Содержание к диссертации
Введение
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
2.1. Биоконверсия 9( 11 )-дегидро-3-кетостероидов 10
2.2. Микробиологическое 1(2)-дегидрирование 3-кетостероидов 13
2.2.1. Распространенность 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназной (3-КСД) 13 активности среди микроорганизмов
2.2.2. Свойства 3-КСД 14
2.2.3. Сходство строения и механизма действия 3-КСД и других дегидрогеназ 18
2.2.4. Механизм 1 (2)-дегидрирования 3-кетостероидов на примере 3-КСД 19 Nocardia corallina
2.2.5. Субстратная специфичность 3-КСД 20
2.2.6. Локализация 3-КСД 22
2.2.7. Связь 3-КСД с другими ферментными системами клетки 22
2.3. Реклассификация штаммов рода Arthrobacier 25
2.3.1. Современная систематика микроорганизмов 25
2.3.2. Признаки, используемые для классификации и идентификации актиномицетов 26
2.3.3 Переописание штаммов, ранее отнесенных к роду Arthrobacier 28
2.4 Биоконверсия труднорастворимых субстратов 30
2.4.1. Конверсия стероидных субстратов в микрокристаллической форме 30
2.4.2. Использование специальных реакторов для биоконверсии 30
2.4.3. Использование органических растворителей 31
2.4.4. Использование полимеров 33
2.4.5. Использование циклодекстринов и их производных 33
2.5. Культивирование микроорганизмов 39
2.5.1 Режим с периодической подпиткой 39
2.5.2. Варианты стратегии управлением режима с подпиткой 40
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 42
3.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 42
3.1.1. Реактивы 42
3.1.2. Микроорганизмы и методы их культивирования 42
3.1.2.1. Штаммы, использованные в работе 42
3.1.2.2 Среды для выращивания микроорганизмов 42
3.1.2.3. Условия культивирования "Arthrobacter globiformis 193" 43
3.1.2.4. Фракционирование (получение ЦПМ) 44
3.1.2.5. Трансформация стероидных субстратов 44
3.1.3. Микроскопия 45
3.1.3.1. Электронная микроскопия 45
3.1.3.2. Световая микроскопия 45
3.1.4. Аналитические методы 46
3.1.4.1. Анализ продуктов трансформации 46
3.1.4.2. Масс-спектрометрический анализ 48
3.1.4.3. ЯМР-спектрометрия 48
3.1.4.4. Определение концентрации белка 48
3.1.4.5. Определение растворимости стероидов 48
3.1.5. Таксономические методы 49
3.1.5.1. Определение чувствительности к антибактериальным препаратам 49
3.1.5.2. Определение способности утилизировать сахаро-спирты в качестве динственного источника углерода 49
3.1.5.3. Определение гидролазной активности 49
3.1.6. Определение основных хемотаксономических признаков 50
3.1.6.1. Очищенные препараты клеточных стенок 50
3.1.6.2. Определение изомера диаминопимелиновой кислоты 50
3.1.6.3. Определение аминокислотного состава полученных препаратов пептидогликанов 50
3.1.6.4. Полуколичественное определение менахинонов 51
3.1.6.5. Состав жирных кислот 51
3.1.7. Определение последовательности гена 16S рРНК 51
3.1.8. Филогенетический анализ 51
3.2 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 53
3.2.1. Ре-идентификация штамма "Arthrobacter globiformis 193" 53
3.2.2. Биоконверсия ацетилированных 9(11 )-дегидро-3-кетостероидов 59
3.2.2.1. Конверсия прегна-4,9(11 )-диен-17сс,21-диол-3,20-диона 59
3.2.2.2. Конверсия 21 -ацетата прегна-4,9( 11 )-диен-17сс,21 -диол-3,20-диона 65
3.2.2.3. Конверсия 17а,21-диацетатапрегна-4,9(11)-диен-17ос,21-диол-3,20-диона 77
3.2.2.4. Конверсия 21-ацетокси-прегна-4,9(11),16(17)-триен-3,20-диона 96
3.2.3. Выращивание уплотнённой культуры N. simplex ВКМ Ас-2033Д 114
4. ВЫВОДЫ 129
5. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 130
- Биоконверсия 9( 11 )-дегидро-3-кетостероидов
- Микробиологическое 1(2)-дегидрирование 3-кетостероидов
- Реактивы
Биоконверсия 9( 11 )-дегидро-3-кетостероидов
Биоконверсия гидрокортизона в преднизолон является процессом, известным еще с середины 50-х годов. На основе микробиологического 1(2)-дегидрирования гидрокортизона создана промышленная технология получения преднизолона - ценного лекарственного препарата. Рассматривая микробиологическое 1(2)-дегидрирование как важный этап в синтезе глюкокортикоидов, следует отметить, что двойная связь между С1 и С2 традиционно вводилась на начальных (в соединения типа I на рис. 1) или на конечных (в соединения типа II и III на рис. 1) этапах синтеза в соединения ряда прегнана (Bork, 1968).
