Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Оперон биосинтеза рибофлавина Bacillus subtilis 7
І. І Свойства рибофлавина и его роль в метаболизме организмов 8
1.2. Биосинтез рибофлавина у бактерий 11
1.3. Структура, организация и регуляция рибо флавинового оперона Bacillus subtilis . 15
I. 4 Клонирование рибофлавинового оперона Bacillus subtilis в составе рекомбинантных плазмид. 21
Глава II. Клонирование ДНК в клетках Bacillus subtilis . 23
II. 1 Векторы для клонирования ДНК в клетках Bacillus subtilis 25
II. 2. Стабильность плазмид. 31
II.2.1. Структурная нестабильность. 31
II.2.2. Сегрегационная нестабильность. 32
Экспериментальная часть.
Глава III. Материалы и методы. 35
Глава IV. Конструирование гибридных плазмид . 41
IV. 1. Минимизация фрагмента хромосомы Bacillus subtilis, содержащего в своем составе оперон биосинтеза рибофлавина . 42
IV.2.Создание нового поколения векторов для клонирования в клетках Bacillus subtilis. 50
IV.2.1.Конструирование векторов на основе низкокопийной плазмиды рМХЗО. 51
IV.2.2.Конструирование векторов на основе высококопийной плазмиды рСВ20. 54
IV. 3. Клонирование "оптимизированного" оперона биосинтеза рибофлавина в составе векторов pAR13, pAR21, рСВ20 и рАШ . 57
Глава V. Исследование свойств полученных плазмид в клетках модельного штамма Bacillus subtilis 66
V. l. Определение уровня биосинтеза рибофлавина 66
V.2. Определение уровня стабильности плазмид 67
Обсуждение результатов 70
Выводы 88
- Структура, организация и регуляция рибо флавинового оперона Bacillus subtilis
- Минимизация фрагмента хромосомы Bacillus subtilis, содержащего в своем составе оперон биосинтеза рибофлавина
- Клонирование "оптимизированного" оперона биосинтеза рибофлавина в составе векторов pAR13, pAR21, рСВ20 и рАШ
- Определение уровня стабильности плазмид
Структура, организация и регуляция рибо флавинового оперона Bacillus subtilis
В серии работ выполненных в лаборатории Бреслера показано, w что структурные гены биосинтеза витамина В2 рассположены на 210 хромосомы В.subtilis между lys и ser генами в пределах одной группы сцепления и их экспрессия регулируется по типу негативного контроля (11) (рис.4). ІУ
После получения рибофлавиновых ауксотрофов B.subtilis обнаружено, что все выделенные мутанты могут быть разделены на семь групп :ribA, ribG, ribD, ribT, ribH, ribB, ribF. Дополнительные эксперименты по синтрофии, а также исследование продуктов накопления с помощью ЯМР и масс-спектрометрии, проведенные
Перумовым позволили предположить, что мутация в гене ribA вызывает отсутствие ГТФ-циклогидролазы, в гене ribB рибофлавинсинтетазы, в гене ribT редуктазы, в гене ribD изомеразы, в гене ribF фермента, осуществляющего окончательный синтез ДМРЛ, в гене ribG дезаминазы, в гене ribH фермента осуществляющего образование МЭР Л. На основании полученных данных была предложена схема биосинтеза рф у B.subtilis (47). В этой работе также было показано что все известные мутации ауксотрофности по витамину В2 расположены рядом на хромосоме в пределах одной группы сцепления.
Бреслер и соавторы установили у B.subtilis наличие двух групп регуляторных мутаций, влияющих на биосинтез витамина В2 . ribO- тесно сцепленной со структурными генами и ribC- находящейся вне группы сцепления, между маркерами phe и lys42 (10,12). Обнаружено, что мутации в гене регуляторе (ribC) и гене ribO (операторной части) ведут к сверхсинтезу витамина В2 (13). Предполагалось, что ген ribC кодирует регуляторный белок, который, взаимодействуя с операторной областью ribO регулирует транскрипцию рибофлавинового оперона по типу репрессии на уровне транскрипции, причем в качестве эффекторов могут выступать рибофлавин, ФМН и ФАД (9,11).
