Содержание к диссертации
Введение
1. Общая характеристика работы .
2. Обзор литературы .
2.1. Особенности возобновляемого северного сырья с повышенным содержанием и более широким спектром разнообразия физиологически активных веществ (ФАВ) .
2.2. Биолого-биохимическая характеристика лишайников р. Cladonia ..
2.2.1. Особенности анатомо-морфологического строения и произрастания лишайников
2.2.2. Химический состав лишайников рода Cladonia
2.2.3. Применение лишайников рода Cladonia в пищевой промышленности .
2.2.4. Применение лишайников рода Cladonia в медико-биологической практике .
2.2.5. Запас биомассы лишайникового сырья и особенности его восстановления – основа для разработки экологически сберегающей технологии его заготовки
2.3. Использование современных механохимических биотехнологий с целью повышения биодоступности действующего лекарственного вещества.
2.3.1. Механическая активация твердых веществ
2.3.2. Формирование механокомпозитов и поверхностных комплексов.
2.3.3. Механохимический синтез .
2.3.4. Изменение биологической активности .
2.3.5. Выделение активных компонентов при переработке растительного сырья.
2.4. Заключение по обзору литературы
3. Материалы и методы исследования
3.1. Объекты исследования .
3.2. Методы исследования
3.2.1. Физико-химические методы исследования .
3.2.2. Биологические методы
3.2.2.1. Определение биологической активности in vitro
3.2.2.2. Определение физиологической активности in vivo .
3.2.3. Клинические методы исследования в эндокринологической практике .
Результаты и обсуждение
4. Химические, экологические и потребительские характеристики лишайникового сырья и продукта его механохимической переработки
4.1. Микроэлементный состав лишайникового сырья и продукта его механохимической переработки .
4.2. Химический состав лишайника и механоактивированных комплексов на его основе
4.3. Потребительские характеристики ягеля механоактивированного .
4.4. Технология сбора лишайникового сырья .
5. Механохимическая технология получения наполнителя из лишайникового сырья и комплексов бад на его основе, обладающих повышенной биодоступностью дв и детоксикационной функцией .
5.1. Особенности механохимической технологии переработки лишайников .
5.2. Эффекты повышения биодоступности ДВ и сорбционной активности наполнителя (in vitro) 5.2.1. Повышение биологической активности действующих веществ .
5.2.2. Сорбционная активность лишайникового наполнителя .
5.3. Эффекты повышение биодоступности ДВ и сорбционной активности наполнителя (in vivo)
5.3.1. Изучение адаптогенных свойств биокомплекса лишайник:родиола
5.3.2. Изучение физиологических свойств биокомплекса лишайник:ВМЭК
5.3.3. Экспериментальные токсикологические испытания БАД «Ягель Детокс»
5.3.4. Клинические эндокринологические испытания БАД «Ягель Детокс»
6. Применение биологически активной добавки из механоактивированных слоевищ лишайников в агропромышленном комплексе при заготовке, переработке сельскохозяйственной продукции и доведении ее до потребителя
6.1. Получение соков и других жидких пищевых продуктов повышенного срока хранения .
6.2. Хлебобулочные изделия повышенного срока годности и оздоровительной направленности
6.3. Перспектива использования БАД «Ягель Детокс» в ветеринарной практике .
7. Выводы
8. Практические предложения .
9. Список сокращений
10. Список литературы
- Биолого-биохимическая характеристика лишайников р. Cladonia
- Биологические методы
- Химический состав лишайника и механоактивированных комплексов на его основе
- Эффекты повышение биодоступности ДВ и сорбционной активности наполнителя (in vivo)
Введение к работе
1.1. Актуальность работы
Известно, что ежегодные потери средств здравоохранения в мире вследствие низкой биодоступности и токсичности лекарственных средств составляют более 65 млрд. долл. В связи с этим задача получения эффективных систем доставки, в том числе наполнителей (подложек) для твердых лекарственных форм (ТЛФ) лекарственных и биопрепаратов медицинского/ветеринарного назначения с целью повышения биодоступности действующего вещества (ДВ) является актуальной и решить ее можно с привлечением как новых сырьевых источников так и новых экологически чистых и ресурсосберегающих технологий их переработки. При привлечении новых сырьевых источников для создания в стране высокотехнологичной отрасли, как отмечено в Комплексной программе развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 года, актуальным является переход от использования невозобновляемых ресурсов к возобновляемому сырью.
Актуальность исследования обусловлена также тем, что в условиях повышения уровня неблагоприятных стресс-факторов, особенно в условиях действия экстремальных климатических и техногенных нагрузок, один из наиболее эффективных подходов корректировки различных патологических состояний для повышения адаптивного потенциала предполагает стадию детоксикации внутренних сред организма в отношении экзо- и эндотоксинов. В связи с этим ведущая роль принадлежит созданию комплексных высокотехнологичных лекарственных средств, биологически активных добавок (БАД) на основе наполнителя из возобновляемого сырья, который бы повышал биодоступность действующего вещества (ДВ), обладал и детоксикационной функцией, а также мог служить источником различных физиологически активных веществ (ФАВ).
Процесс создания новых лекарств, БАД является длительным и требует больших вложений - именно поэтому актуальным является поиск путей повышения биодоступности уже известных существующих ДВ. Одним из наиболее перспективных направлений для решения этого вопроса является подход, который основан на создании комплексных высокодисперсных лекарственных препаратов «ДВ-наполнитель» [Толстикова Т.Г. и соавт., 2007; Дембицкий В.М. и соавт., 2005; Ломовский О.И. и соавт., 1999, 2010] [Шахтшнейдер Т.П. и соавт., 2013]с использованием механохимических технологий.
