Введение к работе
Актуальность проблемы. В последнее время все большее внимание уделяется развитию методов выращивания большого количества клеток с высокой их концентрацией в аппаратах с управляемыми условиями культивирования, поскольку применение традиционных методов выращивания поверхностно-зависимых клеток в матрасах и роллерных бутылях не отвечает в полной мере современным требованиям, предъявляемым к производству клеточных культур, вирусов и качеству биопрепаратов. Недостатками этих методов являются неконтролируемые условия роста клеток и размножения вирусов, возрастающий риск контаминации при масштабировании, высокая трудоемкость и низкая экономичность технологии. Оптимизация методов культивирования клеток приобретает огромное значение при производстве вирусных вакцин, а также при исследовании малоизученных высокопатогенных вирусов, повышая эффективность и безопасность работы.
Особое место в ряду таких вирусов занимает вирус Эбола, выделенный в 1976 году и вместе с ранее открытым вирусом Марбург отнесенный к семейству Filoviridae. Вирус Эбола является одним из самых патогенных для человека и во время периодически возникающих вспышек вызывает тяжело протекающую геморрагическую лихорадку с крайне высоким уровнем летальности (77-88 %). Последняя эпидемия разразилась в мае прошлого года в Заире, а также, по сообщениям ВОЗ, вспышка лихорадки Эбола зарегистрирована в феврале сего года в Габоне. Хотя лихорадка, вызываемая этим вобудителем, эндемична для
некоторых районов центральной Африки, развитие туризма и расширение экономических связей делают эту инфекцию потенциально опасной для территорий других стран. До настоящего времени естественный резервуар и пути распространения вируса в природе неизвестны, однако показано, что его случайными хозяевами могут быть обезьяны и человек, средства специфической профилактики и терапии отсутствуют. Известно, что из экспериментальных животных к вирусу Эбола чувствительны лишь обезьяны, морские свинки и мыши-сосунки.
По названным причинам разработка диагностических препаратов и средств иммунопрофилактики данного вирусного заболевания приобретает особую остроту и актуальность. В свою очередь, решение этих задач требует наработки большого количества вируса, и, следовательно, - создания эффективного и достаточно безопасного способа культивирования вируса Эбола. Поэтому поиск наиболее чувствительной и продуктивной клеточной модели, а также разработка соответствующей системы культивирования и ее применения для создания иммунодиагностических препаратов являются сегодня острой проблемой.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы является подбор наиболее чувствительной клеточной модели и разработка научных основ технологии препаративного, эффективного и достаточно безопасного производства вируссодер-жащей культуральной жидкости для изучения возможности приготовления инактивированных вакцин, создания средств иммунодиагностики и профилактики, а также молекулярно-биологических исследований. В соответствии с целью исследо-2
вания были поставлены следующие задачи:
-
провести анализ чувствительности клеточных культур к вирусу Эбола в стационарном монослое;
-
изучить характеристики и провести экспериментальную оценку методов крупномасштабного культивирования чувствительных клеток;
-
изучить факторы, влияющие на выход клеток при крупномасштабном культивировании;
4) провести электронно-микроскопический анализ вирусных
препаратов, полученных при культивировании вируса Эбола в
клеточных культурах.
Научная новизна. В результате проведенных исследований отработан метод культивирования ряда линий клеток на микроносителях как наиболее перспективный для получения препаративных количеств вируса Эбола, определены наиболее важные факторы, влияющие на результаты культивирования клеток на микроносителях, осуществлен контроль качества микроносителей различного типа, проведена оценка чувствительности 13 различных культур клеток к вирусу Эбола; впервые проведено накопление вируса Эбола в системе культивирования клеток с использованием микроносителей в качестве подложки для клеток и показано, что титры вируса Эбола, полученные с использованием данного метода, превосходят соответствующие показатели вирусных препаратов, полученных традиционным способом. Впервые осуществлен процесс препаративного накопления вируса Эбола в 2-литровом ферментере с использованием микроносителей путем 5 последовательных пассажей отъемно-
доливным методом. Проведенное электронно-микроскопическое исследование, а также анализ очищенных вирусных препаратов методом электрофореза белков в полиакриламидном геле показали, что при описанном способе культивирования вируса в клетках, являющихся дериватами тканей обезьян, достигается накопление его препаративных количеств. При этом последовательное пассирование вируса не приводит к снижению продукции и изменению морфологии вирионов на протяжении пяти пассажей.
Практическая значимость работы. Проведенное исследование показало, что способ крупномасштабного культивирования клеток на микроносителях является эффективной системой для накопления вируса Эбола. Метод позволяет получать в препаративных количествах РНК и белки вируса Эбола при значительном сокращении сроков, трудоемкости и опасности работ (Патент 6С12 N 7/00 «Способ суспензионного культивирования филовиру-сов в клеточных культурах на микроносителях», приоритет от 21.10.1993, решение о выдаче 14.04.95, авторы В.Я.Тихонов и А.Н.Котов). Эти данные, а также результаты исследования факторов, влияющих на рост клеток в системе крупномасштабного культивирования на микроносителях, могут быть использованы для получения препаратов других вирусов, относящихся к группе особо-опасных (например, аренавирусов - А.с. N 246733, авторы Г.А.Ерошкина и А.Н.Котов), а также при организации современного производства других необходимых вирусных препаратов и различных биологически активных веществ. Необходимое для этого подробное описание процесса выращива-4
ния клеток изложено в лабораторном регламенте Л.Р. 123.010-88 «Культивирование клеток линии Vero на микроносителях Цитодекс в 2-х и 12-литровом ферментерах».
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены: 1) на Второй отраслевой конференции молодых ученых «Актуальные проблемы биотехнологии», пос.Кольцове Новосибирской обл., 25-27 апреля 1990. 2) на межведомственной конференции «Изучение и профилактика особо опасных вирусных инфекций», пос.Кольцове, Новосибирской обл., 7-8 апреля 1993. 3) на VII Международной конференции по сравнительной и прикладной вирусологии, Монреаль, Канада, 12-17 октября 1994.
Апробация работы состоялась на заседании научного семинара НИИ молекулярной биологии НПО «Вектор» 20 декабря 1995г.
По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, получен 1 патент и 1 авторское свидетельство.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения и трех глав: обзора литературы (глава 1), материалов и методов (глава 2), результатов и обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка цитируемой литературы (186 ссылок). Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, включая 27 рисунков и 17 таблиц.
Основные результаты, изложенные в диссертации, получены при непосредственной помощи и в соавторстве с сотрудниками ГНЦ ВБ «Вектор»: В.Я.Тихоновым,
к.б.н. А.А.ЦаревойI, к.м.н. Ю.И.Рассадкиным, к.б.н. Е.И.Ряб-
чиковой, к.б.н. В.Е.Волчковым, В.В.Шапровым, В.К.Ткачевым, А.А.Гражданцевой, Ю.П.Чуевым, Н.Д.Юрченко.