции гликирования задействованы практически все остатки лизина (рис. 27).
Для образца, инкубированного с глюкозой 3 недели, был получен спектр при большом расширении. Результат представлен на рисунке 28. Видно, что спектр представляет из себя совокупность нескольких близко расположенных масс-ионов, мало отличающихся по величине, т.е., образец содержит смесь различных продуктов реакции.
Далее образцы реакционной смеси были изучены методом электрофореза в агарозе и в ПААГ. На представленных электрофореграммах (рис. 29) видно, что масса белка, который инкубировался при высокой концентрации глюкозы, увеличивается по сравнению с исходным и контрольным белками. инкубированный без глюкозы 5 недель; 7 - ЧСА, инкубированный с 1,6 М глюкозой 5 недель. На представленных электрофореграммах видно, как по сравнению с исходным и контрольным белками увеличивается масса белка, который инкубировался при высокой концентрации глюкозы. В случае с электрофорезом в агарозном геле можно ещё судить об изменении свойств альбумина – в сильно гликированном альбумине преобладают отрицательные заряды, поскольку при pH 8.0 (pH электрофоретического буфера, в котором происходит разделение) этот альбумин быстрее приближается к катиону.
Как уже отмечалось ранее, введение большого числа гидрофильных остатков глюкозы в молекулу белка во-первых, должно снижать положительный заряд его молекулы, и во-вторых, изменять гидрофильно-гидрофобный баланс белка, что в свою очередь должно влиять на его структурную организацию. Поэтому далее исследовали спектры флуоресценции альбумина и содержащегося в нём пентозидина. Результаты представленны на рисунке 30.
Определение содержания кетоамина, SH-групп и карбонильных групп в молекуле альбумина, инкубированного в присутствии физиологических концентраций глюкозы
Рассматривая нейрональные аутоантитела как ранние диагностические маркеры для выявления структурных нарушений периферических нервов, необходимо оценить, насколько рано они появляются во времени и насколько специфически отражают исследуемое нарушение. Для этой цели мы использовали экспериментальную модель диабета, вызываемого у крыс введением стептозотоцина (СТЗ).
Диабетические СТЗ-крысы широко используются для изучения структурных и функциональных нарушений в центральной и периферической нервной системе при СД1. Несколькими авторами на этой модели было показано, что на ранних сроках развития диабета (в течение 3-7 дней после введения СТЗ) у крыс были отмечены такие нарушения в ЦНС как снижение содержания ГФКБ в астроцитах спинного мозга, гиппокампа и мозжечка [34, 35, 208, 209]. При длительном течении заболевания (2 месяца и более) наблюдались признаки нейродегенеративных процессов в периферической нервной системе. Так, спустя 2 месяца после начала моделирования диабета было обнаружено снижение количества ФРН в седалищном нерве [33, 209] и наличие электронейрофизиологических и морфомерических признаков ДПН [210, 211] у СТЗ-крыс.
Целью данного этапа работы было исследовать динамику появления аутоантител к нейроспецифическим белкам S100, ГФКБ, ОБМ и ФРН в сыворотке крови крыс после введения СТЗ. Так как нас интересовало раннее появление этих антител – возможно, одновременно с развитием диабета, то в задачу также входило оценить уровень нейро АТ относительно скорости разрушения -клеток. В качестве показателя аутоиммунного разрушения -клеток были выбраны аутоантитела к инсулину.
В работе использовали самцов крыс линии Wistar. У животных из опытной группы (10 животных) был вызван диабет введением 80 мг/кг веса СТЗ. Контрольная группа (10 животных) получала 0,5 мл физиологического раствора. Кровь отбирали из хвостовой вены до и после инъекций на 5, 10, 17, 25 и 32 дни. На следующий день после введения СТЗ у животных опытной группы развилась гипергликемия (25-30 ммоль/л глюкозы), которая сохранялась на протяжении всего эксперимента (30 дней), в то время как у животных в контрольной группе содержание глюкозы оставалось в норме на уровне 5-7 ммоль/л (рис. 47).
В сыворотке крови крыс обеих групп методом ИФА определяли уровень аАТ к инсулину и к четырём нейрональным белкам, который рассчитывался в условных единицах (у.е.). Для каждого животного в различные временные точки было рассчитано отношение оптической плотности образца к оптической плотности пробы, взятой до инъекции (начальная проба «0») (ОПобразца/ОП«0»). Затем для каждой группы были рассчитаны средние значения содержания каждого аАТ.