1.2. Степень разработанности проблемы.
Известно, что для повышения растворимости ДВ различной природы могут служить матрицы или носители. Например, плохорастворимое нестероидное противовоспалительное лекарство ибупрофен может быть растворено благодаря реакции как с органическими, так и с неорганическими носителями [Ягодин Ю.А. и соавт., 1991]. Также известен метод получения твердых растворов некоторых лекарственных веществ в высокоэффективных механических активаторах [Boldyrev V.V. et al, 1993]. Например, механохимическая обработка сульфатиазола с поливинилпирролидоном переводит кристаллическое вещество в аморфное состояние. Процесс сопровождается образованием водородных связей между молекулами сульфатиазола и полимерной матрицей. Растворимость препарата меняется вместе с весовым содержанием полимера. [Бабиевская Е.К. и соавт., 1993; Boldyrev V.V. et
al, 1994]. Механохимическая активация противогрибкового лекарственного средства гризеофульвина с некоторыми носителями (хитозан, картофельный крахмал, полиэтиленгликоль) увеличивает растворимость и биодоступность вещества. Концентрация гризеофульвина в крови кроликов, получавших механохимически активированный препарат, повышается в 1,5 раза [Бабакина С.Г. и соавт., 1991].
Созданные таким путём лекарственные композиции имеют существенно меньшую терапевтическую дозу активно действующей субстанции, следовательно, менее токсичны. Привлекательность предложенного подхода состоит еще и в том, что используются композиции известных, клинически обстоятельно апробированных препаратов.
Недостатком используемых наполнителей является тот факт, что во время механоактивации лекарственные субстанции подвергаются лишь «диспергированию» в подложку. Последняя, обычно не обладая базовой активностью, служит для того, чтобы в комплексе с ДВ, обеспечить ему защиту от метаболических превращений (инактивации), более совершенный транспорт и повышенное сродство к рецепторам. Кроме того, известные предлагаемые наполнители являются, как правило, веществами синтетического происхождения. Среди природных наполнителей, которые могут быть использованы в различных композициях, значительный интерес представляют арабиногалактан, пектин и хитозан, обладающие разнообразной биологической активностью, нетоксичностью, способностью к биодеградации [КоптяеваЕ.И., 2013].
В качестве альтернативного источника для создания полифункционального наполнителя из возобновляемого сырья для ТЛФ механохимической технологией выбраны относительно малоисследованные объекты лишайники рода Cladonia, произрастающие в Республике Саха (Якутии), содержащие ФАВ широкого спектра действия. Однако, несмотря на положительный опыт использования лишайников во многих разделах клинической медицины, АПК [Кершенгольц Б.М. и соавт., 2005, 2010; Кравченко О.Ю. и соавт., 2010; Сафонова М.Ю., 1999, 2002; Содномова Л.Б. и соавт., 2003], ограниченность их применения обусловлена тем, что известные широко применяемые традиционные технологии выделения ФАВ из слоевищ лишайников не всегда дают желаемый результат.
Вместе с тем, во-первых, сами лишайники, обладая повышенной сорбционной активностью, могут в больших количествах сорбировать тяжелые металлы и радионуклиды при произрастании в экологически неблагоприятных условиях. Во-вторых, в слоевищах лишайников значительная часть потенциально ФАВ содержится в связанном виде (в том числе Р-сахариды находятся в виде очень прочных, негидролизуемых (3-полисахаридов) и лишь небольшая их часть может находиться в биологически доступной форме.
Разрабатываемые и используемые механохимические биотехнологии использования лишайников в целях создания комплексных БАД, должны соответствовать следующим требованиям:
экологической чистоты лишайникового и другого используемого биосырья;
экологической чистоты и ресурсосбережения технологий;
сохранения возобновляемости в природе после заготовки слоевищ лишайников.
1.3. Цель и задачи исследований.
Целью работы является разработка инновационных комплексных препаратов на основе возобновляемого природного сырья Республики Саха (Якутия) - слоевищ лишайников p. Cladonia с различными действующими веществами (ВМЭК, антибиотиками) и ФАВ лекарственных растений {Rhodiola rosea L., Rhododendron aureum) для профилактики и лечения социально-значимых, инфекционных заболеваний и применения их в ветеринарии и АПК.
Задачи исследования:
Разработать наполнитель для твердых лекарственных форм из возобновляемого сырья - слоевищ лишайников p. Cladonia, повышающий доступность ДВ и обладающий детоксикационной фукцией.
Разработать комплексные биологически активные добавки «Наполнитель-ДВ» широкого спектра действия: адапто генной, антибактериальной, гипогликемической направленности.
- Изучить экологические аспекты произрастания лишайников рода Cladonia в Якутии
с целью их последующего биотехнологического передела.
Изучить механизмы формирования полифункциональных свойств (базовые терапевтические и детоксикационные свойства) комплексных БАД на основе лишайникового наполнителя, полученных механохимической биотехнологией.
Провести доклинические и клинические испытания разработанных БАД, доказывающие их детоксикационное и одновременно высокоэффективное биологические (в том числе терапевтическое) действия.
- Рассмотреть применение ягеля порошкообразного нанодисперсного для переработки
продукции агропромышленного комплекса с целью получения продуктов питания
повышенного срока годности, оздоровительной направленности и в ветеринарной практике в
качестве кормовой добавки.