Основываясь на полученных данных Перумов и соавторы : / предложили следующую модель организации рибофлавинового оперона ribG, ribA, ribO, ribB, ribF, ribT, ribD, ribH, в которой структурные гены объединены в два сцепленных оперона: ribGA и ribBFTDH, которые разделены регуляторной областью ribO. Предполагалось, что область ribO содержит два оператора и два промотора, а транскрипция субоперонов осуществляется дивергентно. При этом ribG А субоперон имеет, возможно? дополнительный эффектор - один из промежуточных продуктов, относящийся к пиримидинам (47).
В дальнейшем исследования оперона биосинтеза витамина В2 B.subtilis и его генетический анализ проводили с использованием рибофлавиновых ауксотрофов Е.соН, которые были достаточно хорошо охарактеризованы биохимически (2,3,60,66).
Конструирование и анализ гибридных плазмид, содержащих различные участки рибофлавинового оперона B.subtilis, позволили построить рестрикционную карту рф оперона (43,45), а также дали возможность установить порядок структурных генов, отличный от предложенного ранее ribG, ribO, ribB, ribF, ribA, ribTD, ribH (43). Далее было доказано, что операторная область расположена левее сайта Pst I (рис.5) (44). Исследователи предложили следующий порядок генов в опероне ribO, ribG, ribB, ribF, ribA, ribTD, ribH. При этом показано наличие второго оператора и, возможно, дополнительных промоторов непосредственно перед геном ribA (44,45,68) (рис.5).
В 1989 году Мироновым и соавторами была определена полная нуклеотидная последовательность рф оперона B.subtilis (39,40). В работе показано, что оперон биосинтеза рибофлавина имеет протяженность около 4300 п.о., и содержит пять открытых рамок трансляции (ОРТ), которые потенциально могут кодировать полипептиды длиной 361, 215, 398, 154 и 124 аминокислотных остатка.
В отличие от большинства исследованных оперонов B.subtilis, в рибофлавиновом опероне ни одна из рамок не перекрывается. Данные по трансформации к прототрофности рибофлавиновых ауксотрофов B.subtilis различными фрагментами оперона биосинтеза витамина В2 позволили заключить, что мутация ribG расположена в пределах ОРТІ, мутация ribB - ОРТИ, ribAF -OPTIII, ribH - OPTIV, а две мутации ribD и ribT - в пределах OPTV (39,41,42).
В настоящее время точно известны функции структурных генов rib A, ribG и ribH. В 1987 году была определена аминокислотная последовательность р субъединицы рибофлавинсинтетазы (104), а в 1990 а субъединицы рибофлавинсинтетазы (122), что позволило с полной определенностью идентифицировать их расположение в опероне биосинтеза рф. Оказалось, что ген, кодирующий а субъединицу рибофлавинсинтетазы находится в пределах ОРТП, а /? субъединицу кодирует OPTIV. В 1992 году нуклеотидная последовательность, содержащая в своем составе ОРТШ была клонирована в E.coli. При исследовании продуктов накопления рекомбинантных клонов, установлено, что этот структурный ген кодирует ГТФ-циклогидролазу- фермент, осуществляющий первую реакцию флавиногенеза (7).
Предполагается, что структурный ген, расположенный в пределах ОРТІ кодирует дезаминазу, а структурный ген, находящийся внутри ОРТУ-редуктазу (40,42). Известно, что в босинтезе рф принимает участие не менее шести ферментативных активностей (рис.З). Расхождение в числе ферментативных активностей и в числе рамок трансляции рибофлавинового оперона скорее всего объясняется участием в биосинтезе витамина В2 белка с несколькими ферментативными активностями.
В 1990 году установлено, что локус ribC находится на 147 хромосомы B.subtilis (30,98) (рис.4). Ген ribC клонирован на векторе рСВ20 в составе EcoRI фрагмента размером около Ібт.п.о. (31). С помощью удаления различных участков клонированого фрагмента получена плазмида pRC801 несущая вставку размером около 4.5т.п.о., содержащую ri.bC маркер (15). Секвенирование клонированного фрагмента показало, что в его составе находится несколько ОРТ. Сравнение аминокислотной последовательности ОРТ2, размером около 300 аминокислотных остатков, с известными последовательностями показало высокую степень гомологии с ФАД синтетазой Corinebacterium ammoniagenes и E.coli. Определение рибофлавинкиназой и ФАД-синтетазой активностей клеточного экстракта штамма B.subtilis, несущего плазмиду pRC801 показало пятикратное превышение скорости накопления ФМН по сравнению с бесплазмидным штаммом. Следовательно продукт гена ribC является бифункциональным ферментом - рибофлавинкиназой/ ФАД -Синтетазой (17).
