Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы .
Система качества ХАССП и ее роль в обеспечении безопасности мясной и рыбной продукции
Опасные факторы в технологических процессах по получению мясного и рыбного сырья и продуктов их переработки
Критерии и нормативы безопасности производств по получению, мяса, рыбы и продуктов их переработки
Опасные факторы и методы их контроля
Гетероморфизм бактерий и его роль при контроле опасных факторов
Обеспечение безопасности производственных и сточных вод .
Средства и методы дезинфекция сырья, продукции, производственных помещений и сточных вод
Заключение
Собственные исследования
Материалы и объекты исследований .
Методы исследований
Методики определения микроорганизмов с помощью тест-систем «RidaCount» (Германия)
Методики определения возбудителей инфекций с помощью иммунохроматографических индикаиторных элементов с наночастицами коллоидного золота
Методики определения сульфаниламидов и антибиотиков в мясе, рыбе и продуктах их переработки на основе иммуномикрочиповой технологии с помощью тест-систем фирмы RANDOX, Великобритания
Методики определения антигельминтных веществ в мясе, рыбе и продуктах их переработки на основе иммуномикрочиповой технологии с помощью тест-систем фирмы RANDOX, Великобритания .
Методики определения токсикантов (фосфорорганических соединений и карбаматов) в сырье и продукции животного и растительного происхождения на основе ингибирования ацетилхолинэстеразы с помощью тест-системы Abraxis OP/C, США
Методики идентификации возбудителей инфекций на основе ПЦР в режиме «Реального времени»
Методики идентификации возбудителей инфекций на основе ДНК-чипов
Методика дифференцированного определения вегетативных и L-форм бактерий на основе ДНК-зондов
Методика дифференциального определения вегетативных и L-форм бактерий на основе ПЦР
Статистическая обработка результатов
Результаты исследований .
Анализ отдельных технологий и элементов обеспечения безопасности при получении мяса, рыбы и продуктов их переработки .
Усовершенствование анализа микробных контаминаций в ККТ с помощью тест – систем RIDA COUNT .
Усовершенствование определения микроорганизмов, токсинов и трансгенных белков в ККТ с помощью иммунохроматографических индикаторных элементов с наночастицами коллоидного золота
Усовершенствование индикации и идентификации патогенных бактерий в ККТ с помощью мультиплексной ПЦР в режиме «реального времени»
Разработка ускоренных методик дифференциального определения вегетативных и L-форм бактерий на основе ДНК-диагностики .
Адаптация тест- системы на основе ДНК-чипов для контроля микроорганизмов в ККТ .
Усовершенствование токсикологического контроля опасных факторов в ККТ на основе тест-системы ингибирования ацетилхолинэстеразы in vitro
Адаптация тест- системы на основе иммуномикрочиповой технологии для оценки ККТ (сырье и продукция) на остаточные количества лекарственных средств
Сравнительные исследования методик определения опасных факторов при мониторинге ККТ технологий получения мяса, рыбы и продуктов их переработки
Теоретическое и экспериментальное обоснование усовершенствование систем корректирующих мероприятий по очистке воды используемой на предприятиях по получению мяса, рыбы и продуктов их переработки .
Теоретическое и экспериментальное обоснование усовершенствования систем корректирующих мероприятий проведения дезинфекции объектов при получении мяса, рыбы и продуктов их переработки .
Обсуждение результатов
Основные результаты и выводы
Список литературы .
Список основных сокращений
- Критерии и нормативы безопасности производств по получению, мяса, рыбы и продуктов их переработки
- Обеспечение безопасности производственных и сточных вод
- Методики определения антигельминтных веществ в мясе, рыбе и продуктах их переработки на основе иммуномикрочиповой технологии с помощью тест-систем фирмы RANDOX, Великобритания
- Теоретическое и экспериментальное обоснование усовершенствование систем корректирующих мероприятий по очистке воды используемой на предприятиях по получению мяса, рыбы и продуктов их переработки
Введение к работе
Актуальность темы. Получаемые на предприятиях АПК сырье и продукты
животного происхождения должны быть высокого качества, так как направлены на
обеспечение пищевой безопасности и на получение компонентов
биотехнологических процессов производства полезных продуктов для народного хозяйства, медицины и ветеринарии, улучшающих воздействие на окружающую среду и формирование экологичной среды обитания человека и животных.
Комплекс средств и методов обеспечения безопасности на указанных предприятиях включает различные элементы: системы управления, систем контроля производственных помещений, оборудования, сырья и продукции, воздухо- и водоснабжения, отходов производства, а также систем деконтаминации и очистки. В современных условиях требования безопасности обеспечиваются соответствующими техническими регламентами, а так же стандартами систем качества (ИСО 22000, ХАССП, GMP) и стандартами экологического мененджмента. При этом, необходимо осуществлять быстрое и эффективное обнаружение опасных факторов, способных оказать негативное влияние в критических контрольных точках, своевременно анализировать эти факторы и проводить соответствующие корректирующие мероприятия. Такой подход с успехом используется за рубежом и у нас в стране (Бурыкина И.М., 2004, Ребезов М. Б. и др. 2014, Романенко, Г.А. 2004, Скотникова Т.А., Токарик Э.Ф. 2014, Dillon, М. 2005).
Одним из основных опасных факторов, влияющих на безопасность получения сырья и продукции животного происхождения является микробная контаминация. При этом важно определять не только общие показатели микробного обсеменения, а и проводить идентификацию возбудителей инфекции. К таким возбудителям, относятся прежде всего эшерихии, сальмонеллы, золотистый стафилококк, кампилобактерии и листерии (Дунченко Н.И. и др. 2007, Золотарев Ю.В. 2004, Маккреди Б.Д., Чимера Д.А. 1999, Самуйленко А.Я, Клюкина В.И. и др. 2012, Corbisier Р, Trapmann S. 2005). Существующие методы бактериологического анализа достаточно длительны и трудоемки (Галкин А.В., Комаров В.Н. и др. 1998, Долгов В.А. и др. 2004, Морозова Е.Н. 2003, Dillon, М. and Griffiths, С, 1998) и не совсем пригодны для скрининговых исследований микробных загрязнений в критических контрольных точках. Весьма перспективным в этом направлении являются методы на основе ПЦР в режиме «реального времени», ДНК-чипов, ускоренных тест-систем подращивания на селективных хромагенных средах (RIDA COUNT), иммунохроматографических индикаторных элементов с наночастицами колойдного золота. Несмотря на имеющиеся данные об успешном использовании этих методов и тест-систем для индикации и идентификации различных микроорганизмов (Артемов А.В., 2012, Горобчук Е. А. 2008, Светличкин В.В. 2001, Светличкин В.В. и др. 2010, Смирнов A.M., Уша Б.В. и др. 2012), актуальным является валидация их к конкретным объектам и разработка более эффективных модификаций.