- Организовать опытно-промышленное производство, разработать разрешительную
документацию на продукцию, рекомендуемую к внедрению в медико-
биологическую/ветеринарную практику и агропромышленный комплекс.
1.4. Научная новизна.
Научно обоснована концепция создания инновационных комплексных препаратов для профилактики и лечения социально-значимых, инфекционных заболеваний и применения их в ветеринарии и АПК на основе возобновляемого природного сырья Республики Саха (Якутия) - слоевищ лишайников p. Cladonia с различными действующими веществами (ВМЭК, антибиотиками) и ФАВ лекарственных растений {Rhodiola rosea L., Rhododendron aureum) их совместной механохимической активацией.
Разработан наполнитель для твердых лекарственных форм из возобновляемого сырья - слоевищ лишайников механохимической технологией, которая приводит к деструкции части лишайниковых [3-полисахаридов до более доступных [3-олигосахаридов [Ноу-хау
«Способ получения био- и фармпрепаратов» зарегистрировано в ФГАОУ ВПО СВФУ за №1398 - ОД от 29.12.2012.].
Доказано, что физико-химические и технологические свойства нанодиспесного порошка механоактивированных слоевищ лишайников позволяют использовать его в качестве наполнителя для создания на его основе комплексных БАД широкого спектра действия: противомикробных, витаминных препаратов, иммуномодуляторов, адаптогенов с уменьшенной дозой ДВ при сохранении терапевтического эффекта [Патент RU № 2477143 С1 от 26.10. 2011; Патент RU № 2467063 С1 от 05.05. 2011].
Теоретически обоснован механизм действия наполнителя природного происхождения из возобновляемого лишайникового сырья, который за счет расширения спектра действия, входящих в его состав лишайниковых Р-олигосахаридов, обладает детоксикационной функцией и обеспечивает повышение общей доступности лекарственного средства [Патент RU № 2464997 С1 от 20. 07. 2011].
На основании анализа химического состава и анатомо-морфологических характеристик лишайников рода Cladonia, произрастающих на территории Республики Саха (Якутии), как биосырья, обоснована целесообразность, эффективность и экологическая безопасность его биотехнологического использования.
Доказано, что биологически активная добавка из механоактивированных слоевищ лишайников при добавлении ее в соки, хлебобулочные изделия, другие пищевые продукты в концентрациях 0,1-1% позволяет в таких сферах агропромышленного комплекса, как заготовка, переработка сельскохозяйственной продукции, доведение ее до потребителя получать продукты повышенного срока хранения и оздоровительной направленности [Патент RU № 2437582 С1 от 16.04.2010; Патент RU № 2466542 С1 от 15. 04. 2011].
1.5. Практическая значимость работы.
Разработана экологически безопасная технология получения высокоэффективных БАД в виде ТЛФ на основе лишайникового сырья.
Разработана экологичная ресурсосберегающая технология сбора слоевищ лишайников рода Cladonia, учитывающая особенности восстановления лишайников в условиях Севера и ареалы их произрастания, предполагающая сбор на таежных территориях произрастания, где наименьший процент выпаса оленей (до 7%), срезание в ходе заготовки лишь одной трети подеция, в результате чего период восстановления исходной биомассы не превышает 8 лет.
Полученные в ходе выполнения данной работы наполнитель и БАД на его основе представляют большой практический интерес для переработки продукции агропромышленного комплекса с целью создания продуктов питания повышенного срока годности и оздоровительной направленности, востребованы для лечения социально-значимых заболеваний, так как увеличение эффективности лекарственных средств позволит, как увеличить качество жизни пациентов, так и уменьшить государственные расходы на лечение социально-значимых заболеваний.
Разработаны нормативные документы (ТУ, ТИ), получены Свидетельства о государственной регистрации на сырье для БАД «Ягель порошкообразный ультрадисперсный» и БАД «Ягель-Детокс».
Организовано малое инновационное предприятие ООО «Механохимические биотехнологии» в котором внедрены в производство результаты исследований.
Результаты научных исследований по разработке механохимической биотехнологии создания БАД лечебно-профилактического и пищевого назначения на основе лишайникового сырья используются в учебном процессе по дисциплинам специализации направления бакалавриата «Химическая технология» и специальности «Фундаментальная и прикладная химия» в ФГАОУ ВПО «Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Аммосова».
1.6. Положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Технологическая схема механохимической переработки возобновляемого
лишайникового сырья, которая позволяет получать наполнитель с рядом преимуществ:
- процесс получения более доступных лишайниковых Р-олигосахаридов из
лишайниковых Р-полисахаридов протекает без участия растворителей, в одну
технологическую стадию;
- технология получения наполнителя и комплексных биологически активных добавок
на его основе отличается высокой степенью экологичности и ресурсосбережения.
- универсальность как технологии так и наполнителя позволяет создавать
комплексные БАД широкого терапевтического спектра, минимизировав число
технологических стадий, и тем самым технологический процесс легко перестраивать с
выпуска одного вида продукции на другой.
-
Разработанные комплексные биологически активные добавки «Наполнитель-ДВ» медицинского/ветеринарного назначения, полученные с применением механохимической технологии, сохраняют терапевтический эффект при уменьшенной дозе действующего вещества в 2,5-3 раза.
-
Слоевища лишайников рода Cladonia, собранные по технологии, позволяющей срезать 1/3 подеция, оптимизируя тем самым период восстановления исходной биомассы, могут служить экологически безопасным возобновляемым источником для использования их в качестве возобновляемого биосырья с целью создания наполнителя для ТЛФ и комплексных БАД на его основе.