Долгое время кортизон, его 21-ацетат и гидрокортизон доминировали как субстраты биоконверсии при получении 1(2)-дегидрированных стероидов. кортизон (21-ацетат) гидрокортизон
Сведения о методах синтеза кортикостероидов из предшественников ряда андростана, полученных путем биоконверсии стеринов, появились позже (Shephard et al., 1977; Wovcha and Merle, 1977). В этих и других работах сообщалось о важности использования интермедиатов с 9(11)-двойной связью, в синтезе глюкокортикоидов с высокой физиологической активностью В настоящее время для синтеза галогензамещенных кортикостероидов большой практический интерес в качестве интермедиатов представляют 1(2)-дегидро-3-кетостероиды с двойными связями в положениях 9(11), 16(17), а также 16а,17а-эпоксипроизводные и производные с 17а-ОН-группой, и их ацетил и ро ванные производные (Турута с соавт., 1992). Наличие в них 9(11)-двойной связи облегчает последующее галогенирование в положении 9а (рис. 3), а ацетилирование по положениям 21 или 17,21 обеспечивает защиту соответствующих функциональных групп.
Введение функциональных заместителей и двойных связей в молекулу стероидов может приводить к изменению физико-химических свойств и терапевтического эффекта получаемых кортикостероидов, а также влиять на их трансформацию микроорганизмами. Так, введение дополнительной метильной группы в молекулу гидрокортизона (рис. 4) привело к значительному осложнению процесса 1 (2)-дегидрирования A. globiformis 193. Если 1 (2)-дегидрирование гидрокортизона клетками A. globiformis 193 описывалось уравнением Михаэлис-Ментен, то дегидрирование ба-метилгидрокортизона подчинялось кинетике субстратного ингибирования. Создание математической модели процесса позволило определить тип ингибирования как множественное бесконкурентное ингибирование субстратом (Аринбасарова с соавт., 1995), который является частным случаем бесконкурентного ингибирования (Todhunter, 1979). При низкой концентрации субстрата (менее 1.6 мМ или 0.6 г/л) эффект ингибирования практически не имел места, реакция описывалась кинетикой Михаэлис-Ментен и контролировалась фермент-субстратным взаимодействием. При концентрации субстрата выше 1.6 мМ или 0.6 г/л проявлялось ингибирование на уровне дыхательной цепи, что описывалось кинетическими параметрами математической модели.
Известно, что 1 (2)-дегидрирование 9(11)-дегидро-3-кетостероидов может сопровождаться спонтанной ароматизацией кольца А. В работах, посвященных получению химическим путем структур 1,4,9(11)-прегнатриенов, их выход варьировал от 11 до 63% (Cirilo et al., 1993; Castro and Ruiz, 1994-1995).