В некоторых случаях под действием различных факторов (температура, химические воздействия и т. д.) популяции бактерий могут переходить в
гетероморфное состояние, которое затрудняет их индикацию (Прозоровский СВ. и др. 1981, Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., 1997, 1999, Емельяненко Е. Н. 1997, Павлова И.Б. 1999, Павлова И.Б. и др. 1990). Кроме того, в научных целях иногда важно знать в каком соотношении находятся популяции в различных гетероморфных состояниях. Это актуально, например, при определении эффективности корректирующих мероприятий с использованием различных средств дезинфекции в критических контрольных точках. В решении проблемы дифференциального определения популяции бактерий в различных гетероморфных состояниях перспективными представляются подходы на основе ДНК-диагностики (Лушников К.В. и др. 2004, Шиленко И.В., Ярков СП., и др. 2011, Tani Н, NodaN, 2005).
Опасными факторами при получении продукции животного происхождения могут являться различные токсиканты, которые могут накапливаться в организме животных, попадать в соответствующее сырье и концентрироваться в продукции при различных технологических процессах. К таким токсикантам следует отнести нитрозамины, фосфорорганические соединения, антибактериальные и антигельминтные препараты, бактериальные токсины, загрязняющие сырье. Ботулинический и стафилококковый токсины могут накапливаться как в сырье, так и готовой продукции при ее хранении (Луцык СВ., Светличкин В.В. и др. 2012, Cherington М. 2004, Hunter, P.R. et Nichols, G. 2002). При несоблюдении технологии дезобработки могут накапливаться на различных поверхностях производства и самой продукции остаточные количества дезсредств, или их составляющих, например ПАВ, что в конечном итоге скажется на безопасности и качестве готовой продукции (Попов Н.И., Удавлиев Д.И. 2002, Попов и др. 2008, Quah, J.X., Ambu, S. 2011). Для ускоренного контроля перечисленных опасных факторов токсичной природы перспективным представляется использование методов и тест систем, основанных на реакциях антиген-антитело и ингибирования ферментативных систем или тест-организмов (Самуйленко А.Я. 2003, Уша Б.В., Светличкин В.В., и др. 2010, Corbisier P., Trapmann S. 2005). Эти методы хорошо зарекомендовали себя при специфичном и неспецифичном контроле безопасности (Иванкин А.Н. 2005, Уша Б.В., Светличкин В.В. и др. 2012, Ярков СП., Третьяков СИ. 2005, Huang СС, Pan ТМ. 2005). Однако для применения их в конкретных случаях систем обеспечения безопасности при получении продукции требуется соответствующая адаптация.
Наконец, для каждого технологического процесса получения продукции животного происхождения необходимо создать свою систему на основе принципов ХАССП, определить критические контрольные точки и опасные факторы технологического процесса, разработать и совершенствовать системы контроля и проведения корректирующих мероприятий (Белов Ю.П., 2005, Лемеш В.М. 2006, , Лукин А.А. 2013, Муранова Ю.Л. 2005, Пономарева О. И. и др. 2003, Ребезов М. Б. и др. 2009, Colin P., Salvat G. 2003).
Степень разработанности проблемы. Несмотря на достигнутые успехи по внедрению систем качества на различных предприятиях агропромышленного комплекса, практическая реализация такого подхода требует совершенствования всех
элементов с учетом современных достижений науки и техники. Для конкретных производств необходимо разрабатывать и актуализировать все элементы систем обеспечения безопасности, определять критические контрольные точки, опасные факторы, проводить валидацию методов и верификацию приборов и оборудования.
Существующие методы контроля опасных факторов микробного происхождения на основе классического бактериологического анализа достаточно длительны и трудоемки и не совсем пригодны для скрининговых исследований микробных загрязнений в критических контрольных точках. Из проаналированных нами литературных источников известные ускоренные методы контроля микробных загрязнений - на основе ПЦР в режиме «реального времени», ДНК-чипов, тест-систем на хромагенных средах (RIDA COUNT), иммунохроматографических индикаторных элементов с наночастицами колоидного золота не всегда валидированы к конкретным ККТ и не все из них в применяемых модификациях обладают достаточной чувствительностью, быстродействием и не охватывают необходимый спектр контролируемых микроорганизмов.
Важная характеристика микробных загрязнений - соотношение вегетативных и
L-форм, длительное определение которых негативно сказывается на
своевременности и эффективности проведения корректирующих мероприятий для нивелирования недопустимых рисков.
Ускоренные методы контроля токсичных веществ в ККТ на основе тест-систем ферментативного ингибирования in vitro, иммуномикрочиповой технологии, иммунохроматографических тест-систем также не всегда адаптированы к конкретным ККТ, не во всех случаях обладают достаточной чувствительностью и для определенных токсикантов не установлены пределы обнаружения.
Для эффективного проведения соответствующих предупреждающих и корректирующих мероприятий требуется дальнейшее совершенствование важных элементов обеспечения безопасности производств по получения мяса, рыбы и продуктов их переработки - дезинфекции, очистки производственной и сточной вод.
На основании изложенного, были сформулированы цель и задачи нашей работы.
Целью работы являлось: Разработка концепции комплексной системы обеспечения безопасности технологических процессов переработки продукции АПК.
В задачи исследований входило:
1. Провести анализ отдельных технологий и элементов безопасности при получении мясной и рыбной продукции для последующего усовершенствования методов и средств обеспечения безопасности в соответствии с принципами ХАССП.
2. Усовершенствовать анализ микробных контаминации в ККТ с помощью
тест - систем RID A COUNT.
3. Усовершенствовать определение микроорганизмов, токсинов и трансгенных
белков в ККТ с помощью иммнохроматографических индикаторных элементов с
наночастицами коллоидного золота.
