Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из ключевых этапов в решении ряда проблем биоорганической химии, молекулярной биологии и биотехнологии является получение высокоочшценных биологически активных соединений. В начале 80-х годов интенсивное развитие медико-биологических наук привело к значительному расширению сферы использования олигонуклеотидов, пептидов и белков высокой степени очистки. Однако темпы совершенствования методов синтеза олигонуклеотидов и пептидов, а также темпы роста числа создаваемых методами генетической инженерии продуцентов рекомби-нантных белков значительно опережали развитие методов получения этих биополимеров в индивидуальном виде. Доступность их для научных исследований и практического применения, таким образом, оказалась в прямой зависимости от дальнейшего прогресса в области методов разделения, очистки и анализа.
Основным способом получения высокоочищенных веществ является жидкостная колоночная хроматография. Большие успехи в области разделения и анализа низкомолекулярных биологически активных соединений были достигнуты с внедрением в практику высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), сравнимой по разрешающей способности с газо-жид-костной хроматографией. Однако в хроматографии биомакромолекул успехи были значительно скромнее. Для разработки высокоскоростных и производительных методов разделения биополимеров необходимы механически прочные, высокоемкие макропористые сорбенты с хорошими гидродинамическими свойствами и длительным сроком эксплуатации. При использовании в аналитической хроматографии они должны обеспечивать высокую эффективность разделения наибольшего числа компонентов за наименьшее время, а при препаративном применении—максимальный выход целевого продукта с требуемой степенью чистоты и активности при наименьших затратах. Мягкие широкопористые сорбенты, полученные на основе полисахаридных гелей или синтетических полимеров, традиционно применяемые в лабораторной практике для анализа и очистки биополимеров, не удовлетворяли этим требованиям. Число твердокаркасных коммерческих сорбционных материалов, разработанных специально для различных типов хроматографии биомакромолекул было явно недостаточным.
Таким образом, актуальной стала задача целенаправленного получения новых макропористых жестких сорбентов для эффективного разделения биополимеров. Как показал анализ литературы, одним из наиболее перспективных подходов к конструированию таких хроматографических материалов является использование пористых кремнеземных матриц с химически модифицированной поверхностью. Однако исследования в этой области к началу выполнения настоящей работы были весьма фрагментарны, что было обус-
ловлено недостаточным развитием теории и практики синтеза и применения хроматографических сорбентов.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в проведении комплексного исследования кремнеземных сорбционных материалов, разработки новых высокоэффективных сорбентов для хроматографии биополимеров и применении синтезированных сорбентов для решения конкретных научных и практических задач, связанных с использованием методов хроматографического анализа и препаративного получения в индивидуальном виде олигонуклеотидов, пептидов, белков различных классов.
В задачи исследования входило:
изучить методы химической модификации поверхности кремнеземов и синтезировать матрицы, обладающие комплексом свойств, требуемых для получения на их основе ряда новых хроматографических сорбентов;
разработать высокоэффективные анионо- и катионообменной сорбенты, изучить их свойства в сравнении с лучшими коммерческими ионитами, отработать оптимальные условия применения для хроматографии олигонуклеотидов, белков и пептидов как в аналитическом, так и в препаративном масштабах;
изучить факторы, влияющие на обращенно-фазовую хроматографию малорастворимых гидрофобных белков, разработать стратегию их эффективного разделения;
на основе синтезированных сорбентов разработать новые эффективные методы хроматографического анализа и получения высокоочищенных биомакромолекул, использовать их для проведения исследования структуры и свойств ряда вирусных, рекомбинантных белков и иммуноглобулинов;
разработать подходы к получению новых высокоёмких твердокаркасных носителей для эффективной иммобилизации различных биоспецифических лигандов и использования полученных сорбентов в аффинной хроматографии, в том числе для препаративной очистки белков, применяемых в производстве ряда медицинских иммунодиагностикумов.
Научная новизна и практическая значимость работы. На основе проведенных исследований разработаны методы модификации широкопористых кремнеземов и получения матриц со свойствами, необходимыми для конструирования новых высокоэффективных сорбентов для анионообмен-ной, катионообменной, аффинной хроматографии биополимеров.
