Введение к работе
Развертывание работ по химико-ферментативному синтезу генетического материала, исследований в области молекулярной биологии, генной диагностики и генной терапии Еыдвинуло задачу разработки опытно- промышленной технологии получения ферментов обмена нуклеиновых кислот и создание на их основе нуклеотидной базы.
Одним из перспективных направлений , позволяющих решить задачу создания экономичной промышленной технологии получения ферментных препаратов является:
унифицирование процедур фракционирования бесклеточных экстрактов;
разработка технологий, нацеленных на комплексное использование микробиологического, животного сырья, позволяющих получать целый ряд ферментных препаратов из одного образца биомассы в рамках единой технологической схемы.
Для опытно-промышленного производства нуклеотидов,нуклео-тидполифосфатов и полинуклеотидов наиболее целесообразно использование иммобилизованных ферментов. В связи с этим была поставлена задача разработки технологии получения данных соединений, основанной на применении биореакторов проточного типа с иммобилизованными ферментами.
В последнее время повысился интерес к экстрактам эмбриональных тканей высших животных как к перспективному источнику получения препаратов, используемых для лечения иммунных расстройств, онкозаболеваний,заболеваний крови и т.д. Фракционирование эмбриональных экстрактов с целью выделения из них препаратов широкого спектра действия, определения их молекулярной природы и выяснения механизма действия приобретает актуальное значение.
Цель работы. Основная цель исследований - разработка препаративно-технологической базы получения компонентов системы нуклеинового обмена:
а.Ферментная база
- исследование поведения ферментов биосинтеза нуклеиновых
кислот и их предшественников при фракционировании бесклеточных
экстрактов E.coli.Bacillus stearothermophillus.a также поведение
РНК-азы при фракционировании бесклеточного экстракта поджелудоч
ной железы. На основе этих исследований предстояло выбрать наибо
лее рациональные методы фракционирования упомянутых ферментов и
разработать перспективную для масштабирования комплексную технологию их очистки.
б.Компоненты нуклеиновых кислот и полинуклеотиды
- разработка опытно-промышленной технологии производства ри
бонуклеозиддифосфатов, дезокси- и рибонуклеозидмонофосфатов.а
karate полйрйбонуклеотидов"с ~исполь зованием-проточных-биореакторов —
с иммобилизованными ферментами.
Кроме того,целью работы было исследование биологических свойств эмбриональных экстрактов тканей птиц семейства Gallena-сіа, определение действующего начала эмбриональных экстрактов,обладающих высокой биологической активностью и разработка технологии получения препарата иммуностимулирующего действия.
Научная новизна и практическая ценность работы.
разработана и внедрена в опытное производство НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ "Вектор" комплексная технология одновременного получения ряда ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот и их предшественников (ДНК-полимераза I, фрагмент Кленова, ДНК-зависимая РНК-поли-мераза полный фермент, ДНК-зависимая РНК-полимераза минимальный фермент., полинуклеотидфосфорилаза, суммарный препарат нуклеоти-дилкиназ с ацетокиназой, суммарный препарат:нуклеозиодизоксирибо-зилтрансфераз) при фракционировании клеточного экстракта Е.сої і MRE-6Q0, а также термофильных ферментов (Вз^.полимераза .полинуклеотидфосфорилаза) при фракционировании клеточного ' экстракта Bac.stearothermophillus. Организовано серийное-производство указанных ферментов в объемах,обеспечивающих потребности более 300 научно-исследовательских организаций;
разработана и внедрена в опытное производство НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ "Вектор" технология получения- дезоксир'ибЪнуклеозид-5'- -трифосфатов с использованием суммарного препарата нуклеотидилки-наз с ацетокиназой,организовано их серийное-производство;
разработана новая эффективная технология" получения' нуклео-зиддифосфатов ферментативным фосфоролизом .природных РНК, основанная на применении проточного реактора с иммобилизованной полинуклеотидфосфорилазой из E.coli; ''.-'. ' ' '
разработана технология ферментативного получения полйрибонуклеотидов из рибонуклеозиддифосфатов, основанная на применении проточного реактора с иммобилизованной полинуклеЬтидфосфорилазой из E.coli. Новые технологии применены для производства противовирусного лекарственного препарата "Полудан".Организовано систематическое производство опытных образцов препарата "Полудан" для проведения клинических испытаний;
- разработана.новая высокоэффективная технология получения рибо- и дезоксирибонуклеозид-5'-монофосфатов ферментативным гидролизом природных нуклеиновых кислот, основанная на использовании проточного реактора с иммобилизованной S'-нуклеазой из Aspergillus orizae.
Получаемые по разработанной технологии препараты ферментов и нуклеозидполифосфатов используются в качестве компонентов наборов реагентов для ник-трансляции,мульти-праймер-трансляции и секвени-рования. Наборы серийно производятся в Опытном производстве НИКТИ БАВ ГНЦ "Вектор" и регулярно поставляются заказчикам.
' Разработана новая эффективная комплексная опытно-промышленная технология получения лекарственного препарата "РНК-аза аморфная", основанная на использовании в качестве сырья отходы производства инсулина.
Впервые установлено, что эмбриональные экстракты птиц семейства Gallenacia обладают иммуностимулирующим действием. Показано, что иммуностимулирующее действие эмбриональных экстрактов тканей птиц определяется пулом поли-А-мРНК. На основе полученных данных разработана технология получения препарата "Фагостим",обладающего иммуностимулирующими,гепатопротекторными и адьювантными свойствами.
Апробация работы. Отдельные части работы доложены и обсуждены на Всесоюзных конференциях с международным участием "Методы получения и анализа биохимических препаратов"(Рига,1982),"Мембранные процессы в биотехнологии,медицине и пищевой промышленности" (Москвал991)."Новые фармакологические средства в ветеринарии" (С. Петербург ,1995) ."Перспективы развития производства биопрепаратов для медицины и сельского хозяйства"(Степногорск,1995).По материалам работы получено 3 патента и 5 авторских свидетельства, опубликовано 15 статей в научных журналах.
Структура диссертации. Диссертация содержит 265 страниц машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, 5 глав собственных исследований , выводов и приложения. Список цитируемой литературы включает 274 источников. Работа иллюстрирована 68 рисунками и 33 таблицами.
Работа выполнена в соответствии с выполнением Отраслевой научно-технической программой "Ферментная бага", а также с планом научно-технических работ научно-исследовательского конструкторе-
ко-технологического института биологически активных веществ (НИКТИ БАВ) ГНЦ ВБ "Вектор" по темам "Совершенствование технологии получения рибонуклеази аморфной"(регистрационный номер ВК-4588);,"Разработка препарата Полудан на основе отечественных компонентов" [регистрационный номер ВП-4,(1,4)3 и "Определение молекулярной— природы -БАВ -ИЗ-змбриональши_тканей_птиц и_изучение^ их иммунотропного действия" [регистрационный номер ВФ-33 (2.10)].