4. Усовершенствовать индикацию и идентификацию патогенных бактерий в
ККТ с помощью мультиплексной ПЦР в режиме реального времени.
-
Разработать ускоренные методики дифференциального определения вегетативных и L-форм бактерий на основе ДНК-диагностики.
-
Адаптировать тест-системы на основе ДНК-чипов для индикации патогенных бактерий в ККТ.
-
Адаптировать тест-системы на основе ингибирования ацетилхолинэстеразы для токсикологического контроля воды, мясного и рыбного сырья
-
Адаптировать тест-системы на основе иммуномикрочиповой технологии для оценки мясного и рыбного сырья, полуфабрикатов, сухих мясных и рыбных питательных сред на содержание остаточных количеств лекарственных средств и пестицидов.
-
Провести сравнительную оценку методик определения опасных факторов при мониторинге ККТ технологий получения мяса, рыбы и продуктов их переработки.
-
Провести теоретическое и экспериментальное обоснования усовершенствования систем корректирующих мероприятий по очистке воды используемых на предприятиях по получению мяса, рыбы и продуктов их переработки.
-
Провести теоретическое и экспериментальное обоснование усовершенствования систем корректирующих мероприятий проведения дезинфекции объектов при получении мяса, рыбы и продуктов их переработки.
Научная новизна. Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена на моделях концепция комплексной системы обеспечения безопасности технологических процессов (мясо- и рыбоперерабатывающей промышленности) получения мяса, рыбы и продуктов их переработки, включая компоненты питательных сред для биотехнологии с применением современных ускоренных методов мониторинга опасных факторов в ККТ на основе хромогенных тест-подложек, ДНК-диагностики, индикаторных иммунохроматографических элементов с наночастицами коллоидного золота, иммуномикрочиповой технологии, тест-систем ингибирования ферментативной активности in vitro, а также новых технологий дезинфекции и очистки производственных и сточных вод.
Разработаны адаптированные методики для контроля опасных факторов микробного происхождения в ККТ технологий получения мясной и рыбной
(R)
продукции на основе ускоренных хромогенных тест - систем RIDAW COUNT, давших возможность сократить в 1,5 - 2 раза время анализа по сравнению с классическими микробиологическими методами.
Разработаны адаптированные методики для контроля опасных факторов
сальмонелл, скафилококкового и бутулинического токсинов, трансгенных белков в
ККТ технологий получения мясной и рыбной продукции на основе
иммунохроматоргафических индикаторных элементов с наночастицами коллоидного золота, позволяющих проводить ускоренный анализ в течении 1-4 часов. При этом,
б
впервые разработаны модификации на этапе пробоподготовки с применением сефадекса для концентрирования токсинов, повышающие чувствительность их определения в 2-3 раза.
Усовершенствован контроль опасных факторов на основе иммуномикрочиповой технологии с хемилюминисцентной детекцией, позволяющей проводить автоматизированный качественный и количественный анализ остаточных количеств пестицидов и лекарственных средств в течении 3-4 часов. При этом, впервые показана возможность применения данного метода для контроля опасных факторов в сухих мясных и рыбных питательных средах, используемых в том числе для биотехнологии.
Впервые усовершенствован контроль опасных факторов на основе ДНК-чипов и разработаны адаптированные модифицированные методики для ККТ технологий получения мяса, рыбы и продуктов их переработки, а также тест-система для одновременного анализа патогенных возбудителей: Sal. typhimurium, Е. coli, S. aureus, Yer. enterocolitica, Ps. aeruginosa.
Адаптированы тест-система и методики выявления токсичных опасных факторов на основе ингибирования ацетилхолинэстеразы in vitro и впервые установлены пределы обнаружения в рыбе, мясокастительных полуфабрикатах и воде для диазинона, дихлофоса и диэтилдитиокарбамата натрия и монурона.
Впервые разработаны методики дифференциального определения вегетативных и L-форм бактерий на основе ДНК-диагностики, позволяющие сократить время анализа в 3-4 раза по сравнением с бактериологическими методами.
Усовершенствована система корректирующих мероприятий по нивелированию опасных факторов загрязнения сточной воды на основе рациональной технологической схемы очистки, включающей несколько последовательно расположенных блоков обработки: блок механической обработки - для удаления твердых частиц, блок биологической обработки - для подавления патогенных микроорганизмов и блок дезинфекционной обработки - для обеззараживания очищенной сточной воды.
Теоретически и экспериментально обоснованы эффективная стратегия и технологическая схема комплексной очистки сточных вод мясо -рыбоперерабатывающих предприятий, представляющей собой последовательную комбинацию нескольких различных по своей природе процессов, в ходе реализации которых вначале обеспечивается удаление всех взвешенных дисперсно-коллоидных частиц на участке механической очистки, затем биохимическое окисление загрязнений с помощью микроорганизмов активного ила в аэротенках и доочистка выводимых из очистных сооружений сточных вод от оставшихся органических и минеральных примесей в биофильтрах или биологических прудах.
Впервые разработан эффективный метод уменьшения количества патогенных организмов в питьевой воде, реализующий одновременно их физическое уничтожение и обеззараживание с помощью классических процессов фильтрации, коагуляции, флокуляции и осветления.
Научно обоснованны требования к средствам дезинфекции, предназначенным для санитарной обработки ККТ технологических процессов получения мяса, рыбы и продуктов их переработки, обеспечивающие высокую эффективность и положительные показатели: широкий спектр антимикробного действия, медленное формирование резистентных штаммов микроорганизмов, безопасность для потребителя и окружающей среды, низкую токсичность, полное удаление с обработанных поверхностей после завершения дезинфекционной экспозиции, универсальность действия.
Впервые, на основании изучения широкого спектра различных
дезинфицирующих средств показана возможность образования L-форм при недостаточной концентрации рабочих растворов некоторых препаратов на основе четвертичных аммониевые соединений с помощью разработанных методик ДНК-диагностики.
Теоретически и экспериментально обоснована целесообразность использования в качестве биоцидных средств для предприятий по получению мяса, рыбы и продуктов их переработки моюще-дезинфицирующие средства, применение которых позволяет совместить в одной операции стадии мойки и дезинфекции, сократить продолжительность санитарной обработки и расход используемой воды.