Среди мутантов B.subtilis, несущих конститутивную мутацию гіЬСІ, были обнаружены такие, которые практически не синтезируют рибофлавин (29). Оказалось, что причиной этого является дополнительный регулятор влияюший на экспрессию рибофлавинового оперона-гіЬИ5, находящийся на 236 (рис.4) хромосомы B.subtilis (32). Ген ribR клонирован на векторе рСВ20 в составе EcoRI фрагмента размером около 13т.п.о.(54).
Последовательно удаляя различные участки клонированого фрагмента исследователи получили плазмиду pSI13 несущую вставку размером около З.бт.п.о., содержащую ribR маркер (54).
Путем сравнения аминокислотных последовательностей показано, что продукт гена ribR имет высокую степень гомологии с монофункциональными рибофлавинкиназами различных микроорганизмов (16,56). Продукт гена ribR повышает пул ФМН и тем самым репрессирует рибофлавиновый оперон (55). При картировании ribR установилено, что данная мутация расположена на 256 (рис.4) хромосомы B.subtilis (56).
Минимизация фрагмента хромосомы Bacillus subtilis, содержащего в своем составе оперон биосинтеза рибофлавина
Одним из факторов, определяющих вклад клонированного генетического материала в сверхсинтез целевого первичного метаболита, является размер фрагмента ДНК, включающего в себя соответствующие гены, кодирующие синтез этого метаболита.
"Лишний" генетический материал не только увеличивает размер клонированного фрагмента, что часто снижает стабильность гибридных плазмид и затрудняет генноинженерные манипуляции с ними, но и может влиять на эффективность экспрессии целевых генов и жизнеспособность геннонженерных штаммов - продуцентов.
Как было отмечено выше, многие из существующих в настоящее время генноинженерных штаммов - продуцентов рибофлавина на основе В.subtilis содержат гибридную плазмиду рМХ45, включающую ЕсоШ фрагмент хромосомы В. subtilis, размером около Ют.п.о. (28,65) Вместе с тем, в соответствии с установленной первичной последователностью, размер оперона биосинтеза рибофлавина составляет 4.4т.п.о. (41,42). Таким образом, клонированный ЕсоШ фрагмент включает около бт.п.о. "лишнего" для синтеза витамина В2 генетического материала. Влияние этого "лишнего" генетического материала на свойства штаммов-продуцентов, содержащих монокопийные, а тем более многокопийные гибридные плазмиды, не известно.
Задачей данного этапа работы являлось конструирование гибридных многокопийных плазмид, содержащих, как нативный ЕсоШ фрагмент, включающий рибофлавиновый оперон B.subtilis, так и фрагменты ДНК минимизированные до размеров оперона биосинтеза рибофлавина. На основе челночного вектора рСВ20 получены плазмиды pLR,pSR,pOR, содержащие различные по размеру фрагменты хромосомы B.subtilis, несущие оперон биосинтеза рибофлавина.
Плазмида pLR (рис.8) получена путем клонирования EcoRI фрагмента плазмиды рМХ45, размером приблизительно Ют.п.о., содержащего рибофлавиновый оперон на векторе рСВ20. Для этого, плазмиды рМХ45 и рСВ20 расщепляли ферментом EcoRI, лигировали и трансформировали гіЬВ ауксотроф E.coli с отбором трансформантов по устойчивости к ампициллину и прототрофности к рибофлавину.
Для удаления "лишнего", для биосинтеза витамина В2, генетического материала, примыкающего к промоторно-операторной области оперона, получена плазмида pSR (рис.9). Проведена амплификация части оперона биосинтеза рибофлавина размером Зббп.о., включающего промоторно-операторную область, участок узнавания Bglll, а также искуственный сайт EcoRI. В качестве матрицы использован EcoRI фрагмент плазмиды pLR, содержащий рибофлавиновый оперон. Для синтеза цепочки ДНК в прямом направлении применен праймер SF, в обратном SR. Продукт ПЦР, расщепленный рестриктазами EcoRI и Bglll, лигировали со смесью вектора., рСВ20, расщепленного по EcoRI сайту, и фрагмента, размером 6500п.о., содержащим гены ribG, ribB, ribA ,ribH, ribTD, полученным в результате рестрикции плазмиды pLR по EcoRI и неполной рестрикции по Bglll сайтам. Продуктом лигирования трансформировали штамм Е.СОІІА4096 с отбором трансформантов по устойчивости к ампициллину и прототрофности к рибофлавину. В результате сконструирована плазмида pSR, содержащая в своем составе фрагмент ДНК размером б.бт.п.о., включаюший рибофлавиновый оперон.
