Введение к работе
1.1.Актуальность темы. Разработка ветеринарных иммунобиологических
препаратов, направленных на профилактику, лечение и диагностику
инфекционных заболеваний, предопределяет повышенные требования к их
эффективности и безопасности.
Международный рынок иммунобиологических препаратов
регламентируется соответствующими международными правилами как на этапах доклинических исследований - правила GLP (Good Laboratory Practice), так и на этапе клинических испытаний - правила GCP (Good Clinical Practice), и на этапе серийного производства - правила GMP (Good Manufacturing Practice).
Организация серийного производства ветеринарных биопрепаратов должна соответствовать требованиям ГОСТ ИСО 9001-2011 на основе «Системы обеспечения качества», «Системы посевных материалов» (Seed Lot System) и методов их контроля. Реализация этих задач предусматривает решение ряда научных и технологических проблем, направленных на повышение эффективности и конкурентоспособности отечественных лечебных препаратов. Внедрение в практику биопредприятий современных методов контроля при серийном производстве моно- и поливалентных иммунобиологических ветеринарных биопрепаратов является приоритетной задачей.
В этой связи разработка современных методов контроля качества ветеринарных иммунобиологических биопрепаратов против клостридиозов животных на основе иммуноферментного анализа является актуальной задачей.
Степень разработанности проблемы. Изучена иммуногенная
активность столбнячного компонента в составе ассоциированной вакцины
против клостридиозов крупного рогатого скота в реакции нейтрализации Cl.
tetani на белых мышах (Скляров О.Д., Капустин А.В., Лаишевцев А.И., Гулюкин
А.М., Шемельков Е.В., 2016). Апробирована система контроля качества
медицинских иммунобиологических препаратов химическими и
иммунохимическими методами (Ус тинникова О.Б.,2007; Давлетбаева Л.Р., 2007; Волкова Р.А.,2009; Калашникова Е.А.,2014); накоплен большой опыт по
конструированию иммуноферментных тест-систем для индикации
стафилококкового, дифтерийного, ботулинических токсинов и антител к ним (Грязнова Д.В.,1999; Николаева А.М.2003, Вязникова Т.В.,2007; Гальвидис И.А., 2008; Фирсова Т.Н.,2012; Храмцов П.В.,2016).
В мировой практике разработка и промышленное освоение методов контроля современных ветеринарных иммунобиологических биопрепаратов носят наукоёмкий характер. Данный подход широко используется в работе национальных органов контроля в странах с развитой экономикой -Великобритании, Германии, Голландии, США (Волкова Р.А.,2009). Контроль осуществляется в рамках нормативно-правовой базы с учётом принципов оценки качества, заложенных межнациональными регулирующими органами (FDA и USDA) и направленных на обеспечение безопасности, эффективности и отсутствия токсичности биопрепаратов для животных.
Согласно требованиям Европейской Фармакопеи (1998 г.) минимальный уровень антител к эпсилон-токсину в сыворотке крови вакцинированных кроликов, должен соответствовать не менее 5 МЕ/см3 и 2 МЕ/см3 для США [European Pharmacopeia (1998) и the Code of Federal Regulations (CFR, USA)] . Требования, предъявляемые к качеству, безопасности и эффективности вакцин против Cl. рerfringens Д изложены в Европейской фармакопее (Ph Eur.; монография 0363:"Вакцина Clostridium рerfringens для ветеринарного применения").
Уровень индукции специфических антител к эпсилон-токсину Cl.
рerfringens в сыворотке крови вакцинированных кроликов выявляют в тесте
нейтрализации токсина на мышах (MNT) (Британская Фармакопея, 1993),
Clostridium perfringens vaccine for veterinary use (0363): в Ph. Eur. 4 th ed.
Strasbourg: Council of Europe; 2002:2250-51), методом ELISA (Sojka и соавт,
1989, Wood, 1991, Uzal и др., 1997). Реакция нейтрализации токсина на
лабораторных животных требует времени, большого количества животных,
материальных затрат, а результаты зависят от чувствительности животных (Британская Фармакопея, 1993). Тесты ИФА занимают по времени несколько
часов (Nielsen и др., 1992) при коэффициенте корреляции между результатами, с классическим методом r=0,93, что гарантирует их достоверность U. Rosskopf-Streicher, P. Volkers, E. Werner 2003). Parreiras (2001) и др. использовали логарифмическое преобразование результатов количественного определения антитоксина с целью линеаризации калибровочной кривой. Sojka et al. (1989) в первые в качестве калибратора использовал стандартную антисыворотку к эпсилон-токсину Cl. рerfringens. Чувствительность и специфичность ЕLISA при определении антител к бета-токсин составила 90,5% и 89,2%, к эпсилон-токсину - 97,4% и 94,6% со0тветственно (El Idrissi; Ward, 1992).