Практическая значимость работы. Результаты выполненной работы внедрены на мясо- и рыбоперерабатывающих предприятиях, что подтверждено соответствующими актами:
Акт «Апробация методов ускоренного микробиологического и токсикологического контроля безопасности мясного сырья и мясной продукции на основе ДНК- и иммунодиагностики (ПНР в режвме реалного времени, ДНК чипов и иммуномикрочиповой технологии, иммунохроматографических индикаторных элементов) в критических контрольных точках технологических процессов в соответствии с принципами ХАССП» - ОАО «Черкизовский мясоперерабатывающий завод» от 07.07.2015 года.
- АКТ производственного опробования на действующих очистных сооружениях
метода аэробной биологической очистки от биогенных элементов и патогенной
микрофлоры - ООО «Кузнецовский комбинат» 28.08.2015 года.
- Справка об использовании проектной организацией результатов научно-
исследовательской работы - ОАО «МосводоканалНИИпроект» от 23.12.2014 года.
- Справка ООО «Тихий океан» № 46-11-14 от 19.11.2014 г.
- Справка ООО «Комбинат по производству пищевых продуктов «РУСКОН» 64/исх/2 от 25.04.2015 г. - Справка ООО «ЕВРОФИШ» № 15 от 11.02.2014 г.
По результатам исследований разработаны и утверждены:
Патент РФ № 2535989. Способ аэробной биологической очистки сточных вод. Самуйленко А.Я., Денисов А.А., Денисова Е.А., Плотников М.В., Крупский А.С., Чичилеишвили Г.Д., Гринь А.В., Положенцев И.М. Опубликован 20.12.2014 г. - Бюл. №35.
Патент РФ № 2535842. Установка для аэробной биологической очистки сточных вод. Самуйленко А.Я., Денисов А.А., Денисова Е.А., Плотников М.В., Крупский А.С., Чичилеишвили Г.Д., Дадасян А.Я., Гринь А.В., Положенцев И.М. Опубликован 20.12.2014 г. - Бюл. № 35.
- Методическое пособие по применению ускоренных методов и тест-систем иммунохроматографии для мониторинга критических контрольных точек при производстве мясной и рыбной продукции на основе принципов ХАССП (утверждены отделением ветеринарии РАСХН 12.11.2013 г.).
Методика определения энтеротоксинов на основе иммунохроматографии с применением коллоидного золота в мясе - 07.11.2012 г., ГНУ ВНИИВСГЭ.
Методика определения энтеротоксинов на основе иммунохроматографии с применением коллоидного золота в мясных полуфабрикатах - 07.11.2012 г., ГНУ ВНИИВСГЭ.
Методика определения остаточных количеств антимикробных веществ в мясе на основе иммуномикрочиповой технологии- 07.11.2012 г., ГНУ ВНИИВСГЭ.
- Методика определения остаточных количеств антимикробных веществ в
мясных полуфабрикатах на основе иммуномикрочиповой технологии - 07.11.2012 г.,
ГНУ ВНИИВСГЭ.
Рекомендации по проведению ветеринарной дезинфекции на животноводческих комплексах и биопредприятиях - Утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ, 2014 г.2014 г.
Методические рекомендации по дифференциальному определению вегетативных и L-форм бактерий в объектах ветеринарно-санитарного контроля с использованием ДНК-гибридизации на мембранных фильтрах (Утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 28.02.2001 г.).
- Методические указания по индикации Staphylococcus aureus в мясопродуктах
с использованием генных зондов (Утверждены Департаментом ветеринарии
Минсельхоза РФ 14.09.2000 г. № 13-5-2/194).
Основные положения, выносимые на защиту:
усовершенствованная комплексная система обеспечения безопасности
технологических процессов переработки мяса, рыбы и продуктов их переработки,
включая компоненты питательных сред для биотехнологии с применением
современных ускоренных методов мониторинга опасных факторов в ККТ на основе
хромогенных тест-подложек, ДНК-диагностики, индикаторных
иммунохроматографических элементов с наночастицами коллоидного золота, иммуномикрочиповой технологии, тест-систем ингибирования ферментативной активности in vitro, а также новых технологий дезинфекции и очистки производственных и сточных вод;
- адаптированные методики для контроля опасных факторов сальмонелл,
скафилококкового и бутулинического токсинов, трансгенных белков в ККТ
технологий получения мясной и рыбной продукции на основе
иммунохроматоргафических индикаторных элементов с наночастицами коллоидного золота;
- адаптированные методики контроля опасных факторов на основе ДНК-чипов для ККТ технологий получения мяса, рыбы и продуктов их переработки, а также тест-система для одновременного анализа патогенных возбудителей: Sal. typhimurium, Е. coli, S. aureus, Yer. enterocolitica, Ps. Aeruginosa;
- адаптированные методики для конроля опасных факторов (остаточных
количеств антибактериальных и противопаразитарных веществ) на основе тест-
систем иммуномикрочиповой технологии и пределы обнаружения тетрациклина,
фуразолидона, тиабендазола, левамизола в мясе и рыбе;
адаптированые методики выявления токсичных опасных факторов на основе ингибирования ацетилхолинэстеразы in vitro и пределы обнаружения в рыбе, мясокастительных полуфабрикатах и воде для диазинона, дихлофоса и диэтилдитиокарбамата натрия и монурона;
ускоренные методики дифференциального определения вегетативных и L-форм бактерий на основе ДНК-диагностики;
усовершенствованная система корректирующих мероприятий по
нивелированию опасных факторов загрязнения сточной воды на основе
рациональной технологической схемы очистки, включающей несколько
последовательно расположенных блоков обработки;
- технологическая схема комплексной очистки сточных вод мясо -
рыбоперерабатывающих предприятий, представляющей собой последовательную
комбинацию нескольких различных по своей природе процессов, в ходе реализации
которых вначале обеспечивается удаление всех взвешенных дисперсно-коллоидных
частиц на участке механической очистки, затем биохимическое окисление
загрязнений с помощью микроорганизмов активного ила в аэротенках и доочистка
выводимых из очистных сооружений сточных вод от оставшихся органических и
минеральных примесей в биофильтрах или биологических прудах;
метод уменьшения количества патогенных организмов в питьевой воде, реализующий одновременно их физическое уничтожение и обеззараживание с помощью фильтрации, коагуляции, флокуляции и осветления;
требования к средствам дезинфекции, предназначенным для санитарной обработки ККТ технологических процессов получения мяса, рыбы и продуктов их переработки, обеспечивающие высокую эффективность и положительные показатели: широкий спектр антимикробного действия, медленное формирование резистентных штаммов микроорганизмов, безопасность для потребителя и окружающей среды, низкую токсичность, полное удаление с обработанных поверхностей после завершения дезинфекционной экспозиции, универсальность действия.