-
Механизм действия наполнителя природного происхождения из возобновляемого лишайникового сырья, который наряду с детоксикационной функцией обеспечивает и повышение общей доступности лекарственного средства обеспечивается расширением спектра действия входящих в его состав лишайниковых Р-олигосахаридов.
-
Применение в агропромышленном комплексе биологически активной добавки из механоактивированных слоевищ лишайников в концентрациях до 1% по массе позволяет при заготовке, переработке сельскохозяйственной продукции и доведения ее до потребителя получать продукты повышенного срока хранения и оздоровительной направленности.
1.7. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы представлены на международных и Всероссийских конференциях, конгрессах и выставках: семинаре ДВФО «От инновационных образовательных программ вузов ДВФО к Инновационному образовательному пространству Дальнего Востока России» (2007, г. Владивосток), Международной научной конференции «Экспериментальная и клиническая фармакология» (2009, г. Минск), Международной научной конференции «Международный полярный год: достижения и перспективы развития циркумполярной медицины» (2009, г. Архангельск), Международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию Всероссийскому научно-исследовательскому и технологическому институту биологической промышленности (2009, г. Щелково), X Московском Международном салоне инноваций и инвестиций «Инновации и инвестиции для модернизации и технологического перевооружения экономики России» (2010, г. Москва, Золотая медаль Салона), Международной конференции с элементами научной школы для молодежи «Инновационные материалы и технологии в химической и фармацевтической отраслях промышленности» (2010, г. Москва), 1-ой и П-ой Международных научно-практических конференций «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (2010, 2011, г. СПб.), IX международном симпозиуме по развитию холодных регионов ISCORD (2010, г. Якутск,), Международных конгрессах «Мир биотехнологии» (2009, 2011, 2014, г. Москва), Всероссийской конференции с международным участием «Биомедицинская инженерия и биотехнология» (2010 г., г. Курск), VI, VII Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ» (2010, г. СПб., 2013, г. Калининград), Международной конференции «Биофарма-2011» (2011, г. Тель-Авив), Международной научно-практической конференции «Достижения, инновационные направления, перспективы развития и проблемы современной медицинской науки, генетики и биотехнологий» (2011, г. Екатеринбург), 1st international symposium on secondary metabolites: Chemical, biological and biotechnological properties (2011, Denizli, Turkey), Выставке «Rusnanotech Ехро'2011» в рамках Четвертого Международного форума по нанотехнологиям ( 2011, г. Москва), Всероссийской выставке-конференции инновационных решений для воспроизводства, функционирования и целесообразного развития живых организмов и среды их обитания «Биоиндустрия» (2011, г. СПб, Золотая медаль; 2013, г. СПб, Золотая медаль;), Всероссийской научно-практической конференции «Живые системы и конструкционные материалы в условиях криолитозоны» (2011, г. Якутск), Международном биотехнологическом форуме - выставке «РосБиоТех» (2011 г. г. Москва, Золотая медаль, 2013, г. Москва, Золотая медаль), Международной конференции «The introduction of intergrated models of educational institutions, implementing educationalprograms at various levels of education» (2011, Singapore) Международной конференции «Современная биология: вопросы и ответы (2012, г. СПб.), Международной интернет конференции «Биотехнология - взгляд в будущее» (2012, 2013, 2014, г. Казань), Межрегиональной конференции «Питание - основа образа жизни и здоровья населения в условиях Севера» (2012, г. Якутск), Международной конференции «Adaptive Strategies of Living Systems»
(2012, 2013, Ukraine), II Всероссийской конференции с международным участием «Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и Дальнего Востока» (2012, 2014, г. Улан-Удэ), The 8th Busan Active Aging Conference in Asia Pacific (2013, r. Busan, Korea,) Международной выставки «OPEN INNOVATION EXPO» (2013, г. Москва), II Межгосударственном форуме государств - участников СНГ «Здоровье населения - основа процветания стран Содружества» (2013, г. Москва,), Международной ярмарке изобретений SIIF (2013, г. Seul, Korea, Серебряная медаль), Первой научно-практической конференции «Медицинское обеспечение спорта высших достижений» (2014, г. Москва,), X Международном салоне изобретений и новых технологий «Новое время» (2014, г. Севастополь) и др.
-
Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликовано 82 работы, в т.ч. 34 публикации в журналах из перечня, рекомендованного ВАК Минобрнауки России для публикации материалов докторских диссертаций, 6 патентов, 1 монография, 4 учебных пособия.
-
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 251 странице, содержит 37 рисунков, 40 таблиц и состоит из следующих разделов: общей характеристики работы, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 316 цитируемых источника, приложений.
-
Личный вклад автора заключается в постановке цели и задач исследований, обосновании путей решения поставленных задач, непосредственном планировании экспериментов и выполнении исследований, обобщении и интерпретации результатов, разработке нормативной документации. Аныпакова Вера Владимировна принимала личное участие в изготовлении и контроле опытных серий препаратов, в подготовке научных публикаций и разработке учебно-методических пособий.
-
Достоверность полученных результатов подтверждается большим объемом материала, использованием методик, адекватных поставленным задачам и применением современных методов статистического анализа и соответствием теоретических данных с полученными результатами экспериментов и опытно-производственных испытаний. Обоснованность научных выводов и положений не вызывает сомнений. Выводы объективно и полно отражают результаты проведенных исследований.