Определение уровня аАТ к инсулину. При определении уровня аАТ к инсулину установили, что по сравнению с начальной пробой, в контрольной группе он не изменялся (по критерию Уилкоксона) (p 0,05), а в опытной группе достоверно увеличивался на пятый день после введения СТЗ и сохранялся на таком уровне до 20-го дня эксперимента (p 0,05). Длительное повышение уровня аАТ к инсулину можно обьяснить распадом -клеток и накоплением в кровотоке инсулина, что инициирует образование к нему антител. При сравнении опытной и контрольной групп по U-критерию Манна-Уитни оказалось, что достоверное повышение аАТ к инсулину наблюдалось на 5-ый и на 10-ый дни (p=0,015 и p=0,019 соответственно) (рис. 48). Определение уровня аАТ к нейрональным белкам. При сравнении уровня нейрональных антител с их уровнем в начальной пробе по критерию Уилкоксона установили, что в опытной группе содержание аАТ ко всем четырём нейрональным белкам достоверно возрастало на 5, 10, 17, 25 и 32 дни (для каждого значения p 0,05), а в контрольной группе оставалось без изменений (для каждого значения p 0,05). Сравнение уровней аАТ в опытной и контрольной группах по U-критерию Манна-Уитни показало, что в опытной группе достоверно увеличивается содержание антител к белкам ГФКБ и ФРН на 5-ый день после индуцирования диабета (p=0.0041 и p=0,017 соответственно) (рис. 49 А и Б). В содержании аАТ к белкам S100 и ОБМ в опытной группе достоверных изменений по сравнению с контрольной группой не обнаружено (рис. 49 В и Г ).
Различные нейрональные белки имеют специфическую локализацию в клетках нервной ткани, и их повышенная концентрация в биологических жидкостях является маркером соответствующего повреждения. Так, ГФКБ является компонентом астроцитов, ФРН – нейротрофический белок, который содержится в нейронах центральной и периферической нервной системы, S100 находится преимущественно в глиальных клетках мозга и периферических нервах, ОБМ является одним из основных белков миелиновой оболочки и содержится в олигодендроцитах, астроцитах, шванновских клетках. Появление аАТ к белкам нервной ткани в крови свидетельствует о том, что целостность нервных волокон была нарушена, нейрональные белки (в данном случае – ГФКБ, ОБМ, ФРН и S100) поступили в кровеносное русло и вызвали иммунологическую реакцию. Повышенное содержание нейроспецифических белков и аАТ к ним в крови наблюдалось при травмах мозга, рассеянном склерозе в стадии обострения и ишемических инсультах [212]. ГФКБ и НСЕ появлялись в крови уже на 1-е сутки после ишемического инсульта [213], а аАТ к белкам S100, ГФКБ и ФРН у пациентов с острым нарушением мозгового кровообращения, наблюдали на 5-ый день после инцендента [214]. В экспериментах, моделирующих повреждения головного мозга (окклюзия средней мозговой артерии, вызывающая ишемический инсульт) пиковые концентрации нейрональных белков в сыворотке крови крыс приходились на 1-ые и 14-ые сутки эксперимента, при этом повышение уровня маркеров повреждения нейронов (НСЕ) и глии (ОБМ и ГФКБ) происходило одновременно [212].
При изучении механизмов развития сахарного диабета 1-го типа в организме человека до настоящего времени не было проведено систематических исследований уровня нейроспецифичных белков и аАТ к ним. Только в отдельных исследованиях было показано изменение содержания некоторых нейротропных факторов [82], нейроспецифичных белков (NSE, S100) и аАТ к ним [83], а также аАТ к ОБМ [215]. На модели экспериментального диабета, индуцированного введением крысам СТЗ, было показано, что наряду с нарушениями функций поджелудочной железы (гипергликемия, гипоинсулинемия, наличие специфических островковых антител) уже в первую неделю заболевания наблюдаются также функционально-структурные изменения в ЦНС [34], но исследования уровня нейрональных антител в этих условиях не проводились.
В наших исследованиях на модели экспериментального диабета впервые было установлено одновременное повышение аАТ к инсулину и к нейрональным белкам. Это может свидетельствовать том, что два патогенетических процесса – гибель -клеток и клеток нервной системы – идут одновременно и, следовательно, нейро аАТ можно рассматривать в качестве предвестников развития ДПН.