Личный вклад автора. Диссертационная работы выполнена автором самостоятельно и является совокупностью многолетних научных исследований. Автором лично сформулирована проблема, определены цель и задачи исследований и пути их реализации. Проведены теоретическое и экспериментальное обоснование
эффективности применения методов и тест-систем оценки показателей
микробиологической и токсикологической безопасности исследуемых объектов, а также проведение корректирующих мероприятий на предприятиях по получению мяса, рыбы и продуктов их переработки. Материалы диссертации проанализированы и обобщены лично автором. Вклад в работу других авторов отражен в публикациях по теме диссертации.
Достоверность результатов исследований. Достоверность результатов исследований подтверждаются соответствием теоретических данных с полученными результатами экспериментов, а также их математической обработкой.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:
Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 70-летию со дня рождения профессора В. А. Першина «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов» ВНИиТИБП РАСХН (г. Щелково, 1998);
Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 75-летию со дня рождения Н.Ф. Чуклова «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов» ВНИиТИБП РАСХН (г. Щелково, 1998);
- Международной научной конференции «Проблемы ветеринарной
санитарии, гигиены и экологии (дезинфекция, дезинсекция, дератизация)»
ВНИИВСГЭ РАСХН (г. Москва, 1999);
Международной научно-практической конференции «Достижения молекулярной биологии и биотехнологии в ветеринарии и зоотехнии» 2013, Москва, ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина (г. Москва, 2013).
-Международной научно-практической очно-заочной конференции «Современные проблемы ветеринарно-санитарной экспертизы и пути и решения творческого наследия А.П. Ермолаева (к 100-летию со дня рождения) 2013,Омск,
-Международной научно-практической конференции посвященной ветеранам ветеринарной науки ВНИИБТЖ (г. Москва, 2013).
- Международной научно-практической конференции.- г. Щелково, 5-7
декабря - 2012.
Международной конференции посвященной 85-летию ГНУ Самарской НИВС, г. Самара, 16 октября 2014 г.
Международной научно-практической конференции, посвященной 45-летию ВНИиТИБП, Щелково, 27-28 ноября 2014 г.
- Научно-практической конференции «Современные проблемы ветеринарии,
зоотехнии и биотехнологии» посвященные 5-летию Ассоциации «Ветеринария,
зоотехния и биотехнология» Москва.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 28 научных работ, из них 13 в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ и 15 в сборниках и трудах Всероссийских и Международных конференций.
и
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 424 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы, содержащего 502 источника отечественных и зарубежных авторов, приложений. Работа содержит 61 таблицу и 25 рисунков.
Критерии и нормативы безопасности производств по получению, мяса, рыбы и продуктов их переработки
В последние годы за рубежом и у нас в стране получила развитие система ХАССП (анализ рисков и критические контрольные точки). В Российской Федерации утвержден ГОСТ Р 51705.20-2001 Управление качеством пищевых продуктов на основе принципов ХАССП. Сертификация в системе ХАССП является добровольной, однако, является, с одной стороны, важным и эффективным элементом обеспечения безопасности продукции, с весьма надежным внутренним контролем производства, с другой,- это один из главных факторов, учитываемых при обязательном подтверждении соответствия продукции требованиям безопасности. Внедрение системы ХАССП на предприятиях является необходимым условием экспорта товаров [26, 31, 65, 77, 97, 137, 141, 143, 148, 172, 204, 220, 221, 227, 231, 338, 397, 400, 443].
В соответствие с ГОСТ Р 51705.20-2001 [65] система ХАССП разрабатывается с учетом семи основных принципов: — идентификация потенциального риска или рисков (опасных факторов), которые сопряжены с производством продуктов питания, начиная с получения сырья (разведения или выращивания) до конечного потребления, включая все стадии жизненного цикла продукции (обработку, переработку, хранение и реализацию) с целью выявления условий возникновения потенциального риска (рисков) и установления необходимых мер для их контроля; — выявление критических контрольных точек в производстве для устранения (минимизации) риска или возможности его появления, при этом рассматриваемые операции производства пищевых продуктов могут охватывать поставку сырья, подбор ингредиентов, переработку, хранение, транспортирование, складирование и реализацию; — в документах системы ХАССП или технологических инструкциях следует установить и соблюдать предельные значения параметров для подтверждения того, что критическая контрольная точка находится под контролем; — разработка системы мониторинга, позволяющая обеспечить контроль критических контрольных точек на основе планируемых мер или наблюдений; — разработка корректирующих действий и применение их в случае отрицательных результатов мониторинга; — разработка процедур проверки, которые должны регулярно проводиться для обеспечения эффективности функционирования системы ХАССП; — документирование всех процедур системы, форм и способов регистрации данных, относящихся к системе ХАССП [15, 65, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 112, 136].
Система ХАССП обеспечивает контроль на всех этапах пищевой цепи: в любой точке процесса производства, при хранении и реализации продукции, где могут возникнуть опасные ситуации.
Особое внимание уделено необходимости предотвращения, устранения и снижения рисков до приемлемого уровня в результате целенаправленных мер контроля и корректирующих мероприятий.
Внедрение системы ХАССП нужно применить к поставщикам сырья и вспомогательных материалов, а также к системе оптовой и розничной торговли [4, 8, 9, 111, 151, 270].
Разработка и внедрение системы управления качеством на предприятии затрагивает все службы и весь персонал производства. Этот процесс не ограничивается оформлением документации и созданием внешнего подобия порядка.
Сущность системы ХАССП заключается в выявлении и мониторинге «критических точек» технологического процесса, то есть тех параметров, которые влияют на безопасность производимой продукции.