Биолого-биохимическая характеристика лишайников р. Cladonia
До недавнего времени сырьевая база Якутии для биофармацевтической промышленности использовалась очень незначительно. Возможно, этому способствовало бытовавшее теоретическое представление, согласно которому содержание ФАВ в растениях закономерно снижается с возрастанием Географической широты места произрастания [Макаров А.А., 1989]. В свете этого представления, именуемого широтной теорией формирования физиолого-биохимических особенностей растений, поиски во флоре якутского региона, характеризующегося крайне суровыми природными условиями, сколько-нибудь действенных лекарственных растений представлялось заведомо бесперспективным делом.
Начиная с 40-50-х годов XX столетия, в Якутии начали проводиться широкие биохимические исследования с целью выявления региональных особенностей химического состава и питательной ценности местных кормовых растений. Наряду с основным, белково-углеводным обменом растений, изучались их микроэлементный и минеральный состав, вопросы физиологии, а также биосинтеза в растениях ФАВ – витаминов, алкалоидов, сапонинов, танинов и др. [Егоров А.Д. и соавт., 1945; Егоров А.Д., 1954, 1969; Сергеев А.В., 1954; Макаров А.А., 1962, 1963, 1965, 1969, 1970, 1972, 1975, 1989; Самарин В.П., 1962, 1965а, 1965б; Слепцова Л.В., 1971, 1972, 1977; Говоров П.М., Торговкина Е.Е., 1974; Габышев М.И., 1977; Соболева К.П. и соавт., 1977; Попова А.С., 2003; Гантимур Д., 1986]. Большой вклад в изучение роли климата на образование растениями различных химических веществ внес Н.И. Шарапов [1954, 1962]. В своих работах он показал, что влияние климата очень многосторонне и разнообразно. Им были сформулированы основные положения широтно-климатической (ландшафтно-климатической) теории биосинтеза веществ в растениях. Эта теория получила широкое распространение и признание. Согласно Н.И. Шарапову не все факторы внешней среды имеют одинаково важное значение для растений. Признавая исключительную роль фактора влаги, автор пришел к следующему заключению: оптимальные или умеренные температуры окружающей среды (воздуха, почвы) и полная обеспеченность влагой способствуют созданию и накоплению запасных безазотистых веществ в растениях, в частности сахаров, крахмала, жира или масла, клетчатки и пр. Наоборот, высокая температура окружающей среды, относительный недостаток влаги, сухость воздуха и почвы в течение вегетационного периода стимулируют образование и накопление белковых веществ (в том числе белков регуляторного действия) и менее благоприятны для синтеза углеводов.
В этом отношении Якутия является уникальным примером совместного действия климатических стресс-факторов на растительные и животные организмы. Наиболее яркими климатическими особенностями Якутии [Гаврилова М.И., 1998] являются: - Сочетание суровой продолжительной и малоснежной зимы с коротким, но относительно теплым и засушливым летом. По абсолютному минимуму (-600С) и годовой амплитуде температур (1020С) Якутия не имеет аналогов в северном полушарии. Это связано с высокой прозрачностью атмосферы и малой облачностью, способствующих быстрому повышению или снижению температуры воздуха, а значит, возникновению частых осенних и весенних заморозков. Например, весна в Якутии на 2 недели короче, чем в Свердловской и Архангельской областях. Снег тает быстро, большая часть влаги испаряется (возгоняется) солнечным теплым днем или холодной ночью, за счет вымораживания при резком усилении ветра. Превышение температуры воздуха отметку +50С (вегетативная весна) устанавливается во второй половине мая и заканчивается в середине сентября. Весенние заморозки, которые сопровождаются интенсивным охлаждением почвы, бывают до первой половины июня, а с 15-20 августа отмечаются осенние. Продолжительность безморозного периода (Центральная Якутия) в среднем колеблется от 75 до 90 дней, а период благоприятный для вегетации растений составляет 60-80 дней [Гаврилова М.И., 1998].
По интенсивности солнечной радиации Якутск не уступает г. Ташкенту и Феодосии, то есть радиационный баланс в целом благоприятен для нормального развития растений. Однако, резкое нарастание солнечной радиации в начале вегетации растений (май), приводит к отрицательному эффекту за счет дисбаланса между необходимым для транспирации растений количеством воды и ее медленным поступлением к корням при пониженных температурах почвы. Продолжительность солнечного сияния в июне-июле не менее 18 часов в сутки. Средняя температура июля + 18-190С (абсолютный максимум 380С), а января - 35-400С. Теплозащитная роль снегового покрова, несмотря на небольшую высоту, очень значительна, что имеет огромное значение для зимующих растений. Продолжительность залегания устойчивого снежного покрова составляет около 200 дней. - Одним из главных лимитирующих факторов для произрастания растений является влага. По количеству осадков Якутия приближается к степным и полупустынным районам. Особенно засушливой бывает первая половина лета; основная часть осадков выпадает во второй половине лета и осенью. Осадков в г. Якутске за май - июнь выпадает 51 мм, а за июль-август - 85 мм [Гаврилова М.И., 1998].
К неблагоприятным климатическим условиям летом относятся суховеи, которые снижают тургор листьев, приводят к торможению ассимиляции и роста растений. Относительная влажность воздуха летом составляет в среднем 30-50%. Это способствует интенсивному испарению влаги из верхнего почвенного слоя. - Якутия расположена в области повсеместного распространения многолетнемерзлых грунтов. Они оказывают сильное влияние на почвенный климат, рост и развитие растений, создают очень своеобразную динамику частичной сезонной оттайки и водного режима.