С целью удаления генетического материала, фланкирующего оперон биосинтеза витамина В2, сконструирована плазмида pCRRIB (рис. 10). Для этого проведена амплификация всего оперона биосинтеза рибофлавина. В качестве матрицы использован EcoRI фрагмент плазмиды pLR, содержащий рибофлавиновый оперон. Для синтеза цепочки ДНК в прямом направлении применен праймер OF, в обратном-OR. Продукт ПЦР, содержащий рибофлавиновый оперон и фланкированный искуственными участками узнавания фермента EcoRI, лигировали с вектором pCRII и трансформировали штамм Е.СОІІА4096 по устойчивости к ампициллину. В результате трансформации получена плазмида pCRRIB, содержащая оперон биосинтеза витамина В2 размером 4.4т.п.о.
Плазмиду pCRRIB (рис.11), расщепленную рестриктазой EcoRI, лигировали с вектором рСВ20, также обработанным EcoRI и трансформировали штамм E.coliA4096 с отбором трансформантов по устойчивости к ампициллину и прототрофности к рибофлавину. В результате отобрана плазмида pOR, содержащая в своем составе фрагмент хромосомы B.subtilis минимизированный до размеров рибофлавинового оперона (4.4т.п.о.).
Таким образом, в результате работы сконструированы плазмиды pLR,pSR,pOR, несущие фрагменты хромосомы B.subtilis размером 10, 6.5, 4.4 т.п.о., соответственно, включающие оперон биосинтеза витамина В2- Полученные плазмиды способны восстанавливать прототрофность по рибофлавину штамма Е.СОІІА4096, что свидетельствует о наличии в клонированном генетическом материале, по крайней мере, генов, компл іентирующих мутацию ауксотрофности по гену ribB у у E.coli.
, Необходимо было проверить генетическую и функциональную идентичность рибофлавинового оперона, входящего в состав плазмид pLR, pSR, pOR, нативному оперону. Вид B.subtilis имеет очень эффективные системы рекомбинации. Поэтому, трансформация гесЕ+ рибофлавиновых ауксотрофов полученными плазмидами, по прототрофности к рибофлавину, не может дать однозначный ответ о генетической идентичности, вследствии того, что различные мутации в области рибофлавинового оперона, которые могли возникнуть при проведении ПЦР, могут быть компенсированы за счет рекомбинации между гомологичными областями рибофлавиновых оперонов, входящих в состав плазмидной и хромосомной ДНК.
Из пяти рибофлавиновых ауксотрофов B.subtilis: G850, В110, А629, НІ6, ТІ были получены штаммы неспособные к гесЕб зависимой рекомбинации. Эти штаммы были отобраны путем интеграции в хромосому соответствующих рибофлавиновых ауксотрофов B.subtilis дефектного гена гесЕб с помощью плазмиды рВТ69, несущей этот дефектный ген, маркированный по сайтам Clal геном, кодирующим устойчивость к хлорамфениколу (Cat). Плазмидой рВТ69, предварительно расщепленной ферментом PstI, трансформировали штаммы B.subtilis-ауксотрофы по витамину В2, с отбором трансформантов на среде LB содержащей хлорамфеникол. Отобранные клоны обладали повышенной чуствительностыо к митомицину С, что характеризует их неспособность к гесЕб зависимой рекомбинации.
Для подтверждения гесЕб- генотипа полученных трансформантов была исследована возможность их трансформации плазмидой рРЫ02, способной реплицироваться только в E.coli и содержащей оперон биосинтеза витамина В2. Полученные нами штаммы не трансфомируются плазмидой pPL102, что указало на их неспособность к рекомбинации, т.е. гесЕб" фенотипу (табл.ЫЗ).