Система качества ХАССП включает в себя 11 разделов: введение и область распространения системы; политика руководства предприятия в области качества и безопасности выпускаемой продукции; приказ о создании рабочей группы по разработке системы ХАССП; информация о продукции; информация о производстве; виды опасностей; планово-предупреждающие действия; критические контрольные точки; рабочие листы ХАССП; внутренние проверки системы ХАССП; ведение документации ХАССП.
Система ХАССП обеспечивает контроль на всех этапах пищевой цепи, любой точке процесса производства, хранения и реализации продукции, где могут возникнуть опасные ситуации.
При этом особое внимание обращено на критические точки контроля, в которых все виды риска, связанные с употреблением пищевых продуктов, могут быть предотвращены, устранены и снижены до приемлемого уровня в результате целенаправленных мер контроля.
Разработка и внедрение системы управления качеством на предприятии затрагивает все службы и весь персонал производства. Критические контрольные точки определяются с помощью алгоритма, представленного на рисунке 1. [65] При этом проводили анализ по каждому учитываемому опасному фактору и рассматривали все операции, включенные в блок-схемы каждого технологического процесса. С целью сокращения числа критических контрольных точек без ущерба обеспечения безопасности к ним не относили точки, в отношении которых систематически осуществляются предупреждающие действия.
Обеспечение безопасности производственных и сточных вод
Пробы искусственно контаминировали микроорганизмами в концентрациях 102 – 103 м.к./мл. Аликвоты исследуемые образцов вносили в неселективные жидкие питательные среды и подращивали в течение 8-10 часов. Бактерии осаждали центрифугированием при 5000 g. Осадок суспендировали в Трис-ЭДТА буфере содержащем лизоцим, лизостафин и протеназу К. Дальнейшую очистку ДНК проводили с помощью детергента «Silico» и магнитосепарации. Полученную ДНК амплифицировали с неспецифическими гексануклеотидными праймерами и дезоксинуклеозидтрифосфатами, меченными биотином.
Полимеразную цепную реакцию проводили с помощью комплекта для амплификации ДНК включающего: - смесь для ПЦР - реакционная смесь для ПЦР референс-гена; - раствор ДНК-мишени - референс-ген, - раствор без ДНК-мишени - отрицательный контроль ПЦР (контроль контаминации); - Tag – pol (термостабильная ДНК-полимераза); - гексануклеотидный праймеры, меченные биотином Ампликоны гибридизовали с ДНК-зондами иммобилизованными на чипах из нитрацеллюлозы. ДНК-зонды получали в реакции амплификации с использованием коммерческих тест-наборов.
Пробы денатурированных ДНК-зондов иммобилизвали на чип по 1 – 1.5 мкл в виде точек при высокой ионной силе и температуре. Полученные меченные, с помощью рассеянной затравки, биотинилированнные ДНК контролируемых микроорганизмов гибридизовали с иммобилизованными на чипах ДНК-зондами.
Гибридизацию проводили с помощью тест-набора для гибридизации, который представлял собой комплект реагентов включавший: ДНК-зонд (№ 1), контрольный положительный образец (№ 2), контрольный отрицательный образец (№ 3), субстрат (№ 4), хромоген (№ 5), протеиназа К (№ 6), конъюгат (№ 7), раствор для гибридизации (№ 8), солевой раствор TS (№ 9), желатин 10% или сухой (№ 10), раствор для приготовления проявляющей смеси (№ 11), навеска солей для приготовления 20xССР (№ 12), блокирующий реагент (№ 13), раствор для лизиса (№ 14), лаурилсульфат натрия (SDS) 10% (№ 15), тритон Х-100 (№ 16), полиэтиленгликоль (№ 17), нитроцеллюлозный фильтр (№ 18).
Комплект рассчитан на проведение 80 анализов, включая 2 контрольных образца. Схема постановки реакции включала следующие этапы. Иммобилизованные ДНК-зонды гибридизовали с денатурированными биотинилированными ДНК, полученными в результате амплификации. Не связавшиеся зонды удаляли путем отмыки чипа. На следующем этапе чип обрабатывали конъюгатом стрептавидина с щелочной фосфатазой. Нa заключительном этапе вносили субстратный раствор. Окрашивание соответствующих точек свидетельствовало о наличии искомой бактериальной ДНК в исследуемом материале.
Перед проведением реакции готовили рабочие растворы: 1. Раствор 20xССР. Содержимое флакона («Навеска солей для приготовления 20xССР») растворяли в 27.0 мл дистиллированной воды. 2. Раствор 10xССР. 10.0 мл раствора 20xСCР разводили в 10 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивали. 3. Прегибридизационный раствор. К 3-м мл раствора для гибридизации добавляли 3 мл дистиллированной воды и 24 мкл раствора из микропробирки («Контрольный отрицательный образец»). Полученный раствор тщательно перемешивали. 4. Гибридизационный раствор. В 3-х мл прегибридизационного раствора растворяли содержимое флакона («Полиэтиленгликоль») и добавляли содержимое микропробирки («ДНК-зонд»), предварительно прогрев ее в кипящей водяной бане в течение 8 мин. 5. Отмывочный раствор № 1. К 10 мл раствора 20xСCР добавляли 2 мл раствора из флакона («Лаурилсульфат натрия 10%») и разводили дистиллированной водой до конечного объема 100 мл. Полученный раствор тщательно перемешивали. 6. Отмывочный раствор № 2. К 1 мл раствора 20xССР добавляли 2 мл раствора из флакона («Лаурилсульфат натрия 10%») и разводили дистиллированной водой до конечного объема 100 мл. Полученный раствор тщательно перемешивали. 7. Отмывочный раствор № 3. 2 мл раствора 20xССР разводили дистиллированной водой до конечного объема 20 мл и тщательно перемешивали. 8. Лизирующий раствор. Добавляли содержимое пробирки («Протеиназа К») во флакон («Раствор для лизиса») и тщательно перемешивали. 9. Раствор TST. Содержимое двух флаконов («Солевой раствор TS») растворяли в 200 мл дистиллированной воды и добавляли 0.1 мл тритона Х-100. 10. Блокирующий раствор. Содержимое пробирки («Блокирующий реагент») разводили в 22 мл раствора ТST, добавляли 3 мл желатина 10% из ампулы или приготовленный из сухого желатина (1г желатина растворяли в 10 мл воды; для быстрого растворения раствор можно подогревать и тщательно перемешивать).