Биологические методы
Отмечалось, что изменение реакционной способности механически обработанных твердых веществ часто нельзя объяснить только изменением размера частиц. Например, площадь поверхности порошка сульфамонометоксина [Савицкая А.В. и соавт., 1990а, 1990б] увеличивается при обработке в 6 раз, тогда как скорость растворения лекарства увеличивается в 8,6 раз. Удивительно, что с коэффициентом 1,4 увеличивается и растворимость, с термодинамической точки зрения равновесная растворимость должна оставаться постоянной. Число мышей, выздоровевших через 10 дней после введения механически активированного сульфамонометоксина, вдвое выше, чем в контрольной группе. Свойства алкалоидов растительного происхождения изменяются после механической обработки [Халиков С.С., Арипов Х.Н., 1995]. Механическая активация может изменять каталитическую активность белковых ферментов. Необратимая механическая инактивация наблюдалась после обработки порошков некоторых протеаз, таких как трипсин и субтилизин [Чижиков Д.В., Балабудкин В.А., 1995]. Некоторые данные указывают на конформационные изменения в молекуле белка как причину эффекта. Биологическое действие тималина (комплекс полипептидов с иммуно-модулирующим действием) увеличивается при механической обработке [Орел В.Э. и соавт., 1994]. Коэффициент увеличения зависит от дозы поглощенной механической энергии и изменяется в 8 раз [Орел В.Э. и соавт., 1993, 1997]. Причины эффекта неясны, возможно, что необратимые изменения в структуре тималина способствуют увеличению иммунного ответа. В любом случае эффект имеет большую практическую ценность [Орел В.Э. и соавт., 1993, 1997].
Антиканцерогенный эффект антрациклинового антибиотика доксорубицина может быть усилен механической активацией [Орел В.Э. и соавт., 1998]. Обработка ведет к разупорядочению вторичной структуры антибиотика, связанной со взаимным расположением молекул, и к активации процессов с участием свободных радикалов, разрушающих раковые клетки [Орел В.Э. и соавт., 1998]. О причинах изменения биологической активности механически активированных лекарств известно очень мало. Поэтому в этой области особенно важны экспериментальные данные.
Экстракция – обязательная стадия производства лекарств из растительного сырья. Практика показывает, что существует оптимальный размер частиц порошка растительного сырья, который обеспечивает полноту извлечения и чистоту продукта. Основная часть биологически активных веществ растения находится в клетках. Для максимально эффективной экстракции клетки должны быть разрушены. Использование механической обработки эффективно для экстракции из кожуры апельсина таких нерастворимых флавоноидов, как гесперидин и диосмин [Бандюкова В.А. и соавт., 1995].
Скорость экстракции и выход продукта определяются диффузией растворителя в частицах растительного сырья. Механическая обработка может использоваться для ускорения диффузионных процессов. Обработка сырья непосредственно в растворителе позволяет упростить экстракционный процесс, уменьшить затрачиваемое на экстракцию время в несколько десятков раз. Примером может служить экстракция кумаринов этиловым спиртом [Балабудкин И.А., Агаев Е.И., 1993]. Некоторые биологически активные вещества невозможно или неприемлемо дорого синтезировать. Высокая цена алкалоидов и гликозидов растительного происхождения – результат их низкого содержания в сырье и сложности промышленной технологии извлечения. Общепринятая технология производства лекарственных веществ из растительного сырья – многоступенчатая экстракция. Сырье обрабатывается рядом органических растворителей различной полярности. Разбавленные растворы извлеченного вещества концентрируются в твердый экстракт, используемый как активная составляющая лекарства. Технология твердофазной механохимической экстракции состоит из механической обработки порошковых смесей растительного сырья и твердых адсорбентов различной химической природы. Биологически активное вещество в условиях механической обработки перемещается по частице сырья, сорбируется на адсорбенте и может быть легко выделено, сконцентрировано и высушено [Lomovsky О., 1993]. Эффективность технологии демонстрируется на выделении дитерпеновых акалоидов из Aconitum и сесквитерпеновых лактонов из Inula helenium. Селективность механохимической экстракции, превышающая селективность выделения путем жидкостной экстракции, показана на выделении сердечных гликозидов из желтушника Сheranthoides [Ломовский О.И. и соавт., 2004]. Показано, что в результате механической обработки смеси алкалоида и твердого адсорбента с кислотными центрами на поверхности происходит образование солевых форм алкалоида [Ломовский О.И., 1997]. Растительное сырье – сложный комплекс химических веществ, содержащий соединения как растворимые, так и нерастворимые в воде. Данное обстоятельство сильно осложняет технологию химической переработки, особенно в случае многотоннажных сырьевых источников, таких как кора или зелень древесины. В основе, например, существующих технологий переработки коры хвойных пород лежит принцип последовательной экстракции полезных веществ органическими экстрагентами возрастающей полярности. Обычно экстракция осуществляется в три ступени, что позволяет, например, последовательно выделить:
Механохимическая экстракция коры позволяет в одностадийном процессе выделить водорастворимые вещества в предельных количествах, не проводя предварительное отделение липидов органическими растворителями, снизив температуру и длительность экстракции [Ломовский О.И., 1999]. Что касается лекарственных препаратов древесного происхождения, необходимо обратить внимание, что механическая обработка расширяет степень утилизации целлюлозосодержащего сырья [Бабкин В.А., 1994; Ломовский О.И., 1994].
Механохимическая деструкция целлюлозы в присутствии небольших количеств кислоты может рассматриваться как перспективный способ получения микрокристаллической целлюлозы и полисахаридов. Метод имеет преимущества: уменьшение длительности процесса с нескольких часов до минут, уменьшение потерь, исключение системы регенерации кислоты и очистки гидролизатов [Бабкин В.А. и соавт., 1997].