О возможности биоконверсии ацетилированных 9( 11 )-дегидростероидов имеются немногочисленные литературные данные. Авторы при этом сообщали о трудностях, связанных с деструктивной активностью культуры Arthrobacter simplex (=Corynebacterium simplex) в отношении образовывавшихся 1(2)-дегидроаналогов, что приводило к снижению содержания стероидов в среде трансформации и вызывало необходимость поиска подходов к элиминированию деструкции (Wolf and Kominek, 1984; Kominek and Wolf, 1985).
В связи с вышеизложенным большой интерес представляло изучение возможности введения 1(2)-двойной связи в производные 9(11)-дегидро-3-кетостероидов культурой «Arthrobacter globiformis 193».
Микробиологическое 1(2)-дегидрирование 3-кетостероидов
Впервые микробиологическое 1(2)-дегидрирование было осуществлено на практике с помощью клеток бактерий Streptomyces lavendulae и Cylindrocarpon radicicola (Fried and Thoma, 1956) и гриба Fusarium solani (Vischer and Wettstein, 1958).
С тех пор, 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназная активность была установлена для широкого ряда микроорганизмов различного таксономического положения: Pseudomonas spp. (Levy, Talalay, 1959), Nocardia restrictus (Sih and Bennett, 1962), Mycobacterium smegmatis и M. lacticola (Charney and Herzog, 1967), Corynebactehum simplex ( Arthrobacter simplex) (Penasse, Peyre, 1968), Bacillus sphaericus (Ringold et al., 1963) и В. cyclooxidans (Bork et al., 1968), Seplomixa affmis (Kominek, 1973), Bacillus cereus (El-Refai et al., 1976), M. fortuitum (Wovcha et al., 1979), Bacterium cyclooxidans ATCC 12673 (Kominek, Wolf, 1985), N. opaca (Deppmeyer, 1982) и N. corallina (Itagaki et al., 1990), Rhrodococcus erythropolis IMET 7030 (Atrat et al., 1980) и R. erythropolis SQ1 (van der Geize et al., 2000). Среди перечисленных организмов благодаря наличию высокой 1 (2)-дегидрогеназной активности как научный, так и практический интерес представляют микобактерии, артробактеры, коринебактерии, псевдомонады. При этом максимальный уровень 3-КСД активности был отмечен для Arthrobacter simplex (=Corynebacterium simplex) (Sebek and Perlman, 1979) и Arthrobacter globiformis 193
(=Mycobacterium sp 193) (Красильникова с соавт., 1959). Так, Arlhrobacter simplex уже более 30 лет используют для 1(2)-дегидрирования соединений как прегнанового, так и андростанового ряда, а также различных производных стеринов и желчных кислот (Nobile et al., 1955; Bernstein et al., 1956; Vischer and Wettstein, 1958; Catroux et al., 1968; Ryu etal., 1971).
Ферментом, ответственным за 1(2)-дегидрирование стероидов с З-кето-4-ен-структурой, является 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназа (3-КСД) [4-ен-З-оксо-стероид: (акцептор)-1-ен-оксидоредуктаза; КФ 1.3.99.4]. 3-КСД была выделена и охарактеризована для многих бактериальных культур: Arlhrobacter simplex (Penasse and Peyre, 1968; Molnar et al., 1995), Pseudomonas spp. (Levy and Talalay, 1959) и P. testosteroni ATCC 17410 (Plesiat et al., 1991), Nocardia restrictus (Sih and Bennet, 1962), N. opaca (Drobni6 et al., 1993) и N. corallina (Itagaki et al., 1990), Mycobacterium fortuitum (Wovcha et al., 1979), Rhodococcus erythropolis IMET 7030 (Wagner et al., 1992) и R. erythropolis SQ1 (van der Geize et al., 2000).