Методики определения антигельминтных веществ в мясе, рыбе и продуктах их переработки на основе иммуномикрочиповой технологии с помощью тест-систем фирмы RANDOX, Великобритания
Система очистки с использованием гравия позволяет относительно хорошо снизить концентрации бактерий в зависимости от вида бактерий. Например, снижение общих колиформных бактерий достигает значений 6,3.101-1,6.102. Удаление E. Coli варьируется в диапазоне 7,9-8,0.101. При использовании этого метода обработки максимальная концентрация по Е. Coli, общим колиформным бактериям и фекальным колиформным бактериям в сточных водах составит соответственно 104, 103 и 45 КОЕ/100 мл.
Эксперименты, проведенные в пилотных исследованиях на том же типе системы показывают аналогичную эффективность. Получены результаты, превышающие 1,0.102 как для фекальных колиформных бактерий, так и для Entrocoques и даже для Salmonella. Однако, иногда отмечались гораздо более слабые результаты: Е. Coli порядка 3,2-7,9.
Единственные данные, представляющие низкую эффективность системы со слоем гравия, показывают снижение Giardia порядка 5,0 и Cryptosporidium порядка 4,0. Отметим, однако, что эти данные являются результатом третичной обработки стоков, в которых уже низка исходная концентрация паразитов (14 кисты/100 л и 13 ооцист/100 л), поэтому здесь наиболее трудно сократить их число.
В таблицах 48, 49 приведены эффективности системы со слоем гравия для различных микроорганизмов.
Микрокосм (1,25x0,3x0,25 м)Слой гравия + тростник E Coli 24,6 106 КОЕ/100 мл14,4 106 КОЕ/100 мл22,1 106 КОЕ/100 мл10,4 106 КОЕ/100 мл 14,4 106 КОЕ/100 мл6,4 106 КОЕ/100 мл10,4 106 КОЕ/100 мл2,9 106 КОЕ/100 мл 1,62,5Общ : 4,04,0Общ: 7,9
Слой гравия (лаборатория) Salmonellaзималето 1,6.108 КОЕ/100 мл2,5.108 КОЕ/100 мл 1.105 КОЕ/100 мл1,6.105 КОЕ/100 мл 1.103
Передвижной пилот тростник Объем:2,3x1,1x0,6 м,ГВП: 6 ч,12 ч,24 ч,48 ч E. Coli 1000 КОЕ/100 мл(при ГВПt 24 ч) Слой гравия, Объем: 0,4 л3Глубина 45 - 60 смРастения: Typha, Scerpus, Juncus Колиформные фекальныеEntrocoquesSalmonella 1.108 КОЕ/100 мл6,3.105 КОЕ/100 мл2,0.105 КОЕ/100 мл 1,6.105 КОЕ/100 мл3,2.105 КОЕ/100 мл2,5.103 КОЕ/100 мл 1.102
Слой гравия, Объем: 0,4 л3Глубина 45 - 60 смБез растения Колиформные фекальныеEntrocoquesSalmonella 1.108 КОЕ/100 мл6,3.105 КОЕ/100 мл2,0.105 КОЕ/100 мл 5,0.105 КОЕ/100 мл7,9.103 КОЕ/100 мл6,3.103 КОЕ/100 мл Ниже, чем в системе с растениями
Удаление микроорганизмов в экстенсивной системе с прудами, со слоем гравия или без, осуществляется посредством различных процессов: инактивация световым излучением, рН, хищничество нематодами и простейшими, воздействие токсинами бактерий и растений, конкуренция между микроорганизмами за питание, фильтрация и осаждение. В прудах с макрофитами, в основном, происходит процесс фильтрации и хищничества, поддержка корневой системы, позволяющая заполнять поверхность, на которой будут адсорбироваться микроорганизмы, благоприятные для развития хищников микроорганизмов. Ключевыми факторами для прудов УФ-излучение и осаждение по глубине пруда. Системы со слоем гравия, в свою очередь, являются благоприятными для фильтрации субстрата.
Освещенность: Механизм инактивации микроорганизмов в световом средневолновом УФ-излучении (290-320 нм) состоит в его поглощении непосредственно патогенами, что вызывает повреждения путем формирования двумерных пиримидинов (C4H4N2) в ДНК патогенных бактерий. Напротив, УФ-излучение в длинноволновой области спектра и видимое излучение используют другой процесс: длинные волны улавливаются с помощью фотосинтезеров, которые катализируют образование токсичных элементов для микроорганизмов, таких как кислород. Фотосинтезеры могут быть внеклеточными (гуминовые вещества) или внутриклеточными (флавопротеиды, порфирины …). Микроорганизмы ведут себя по-разному к действию световых лучей. Энтерококки, E. Coli и фекальные колиформные бактерии инактивируются в основном средневолновым УФ-излучением.
Величина рН: при воздействии на выживание микроорганизмов предел устойчивости бактерий по рН находится на уровне 9-9,5.
Хищничество: осуществляется в экстенсивной системе там, где устанавливаются природные экосистемы.
Хищничество будет функционировать, в основном, у простейших, жгутиковых и инфузорий; свободные амебы, нематоды и коловратки, действуют равным образом одинаково, но ограниченным образом. Некоторые инфузории заглатывают до 50 бактерий в час. Обычные концентрации инфузорий 600 шт/мл в межклеточной жидкости систем со слоем гравия, поэтому не удивительно наблюдать значительные концентрации микроорганизмов. Что касается других хищников, они способны поглощать до 250 бактерий в час (для амеб), 940 бактерий в час (для коловраток) и 350 бактерий в час (нематод). Эти хищники находятся под влиянием определенных условий, в частности, температуры и кислорода. Бактерии не являются единственными целями хищников, к мишеням можно отнести вирусы и паразиты. Что касается паразитов, то Cryptosporidium может быть проглоченной с показателем 2,6-3,0 ооцист/клеткой в минуту, в зависимости от типа инфузорий.
Бактериофаги также способны усваивать бактерии, уничтожая их путем лизиса. Выделение токсинов растениями и некоторыми бактериями - это другой процесс ликвидации микроорганизмов. Конкуренция между микроорганизмами за питательные вещества порождает также ликвидацию менее способных сообществ микроорганизмов.