Химический состав лишайника и механоактивированных комплексов на его основе
Как видно все спектры образцов идентичны в алифатической области спектра. В целом спектр представляет собой смесь усниновой кислоты и поли- и олигосахаридных веществ.
В районе 3,0-3,4 м.д. проявляются сигналы протонов сахаридного остова лихенана, который состоит из последовательностей 1.3 и 1.4- связанных остатков глюкозы, помимо которых присутствуют сигналы аномерных протонов полисахаридов при 5,20 и 5,12 м.д. В ходе механоактивации наблюдается изменения интенсивностей сигналов 3,29 и 3,33 м.д., точнее взаимоизменение их интенсивностей: при механоактивации уменьшается интенсивности сигнала 3,29 при увеличении сигнала 3,33 м.д. (рис. 25), что свидетельствует об изменении химического окружения внутри циклов полисахарида. В отличие от щелочных экстрактов исследуемого вещества, в кислотной среде таких изменений не происходит и спектры ягеля различного воздействия идентичны.
Таким образом, методом ЯМР – спектрометрии доказан передел лишайниковых полисахаридов до олигосахаридов в процессе механоактивации и определены основные действующие вещества ягеля механоактивированного.
Факт деструкции полисахахаридов до олигосахаридов также подтвержден анализом водорастворимых углеводов по методу восстанавливающих концов в экстрактах слоевищ лишайников после грубого измельчения либо механохимической активации (табл. 14). Принцип метода заключается в том, что углеводы под действием концентрированной серной кислоты дегидратируются (пентозы до фурфурола гексозы – до метил фурфурола). Эти вещества конденсируются с антроном, образуя соединение, окрашенное в голубовато-зеленый цвет. Оптическая плотность окрашенного раствора находится в линейной зависимости от содержания углеводов.
Содержание водорастворимых углеводов (продуктов гидролиза части -гликозидных связей в лишайниковых -полисахаридах) в пробах лишайника рода Cladonia составило 4,61 мг/г сухого образца грубого помола и 33,48 мг/г сухого механоактивированного сырья. (образцы 9 и 10 в табл. 14, рис. 26). Т.е. механоактивация слоевищ лишайников приводит к увеличению концентрации водорастворимых -олигосахаридов в 7,2 раза.
Также механохимическая активация способствует последующему протеканию твердофазных реакций с образованием межмолекулярного комплекса между наполнителем и ДВ (лишайниковые кислоты, либо известный фармпрепарат), схема которых представлена на рис. 27.
Рисунок 26. Содержание водорастворимых углеводов в экстрактах: 1 - слоевищ лишайников рода Cladonia, комплексов 2- ягель:цефазолин (100:1), 3 – ягель: пенициллин (100:1), 4-ягель:родиола (10:1) и 5 – ягель:рододендрон (10:1), мг эквив глюкозы/гткани.
Дополнительное введение ДВ (пенициллина, цефазолина - антибиотика цефалоспоринового ряда в соотношении 1% по массе, либо тканей родиолы розовой, рододендрона золотистого в соотношении 10% по массе) в процесс механохимической активации приводило к эффективному снижению содержания водорастворимых гликозидов в механоактивированных биокомплексах на основе ягеля (см. рис. 26).
Причем при уменьшении массовой доли тканей родиолы розовой или рододендрона золотистого с 10 до 1% регистрируемое содержание водорастворимых лишайниковых гликозидов вновь увеличивалось с 13,2-14,5 до 25-28 мг эквив глюкозы/гткани. Это указывает на то, что, образующиеся в процессе механоактивации лишайниковые -олигосахариды, могут образовывать комплексы с ДВ в том же процессе механоактивации. При этом функциональные группы водорастворимых -олигосахаридов оказываются связанными в комплексы с «активным веществом» и не титруются по методу «восстанавливающих концов». Т.е. эти результаты подтверждают предположение о том, что при механоактивации смеси слоевищ лишайников и добавляемого источника действующего вещества происходит одновременное образование -олигосахаридов (наполнителя) и комплексообразование их с ДВ (дополнительно вносимым физиологически активным веществом (ФАВ) – например, препаратом антибиотика, либо его источником – например, тканями лекарственных растений). Такие слабые межмолекулярные взаимодействия приводят к образованию комплекса бифильного характера, создавая тем самым оптимальные условия для диффузионного процесса, повышая биодоступность ДВ, что и способствует увеличению его биоактивности. Преимуществами лишайниковых b-олигосахаридов, как наполнителя и «транспортного средства для ДВ, являются: - не гидролизуемость в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ), т.к. они содержат прочные b-гликозидные связи); - хорошая всасываемость из ЖКТ в кровь, благодаря своему бифильному строению и размерам; - легкая транспортируемость через клеточные мембраны за счет своих размеров и того, что по структуре они являются аналогами олигогликозидных фрагментов гликокаликса клеточных мембран.
Кроме того, слоевища лишайников содержат комплекс природных лишайниковых кислот, проявляющих антибактериальные свойства. Благодаря этому образующиеся супрамолекулярные комплексы обладают высокой стерильностью. В нашем случае спектр фармакологической активности наполнителя дополнен детоксикационной функцией, будучи активным сорбентом, он одновременно элиминирует из организма экзо- и эндотоксины различной этиологии.
Эффект комплексообразования с микроэлементами за счет механохимической активации слоевищ лишайников при гастральной и энтеральной экстракции оценивали по данным элементного анализа. Изменения в химическом микроэлементном составе контрольных и механохимически активированных биокомплексов ягель/родиола и ягель/рододендрон показаны на рис. 28.