3-КСД из Nocardia corallina является мономерным белком, имеющим молекулярный вес порядка 60,500D. Изоэлектрическая точка фермента составляет около 3 единиц. Он содержит 1 моль флавин-аденин-динуклеотида (ФАД) на 1 моль белка и имеет типичный спектр флавопротеиновой адсорбции с максимумом при 458, 362 и 268 нм. Фермент стабилен в отсутствие кофакторов и катализирует 1(2)-дегидрирование Д4-3-кетостероидов в присутствии ФМС, который действует в качестве акцептора электронов. Феррицианид калия и цитохром с не могут служить акцепторами электронов для очищенной формы фермента. 1(2)-Дегидрирование ферментом 3-КСД стимулируется также молекулярным кислородом со стехиометрической продукцией перекиси водорода и Д 4-3-кетостероидов. Оптимум рН с использованием ФМС приходится на 10 и колеблется от 8.5 до 10 единиц в оксидазной реакции. Фермент способен окислять широкий ряд 3-кетостероидов, но не Зр-гидроксистероиды (Itagaki et al., 1990).
Флавиновая природа простетической группы 3-КСД впервые была установлена в 1962 году для культуры Nocardia restrictus (Sih and Bennett, 1962). Позднее было показано наличие флавинсодержащей группы в ферментных препаратах 3-КСД из Mycobacterium globiformis (Лестровая с соавт., 1973), Corynehacterium simplex {=Arthrobacter simplex) (Abul-Hajj, 1978), Rhrodococcus erythropolis (Atrat et al., 1980), Nocardia opaca (Deppmeyer, 1982), и N. corallina (Itagaki et al., 1990). Спектральное изучение фермента показало, что флавиновая простетическая группа быстро восстанавливается при дегидрировании субстрата и ре-окисляется красителями или молекулярным кислородом. В анаэробных условиях восстановленный фермент постепенно переходит в стабильную анионную семихиноновую форму при нейтральном значении рН. Для флавинсодержащих 3-КСД из Nocardia corallina и N. ораса также были найдены стабильные семихиноновые формы фермента (Itagaki et al., 1990). Было показано, что естественным акцептором электронов, действие которого в интактной клетке сопряжено с работой систем, регенерирующих окисленную форму 3-КСД, является вещество хиноидной природы (Stefanovic et al., 1963). Этот природный хинон, способный акцептировать окислительно-восстановительные эквиваленты с 3-КСД, был идентифицирован как витамин Кг (Gale et al., 1962). Позднее витамин Кг был выделен из Nocardia restrictus, Corynebacterium simplex и Septomyxa affinis, и была показана его способность взаимодействовать с дегидрогеназами указанных микроорганизмов (Abul-Hajj, 1978).
Микробиологическое 1(2)-дегидрирование сопряжено с потреблением кислорода (Levy and Talalay, 1959). Дальнейшие исследования показали, что именно растворенный кислород является конечным акцептором электронов в процессе 1(2)-дегидрирования стероидов (Назарук, 1972). Для клеток Arthrobacter globiformis 193 было показано, что восстановительные эквиваленты от 3-КСД поступают в дыхательную цепь на уровне менахинона, а затем передаются на кислород (Medentsev et al, 1985). Участие цитохромной системы дыхательной цепи в процессе 1(2)-дегидрирования было показано на клетках и препаратах цитоплазматических мембран из A. globiformis 193. В ответ на добавление стероида происходило восстановление цитохромов a, b и с типов (Medentsev et al, 1985). Схематично процесс 1(2)-дегидрирования гидрокортизона клетками A. globiformis 193 можно представить, как показано на рис. 5 (Гачок В.П. с соавт., 1988).
Реактивы
Все культуры микроорганизмов, использованные в работе, поддерживались на агаризованных средах с соответствующим источником углерода. Культуру "Arthrobacter globiformis 193" поддерживали на скошенной агаризованной среде состава (г/л): кукурузный экстракт - 10.0; глюкоза - 10.0; агар - 25.0; водопроводная вода до литра, рН 7.0-7.2.