Фильтрация микроорганизмов также известна как один из процессов микробиологической ликвидации в прудах, она осуществляется предварительно поверхностью корней.
Осаждение (седиментация) является важным фактором в процессе удаления микроорганизмов. Различные микроорганизмы адсорбируются на твердых частицах, которые, впоследствии, осаждаются на дно водоемов. Этот эффект подтверждается количеством микроорганизмов, которых гораздо больше в отложениях по сравнению с водой (бактерии).
На следующем этапе проведены исследования по оценки эффективность удаления микроорганизмов при четвертичной очистке Учитывая склонность хлора создавать канцерогенные соединени, он все менее и менее используется в системах очистки и даже запрещен в некоторых странах. Поэтому исследования по дезинфекционной обработке хлором в данной работе не рассматриваются. Обработка ультрафиолетовыми лучами По результатам работы установлено, что для снижения на 1.103 колиформных фекальных бактерий подаваемая доза УФ для передачи излучения в воду варьируется от 40 мВт.с/см2 до 100 мВт.с /см2.
Несмотря на большой разброс данных УФ-излучение является эффективным средством удаления всех микроорганизмов. Тем не менее, в некоторых случаях, метод требует больших доз излучения для того, чтобы достичь требуемого уровня эффективности. Это необходимо для сточных вод, содержащих более устойчивые микроорганизмы, например, простейшие, или при высокой концентрации микроорганизмов или большой концентрации взвешенных частиц, которые будет снижать передачу излучения.
Теоретическое и экспериментальное обоснование усовершенствование систем корректирующих мероприятий по очистке воды используемой на предприятиях по получению мяса, рыбы и продуктов их переработки
Наиболее эффективный метод уменьшения количества патогенов в питьевой воде заключается в одновременном их физическом уничтожении и обеззараживании воды. В большинстве случаев, правильно эксплуатируемая система сооружений очистки воды использует для этого классические процессы: фильтрацию, коагуляцию, флокуляцию и осветление. Реализация этих процессов обеспечивает возможность получения питьевой воды с незначительным риском инфекции, вызванной патогенными простейшими
В качестве химических дезинфицирующих средств, используемых для обработки питьевой воды, целесообразно имспользовать хлор, хлорамины, диоксид хлора и озон. При этом дезинфекцию необходимо проводить после очистки воды от твердых частиц и органических веществ, что позволяет обеспечить эффективность инактивации патогенов и сводит к минимуму образование побочных и вторичных продуктов дизинфекции.
Стратегия, ориентированная на последовательном использовании нескольких дезинфицирующих средств является эффективной для инактивации простейших и других микроорганизмов, присутствующих в питьевой воде. При этом УФ-излучение и хлор, могут использоваться как синергисты во время дезинфекции для инактивировации простейших, вирусов и бактерий. Как установлено, УФ-излучение является весьма эффективным для инактивации простейших и в меньшей мере для инактивации вирусов, а хлор является высоко эффективным для инактивации бактерий, но в меньшей мере для инактивации простейших. Анализ работы современных комплексных систем очистки показывает, что каждый из ее структурных элементов имеет самостоятельное функциональное назначение, причем от эффективности их работы зависит и результат очистки в целом. Однако не менее важной оказывается и оптимальное согласование режимов работы элементов системы в общей технологической схеме, т.к. между параметрами отдельных функциональных узлов существует тесная взаимосвязь и взаимовлияние. Так, качество осветления сточной воды в первичных отстойниках оказывает непосредственное влияние на эффективность и надежность работы аэротенков. В то же время, параметры биохимического процесса окисления загрязнений в аэротенках существенно влияют на качество разделения смеси сточной воды и активного ила во вторичных отстойниках. От эффективности же осаждения активного ила во вторичных отстойниках, зависит концентрация рециркулируемой и работающей в аэротенках биомассы микроорганизмов активного ила и, следовательно, - окислительная мощность аэротенков. Процесс очистки сточных вод не заканчивается сбросом их после осветления во вторичных отстойниках на природные ландшафты, т.к. в ряде случаев требуется их дальнейшая очистки (доочистка) с целью приведения параметров в соответствие с требованиями, предъявляемыми к водам, поступающим в хозяйственное использование. Поэтому при анализе эффективности работы системы комплексной очистки в целом необходимо учитывать корреляционную связь каждого из составляющих ее функциональных звеньев, функционирующих на протяжении всего технологического цикла «подача на обработку - механическая очистка - аэробная биологическая очистка – доочистка – обеззараживание - сброс в природный водоем».
Сформулированы научно-обоснованные требования к средствам дезинфекции, предназначенным для санитарной обработки различных объектов пищевой и перерабатывающей промышленности: широкий спектр антимикробного действия, медленное формирование резистентных штаммов микроорганизмов, безопасность для потребителя и окружающей среды, низкая токсичность, полное удаление с обработанных поверхностей после завершения дезинфекционной экспозиции, универсальность действия. Проведен широкий спектр исследований различных дезинфицирующих средств (хлор, йод, антиоксиданты, альдегиды), приведены критерии их оценки и даны рекомендации по их эффективному применению с точки зрения бактерицидного действия, исключения привыкания патогенов и коррозионного действия по отношению к конструкционным материалам. На основании проведеныых экспериментальных исследований для санитарной обработки на предприятиях пищевой промышленности целесообразно использовать моюще-дезинфицирующие средства, применение которых позволяет совместить в одной операции стадии мойки и дезинфекции, сократить продолжительность санитарной обработки и расход воды.
Установлено, что после проведения дезинфекции помещений с помощью биоцидных средств, содержащих поверхностно-активные вещества, последние могут негативно воздействовать и оставаться в воде, на поверхностях, помещений, оборудовании и в продукции. Показана эффективность применения иммуноферментных тест- систем для контроля ПАВ при проведении ветеринарной дезинфекции на живопноводческих комплексах и биопредприятиях. Предложенные нами системы предупреждающих и корректирующих мероприятий по обеспечению безопасности технологий получения мяса, рыбы и продуктов их переработки хорошо согласуются с отдельными аналогичными элементами обеспечения безопасности с данными других исследователей [143, 147, 158, 220, 255, 291, 326, 332, 393, 437, 493].