При создании ионитов композиционного типа изучена зависимость их селективности, сорбционной емкости и неспецифического гидрофобного связывания биополимеров от диаметра пор кремнеземной матрицы и строения сшитого полимерного слоя.
Показано, что синтезированные композиционные сорбенты превосходят по разрешающей способности, емкости и стабильности коммерческие ВЭЖХ-носители «щеточного» типа. Отработаны условия эффективного разделения на новых сорбентах протяженных олигонуклеотидов, пептидов и белков различных классов.
Разработан метод очистки малорастворимых гидрофобных белков с помощью ВЭЖХ на синтезированных широкопористых обращенно-фазовых сорбентах. Метод использован для получения недоступных ранее индивидуальных белков вирусов клещевого энцефалита, гриппа, Марбург, Венесуэльского энцефаломиелита лошадей. В результате проведенных исследований получены новые данные о свойствах этих белков, их строении и посттрансляционной модификации. Проведены структурные исследования выделенных с помощью ВЭЖХ рекомбинантных интерферона а2 человека, ангиогенина и д других белков. Доказана их идентичность природным аналогам.
На основе применения ионообменной хроматографии на синтезированных сорбентах разработан способ выделения иммуноглобулинов класса G из сывороток крови человека и животных, а также новый метод количественного анализа подклассов IgG. Изучены индивидуальные физико-химические и биологические свойства подклассов кролика, козы, овцы, лошади. Выделен и охарактеризован неизвестный ранее покласс IgG козы. Впервые выявлены общие закономерности изменения состава подклассов IgG в процессе иммунизации животных различными антигенами. Разработан подход к препаративному получению высокоактивных инизкореактогенных иммуноглобулинов из гипериммунной лошадиной сыворотки.
Синтезирован ряд новых кремнеземных аффинных сорбентов, исследованы их свойства и показано преимущество в селективности, гидродинамических характеристиках и стабильности над традиционно используемыми носителями на основе полисахаридных матриц. Разработаны носители для препаративной иммуноаффинной очистки антивидовых антител, применяемых в технологии производства ряда медицинских иммуно-диагностикумов.
Разработан новый иммунометрический метод определения хориони-ческого гонадотропина человека (ХГЧ), основанный на использовании двух типов высокоочищенных поликлональных антител к разным антигенным детерминантам молекулы ХГЧ, полученных из одной антисыворотки с помощью последовательной двухэтапной аффинной хроматографии на композиционных носителях. На основе его созданы и внедрены в производство ЗАО «Вектор-Бест» наборы реагентов для иммуноферментного качественного и количественного определения хорионгонадотропина.
Апробация работы. Представленные в диссертации результаты были доложены на различных конференция и симпозиумах, в том числе: V Всесоюзной конференции «Методы получения и анализа биохимических препаратов» (Юрмала, 1987), VII Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов (Таллин, 1987), Всесоюзной конференции «Проблемы использования целлюлозы и ее производных в медицине и микробиологической промышленности» (Ташкент, 1989), конференции Всесоюзного химического общества им. Д.И. Менделеева «Молекулярная сорбция биологически активных веществ» (Пенза, 1990), Международной конференции «Medical biotechnology, immunization and AIDS» (Ленинград, 1991), Международной научной конференции «Актуальные проблемы медицинской и ветеринарной паразитологии» (Витебск, 1993), II Международной конференции «AIDS, cancer and retroviruses» (Санкт-Петербург, 1993), XI Международном конгрессе по вирусологии (Иерусалим, 1996), а также на научных конференциях и семинарах НПО «Вектор», Новосибирского института биоорганической химии и МГУ. По материалам исследований опубликовано 35 работ, включая 2 авторских свидетельства и 2 патента РФ.
Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, 4 глав собственных исследований, заключения и выводов. Она изложена на 206 страницах машинописного текста, включая 30 таблиц, 27 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 238 источников.
Работа выполнена в рамках ряда научно-исследовательских работ и научно-технических программ в 1983-1997 годах в НПО, а позднее ГНЦ ВБ «Вектор».