Клонирование "оптимизированного" оперона биосинтеза рибофлавина в составе векторов pAR13, pAR21, рСВ20 и рАШ
Ранее не удалось создать стабильные многокопийные плазмиды, содержащие рибофлавиновый оперон (120). Мы надеялись, что клонировав "оптимизированный" оперон биосинтеза витамина В2, в составе полученных нами многокопийных плазмидных векторов, мы приблизимся к получению стабильных многокопийных плазмид, которые могли бы быть применены для создания промышленных штаммов - продуцентов рибофлавина.
В ходе работы создана модель для изучения влияния нескольких характеристик гибридных плазмид на их стабильность и уровень экспрессии целевого продукта. Такими характеристиками являются:
—Копийность вектора.
—Участок, по которому клонированы целевые гены (локализация оперона в составе вектора).
—Ориентация целевых генов, встроенных в тот или иной сайт.
—Доза целевых генов, т.е. наличие в составе плазмиды двух йопий целевых генов.
—Размер вставки ДНК.
Разработанная модель включает в себя клонирование фрагментов хромосомы B.subtilis, несущих рибофлавиновый оперон в составе различных многокопийных векторов, ведущих свое происхождение от низкокопийной плазмиды рМХЗО. При этом, оперон , встроен в различные участки векторов. При отборе трансформантов особое внимание обращали на выделение вариантов, у которых оперон клонирован в тот или иной участок в различной ориентации.
Рибофлавиновый оперон клонирован по ЕсоШ участку в составе многокопийных векторов pAR13 и pAR21, детерминирующих устойчивость к хлорамфениколу и являющихся делеционными вариантами плазмиды рМХЗО. В результате отобраны плазмиды pAR131, pAR211, pAR212, содержащие в своем составе оперон биосинтеза рф размером 4.4т.п.о. У плазмид pAR211 и pAR131 направление транскрипции рф оперона и репликации плазмиды совпадают ("прямая" ориентация), а у плазмиды pAR212 репликация плазмиды и транскрипция оперона контрнаправлены ("обратная" ориентация) (рисЛ4).
Нами сконструированы гибридные плазмиды, содержащие оперон биосинтеза рф, клонированный по ЕсоШ сайту, в составе многокопийных векторов рСВ20 и pARl, определяющих устойчивость к эритромицину.
Плазмиды pARE и pOR (рис. 15) получены путем клонирования рибофлавинового оперона на векторах pARl и рСВ20 по EcoRI сайту, соответственно. Направление транскрипции рибофлавинового оперона, встроенного в EcoRI сайт векторов pARl и рСВ20, совпадает с направлением репликации плазмид. Таким образом, у плазмид pARE и pOR также, как и у плазмид pAR211 и pAR131 рибофлавиновый оперон по EcoRI сайту клонирован в "прямой" ориентации. В тоже время, локализация рибофлавинового оперона, встроенного в EcoRI сайт у плазмид pARE и pOR, отличается от таковой у плазмиды pAR212.
На основе векторов pARl и рСВ20 созданы гибридные плазмиды, содержащие рибофлавиновый оперон, встроенный в ВамШ участок. Для этого было необходимо получить рф оперон, фланкированный участками ВамШ. Плазмиду pCRRIB (рис. 16) расщепляли EcoRI и лигировали с адаптером А2 ( глава- Материалы и методы). После окончания лигирования смесь обрабатывали ферментом EcoRI и трансформировали штамм E.coli А4096, с отбором трансформантов по устойчивости к ампициллину и прототрофности к рибофлавину. В результате отобрана плазмида pCRRIBB у которой оперон биосинтеза витамина В2 фланкирован участками ВамШ.
При клонировании рф оперона по сайту BamHI плазмиды pCRRIBB и pARl расщепляли BamHI (рис. 17), лигировали и трансформировали штамм B.subtilis D107, с отбором трансформантов по устойчивости к эритромицину и прототрофности к рибофлавину. В результате рестрикционного анализа плазмидной ДНК, выделенной из трансформантов, удалось обнаружить плазмиды с рф опероном, встроенным в BamHI участок в различной ориентации. Плазмида, у которой направление транскрипции оперона совпадает с направлением репликации плазмиды, обозначена как pARBD ("прямая" ориентация), а плазмида, у которой транскрипция оперона и репликация контрнаправлены, названа рARBI ("обратная" ориентация).