Эффекты повышение биодоступности ДВ и сорбционной активности наполнителя (in vivo)
В литературе известен способ приготовления бездрожжевого теста для полуфабрикатов тестовых изделий с начинкой, предусматривает замес теста из муки, жира, меланжа, соли, воды, в качестве разрыхлителя используется диоксид углерода, которым насыщают воду перед замесом до содержания 0,3-0,13%. Введение его позволяет восстановить структуру и получить качественную тестовую оболочку в готовом изделии [Останкович, А.А, 1994]. Но этот способ не решает задачу получения обогащенного биологически ценными компонентами теста, недостаток заключается еще и в том, что изделие подвергается плесневению.
Известен упрощенный способ приготовления, повышающий качество хлеба. Когда на стадии активации дрожжей в рецептурную смесь вводят высушенный и измельченный до 0,15-0,25 мм порошок крапивы в количестве 0,75-1,25% от общей массы муки. Затем проводят замес теста из муки, воды, соли, предусмотренных рецептурой, и подготовленных дрожжей, проводят брожение , разделку, расстойку и выпечку полученных тестовых заготовок. [Новоселова Г.Н. и соавт., 1994].
Добавление в качестве растительного компонента механоактивированного порошка ягеля, измельченного до размера частиц 20 - 100 нм в количестве 0,25 - 0,75% от массы муки позволило получить одновременно и обогащенную биологически ценными составными тестовую продукцию и повысить устойчивость готового изделия к плесневению за счет бактерицидных свойств ягеля.
Ягель (кладония), вносимый в муку, обладает специфическим вкусом, обусловленным наличием в ягеле цетрарина. Цетрарин возбуждает аппетит, способствует выделению желудочного сока и лучшему усвоению пищи. Ценным компонентом ягеля также является усниновая кислота и высокое содержание биогенных элементов. Ягель, внесенный в тесто в указанных концентрациях виде механоактивированного порошка, равномерно распределяется по всему объему теста. При этом он интенсивно впитывает влагу, так как его рабочая поверхность контакта увеличена механоактивированием, разбухает, создавая тип скелетной структуры в тесте. Наличие спирта в дрожжевом тесте усиливает синергизм воздействия на механоактивированный ягель и увеличивает экстракции ценных составных компонентов ягеля в спиртовую среду, т.е. переводит их в более усвояемое состояние.
Внесения ягеля в небольших количествах позволяют не менять традиционный вкус тестовых изделий, но в то же время достаточный для достижения технического результата - получения обогащенного изделия, устойчивого к плесневению. за счет присутствия антисептика.
Важнейшей составной частью муки являются белки - глиадин и глютеин. При тестообразовании они набухают и образуют упругую эластичную и клейкую массу - клейковину, влияющую на структуру теста. Муку необходимо брать с "сильной" клейковиной. Дрожжевое тесто из такой муки нормальной консистенции, эластичное, хорошо удерживает углекислый газ, выделившийся при сбраживании сахаров. Выделение углекислого газа и спирта происходит по всей толще теста. Пузырьки газа, постепенно расширяясь, растягивают клейковину, тесто приобретает пористость и сильно увеличивается в объеме.
Содержание поваренной соли до 1% массы муки способствует лучшему процессу брожения. Ягель механоактивированный использовали в качестве пищевой добавки. Уже в XX веке применение пищевых добавок стало смещаться из области домашней кухни в область промышленного изготовления продуктов. При этом выделяются следующие направления: - увеличение срока хранения; - изменение его пищевой ценности; - улучшение сенсорных качеств продукта. Согласно определению ВОЗ, под пищевыми добавками понимают химические вещества и природные соединения, которые сами по себе не употребляются в пищу, а добавляются в нее для улучшения качества сырья и готовой продукции.
В настоящее время в пищевой промышленности применяется около двух тысяч пищевых добавок. Согласно системе "Кодекс олиментариус", ягель можно отнести Е-200-Е-182 - консерванты [Позняковский В.И., 1996]. Изделия с ягелем увеличивают длительность хранения, не оказывая какого-либо отрицательного влияния на органолептические свойства теста.
Исследования показали, что интервал оптимальных концентраций пищевой добавки из механохимически активированных слоевищ лишайников для обогащения муки составляет 0,2-0,5%, что в 5-6 раз меньше, чем концентрация слоевищ лишайников грубого помола (табл. 39).
Показатель качества Контрольный образец 1-3 % слоевищ лишайников грубоизмельченных 0,2 % механоактивированных слоевищ лишайников 0,5% ягеля механоактивированных слоевищ лишайников
Поверхность Гладкая, без крупных трещин и подрывов Гладкая, без крупных трещин и подрывов Гладкая, без крупных трещин и подрывов Шероховатая, без крупных трещин и подрывов Цвет Светло-желтый Светло-желтый Светло-желтый Светло-коричневый Состояние мякиша Пропеченный, не влажный на ощупь, эластичный без комочков, пустот и уплотнений Слегка влажный на ощупь, без комочков, средняя эластичность Пропеченный, не влажный на ощупь, эластичный без комочков, пустот и уплотнений Пропеченный, не влажный на ощупь, эластичный без комочков, пустот и уплотнений Вкус Свойственный данному виду изделия, без постороннего привкуса Свойственный данному виду изделия, со своеобразным привкусом Свойственный данному виду изделия, без постороннего привкуса Свойственный данному виду изделия, с едва заметным привкусом