Культуру "Arthrobacter globiformis 193" выращивали в колбах объёмом 750 мл, в которых содержалось 150 мл кукурузно-глюкозной среды. В среду вносили 2-3-мл суспензии клеток (ОП=0.35-0.40 при разведении стерильной водопроводной водой 1:9 и длине кюветы 0.5 см, Х=536 нм, Specord (Германия)), полученную смывом со скошенной агаризованной среды. Выращивали культуру на качалке (220 об/мин) при 30С в течение 20-24часов.
Для индукции 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназы одновременно с суспензией клеток вносили индуктор - этанольный раствор ацетата кортизона - в концентрации 0.2 мг/мл. Конечная концентрация этанола в среде 1%. В некоторых экспериментах использовали в качестве индуктора этанольный раствор гидрокортизона - в концентрации 0.2 мг/мл. В опытах по изучению индуцибельного характера 1(2)-стероиддегидрогеназы добавляли хлорамфеникол в концентрации 30 мкг/мл.
Биомассу отделяли от среды центрифугированием при 5000 х g в течение 15 мин, затем дважды отмывали 0.01 М Na-фосфатным буфером, рН 7.2, и готовили суспензию 50, 100 или 200 мг клеток (сухой вес)/мл буферного раствора, рН 7.0-7.2 и использовали в работе.
б) Культивирование в ферментере АНКУМ-2М
Для получения уплотнённой культуры с 1 (2)-дегидрогеназной активностью, культуру растили в ферментере АНКУМ-2М с общим объёмом 3 л в условиях периодического культивирования с подпиткой, используя оборудование ПУ ИБФМ РАН. Посевным материалом служили клетки N. simplex, выращенные в колбах, как описано выше. Объём среды в ферментере - 1.5-2 л, режим аэрации - от 0.3 до 1.5 л/мин, скорость перемешивания - от 200 до 1000 об/мин, температура 28С. рН среды 7.0-7.2 поддерживали добавлением 20%-ного NH4OH или 20%-ной НС1. Подачу субстратов в ферментер осуществляли с помощью перистальтического насоса MICROPERPEX 2132 фирмы "LKB" (Швеция) в автоматическом или ручном режиме. В автоматическом режиме насос управлялся компьютером IBM PC АТ-286 с программным пакетом SHEPHERD, разработанным в Институте математических проблем биологии РАН (г. Пущино), с инсталлированным в него алгоритмом ExpoDense (Ананьин с соавт., 1997), разработанным в ИБФМ РАН.
Для экспериментов с подпиткой в ферментере использовали среду следующего состава (г/л): (NH4)2HP04 - 15.0, КН2Р04 - 0.4, NaCl - 0.6, MgS04-7H20 - 0.2, FeS04-7H20 - 0.005, 2nS04-7H20 - 0.002, дрожжевой экстракт - 2.0, вода дистиллированная (среда II). Подбор оптимального ростового субстрата проводили в колбах Эрленмейера с 50 мл среды II. Источниками углерода служили ацетат, цитрат, сукцинат, глицерин, метанол и этанол. Контрольным субстратом служила глюкоза. Исходная концентрация каждого из субстратов составляла 1%. Культивирование проводили на качалке (220 об/мин) при 30С. Рост культуры оценивали спектрофотометрически на приборе Photometer-662 фирмы "METROHM" (Швейцария) при 600 нм с соответствующим пересчетом в г сухой биомассы. Концентрацию источника углерода (в режиме подпитки) варьировали от 2 до 10 г/л. В отдельных экспериментах дрожжевой экстракт заменяли на кукурузный (10 г/л) (среда III).
в) Рост при различных температурах определяли при культивировании на чашках Петри с агаризованной средой I при 7, 24, 37С. Рост учитывали на седьмой день. Устойчивость к NaCl определяли также на среде I.