Аналогично оперон биосинтеза витамина В2 клонирован по сайту BamHI на векторе рСВ20 (рис.17). Для этого плазмиды pCRRIBB и рСВ20 расщепляли ферментом BamHI, лигировали и трансформировали штамм B.subtilisD107, с отбором трансформантов по устойчивости к эритромицину и прототрофности к рибофлавину. В результате сконструирована плазмида рОШ5, - содержащая рибофлавиновый оперон, клонированный в "прямой" ориентации.
V Доза генов, клонированных в составе векторов, может быть повышена путем введения в плазмиду нескольких копий целевых генов в виде повторов. Поскольку, прямые повторы ДНК нестабильны в клетках B.subtilis, созданы плазмиды, содержащие в своем составе два оперона биосинтеза рибофлавина в виде обратных повторов.
Рекомбинантные плазмиды pARBDE и pARBIE, содержат в своем составе, в виде инвертированного повтора, два оперона биосинтеза рибофлавина, причем инвертированные повторы составляют около 66% от контурной длинны плазмидной молекулы.
Плазмида pARBDE создана следующим образом (рис. 18). Плазмиды pCRRIB и pARBD расщепляли ферментом EcoRI, лигировали и трансформировали штамм B.subtilisD107, с отбором трансформантов по устойчивости к эритромицину и прототрофности . к рибофлавину. Таким образом получена плазмида pARBDE, содержащая два оперона биосинтеза рибофлавина, вставленные в EcoRI и ВатШ участки вектора pARl.
Плазмида pARBIE (рис. 18) сконструирована путем клонирования ЕсоШ фрагмента плазмиды pCRRIB, содержащего оперон биосинтеза рибофлавина на векторе pARBI. Для этого плазмиды pCRRIB и pARBI расщепляли ферментом EcoRI, лигировали и трансформировали штамм В. subtilisD 107, с отбором трансформантов по устойчивости к эритромицину и прототрофности к рибофлавину. В результате создана плазмида pARBIE в составе которой клонированы два рибофлавиновых оперона.
Нами получено 12 плазмид, содержащих оперон биосинтеза рибофлавина и тем самым создана модель для изучения влияния заявленных выше характеристик гибридных плазмид на стабильность плазмидосодержащих штаммов и уровень экспрессии целевого продукта.
Определение уровня стабильности плазмид
Культивирование плазмидосодержащих штаммов проводили как указано в разделе "Материалы и методы". Из результатов опыта представленных в таблице N5 следует, что наряду с векторами рМХЗО, pAR13, pAR21 стопроцентный уровень стабильности в клетках штамма B.subtilisD107 (пс антибиотическому маркеру) проявляют плазмиды рМХ45 и pARBD. Уровень стабильности плазмид pOR15 и pAR212 составляет 76 и 78% соответственно. Приблизительно 50% уровень стабильности имеют векторы pARl, рСВ20, а также плазмида pARBDE. Стабильность плазмид pAR131, pAR211, pOR, pSR, pLR, pARE нс превышает 10%. У штамма B.subtilisD107, несущего плазмидь pARBI и pARBIE, не удалось веделить клоны устойчивые к эритромицину. :
Исследование стабильности плазмид по рибофлавиновому маркеру осуществляли путем выявления колоний, у которых при сохранении устойчивости к эритромицину или хлорамфениколу отсутствует желтая окраска, что свидетельствует о неспособности к сверхсинтезу витамина В2- Такой фенотип обнаружен только для штамма B,subtilisD107 pARBD. Около 5% популяции этого штамма при сохранении устойчивости к эритромицину неспособны к сверхсинтезу рибофлавина, на это указало отсутствие желтой окраски у колоний этой части популяции. Рестрикционный анализ плазмидной ДНК, выделенной из всех имеющихся сегрегантов показал, что причиной этого является делеция размером около 500п.о. в области гена ribB оперона. Полученный делеционный вариант плазмиды pARBD обозначен как pAR81. С помощью трансформации различных рибофлавиновых ауксотрофов B.subtilis плазмидой pAR81 подтверждено, что произошла делеция в области гена ribB (таблица N6). Таким образом, при значительном увеличении уровня синтеза рибофлавина в данном случае и 100% сегрегационной стабильности при клонировании оперона биосинтеза рф по сайту BamHI на векторе pARl в "прямой" ориентации, возникает структурная нестабильность в области рибофлавинового оперона.