1.2. Цель и задачи исследований. Целью данного исследования является
разработка иммуноферментной тест-системы для количественного определения
антител к эпсилон-токсину Cl. рerfringens Д в сыворотке крови животных при
промышленном производстве поливалентной вакцины. Для достижения
указанной цели необходимо решить следующие задачи:
-отработать технологию получения очищенного и концентрированного эпсилон-токсина для использования в качестве антигена в иммуноферментной тест-системе;
-получить и аттестовать антитоксическую сыворотку (по содержанию IgG (МЕ/cм3) относительно международного стандарта;
-разработать тест-систему на основе непрямого варианта ИФА для
количественного определения специфических антител к анатоксину в сыворотке
крови вакцинированных кроликов с использованием компьютерной программы;
-оценить эффективность разработанной тест-системы ИФА для
количественного определения антител к эпсилон-токсину Cl. рerfringens Д в сыворотке крови животных при промышленном производстве поливалентной вакцины.
1.3. Научная новизна. Впервые разработана отечественная тест-система на
основе непрямого варианта ИФА для количественного определения
специфических антител в сыворотке крови вакцинированных животных в
международных единицах (МЕ). Получена, аттестована и внедрена в
производство антитоксическая сыворотка в качестве национального (Россия)
стандарта предприятия при производстве поливалентной вакцины. Показана
прямая корреляционная зависимость результатов определения уровня антител в
сыворотке крови вакцинированных животных методом непрямого
иммуноферментного анализа и теста нейтрализации токсина на мышах.
Впервые для статистической обработки результатов иммуноферментного
анализа адаптирована компьютерная программа с использованием стандарта
предприятия, с определением доверительных интервалов его активности, критериев линейной зависимости оптической плотности от содержания антитоксических антител.
1.4.Теоретическая и практическая значимость исследований. Внедрена
система контроля качества ветеринарных иммунобиологических биопрепаратов
при промышленном производстве поливалентной вакцины на основе
иммуноферментного анализа с использованием стандартных образцов и их
валидационных характеристик.
Предложен стандартный образец предприятия - сыворотка крови против клостридиозов животных, калиброванная по содержанию специфических IgG -антител к эпсилон-токсину Сl. perfringens Д.
Разработана иммуноферментная тест-система для контроля качества при изготовлении вакцины против Cl. рerfringens Д. Тест-система ИФА может быть использована для оценки уровня иммунитета у животных, вакцинированных моно- и поливалентными препаратами против Сl. perfringens типа Д. 1.5 Методология и методы исследования. Методология исследований включает стандартные процедуры с использованием различных материалов и экспериментальных животных, стандартное оборудование клинических лабораторий для взятия крови и проведения серологических реакций.
Объекты исследований. Производственный штамм 213 Cl. perfringens тип
Д (получен из Федерального государственного бюджетного учреждения
«Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации
лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ "ВГНКИ")) и биопрепараты на его основе.
В работе использовали стандартные растворы и питательные среды, бактериологические среды, сыворотки.
Методы исследований. В работе применяли стандартные варианты
твёрдофазного ИФА на 96-луночных (Corning, США) микропланшетах по
Engvall E. (1971) и моноклональные антитела к эпсилон-токсину клостридий
производства (Iowa State University Anti-Clostridium Perfringens Epsilon Toxin
[4D6] Antibody («Kerafast»-«Reagent for the Greater Good»), «Kerafast» (США).
Защитные возможности антитоксической сыворотки собственного
производства сравнивали с международным стандартом. Летальную дозу
эпсилон-токсина (LD50) токсина определяли, как описано Sebald and Petit (1997)
и в соответствии с протоколами исследований лаборатории "Nacional
Agropecurio / Педро Леопольдо / Минас-Жерайс /Бразилия "(LANAGRO).
При определении L+/ дозы токсина применяли стандартный образец (СО)
активности сыворотки соответствующего типа, калиброванный в МЕ. Опытная
доза эпсилон-токсина (L+/) представляет собой наименьшее количество
токсина, которое в смеси с 0,1 ME стандартной антитоксической сывороткой
при введении мышам в объёме 0,2 мл вызывает гибель 50 % мышей, в
соответствии с инструкциями (1998) Европейской Фармакопеи. Сыворотка
крови, содержащая специфические антитела к эпсилон-токсину клостридий,
получена из Национального института биологических стандартов и контроля
(NIBSC, Хартфордшир, Великобритания). Международный стандартный
образец антитоксической сыворотки против клостридий животных (National
Institute of Biological Standards and Control (NIBSC), Великобритания), содержал
1020 МЕ/ампула антител против эпсилон- токсина. Коньюгатом для ИФА
служил коммерческий препарат - рекомбинантный протеин G, меченный пероксидазой хрена производства ООО «ИМТЕК» (г. Москва, Россия). Специфические IgG- антитела получали с использованием в качестве лиганда очищенного анатоксина методом аффинной хроматографии на BrCN- сефарозе (Sigma-Aldrich Chemie GmbH). Для выявления связи результатов определения
антитоксических антител использовали корреляционный анализ (Иванова В.М., 1981). Метрическую величину определяли по коэффициенту корреляции
Степень чистоты концентрированного эпсилон-токсина оценивали методом электрофореза в полиакриламидном геле (по Лэммли, 1970), концентрацию белка (по Брэдфорду, 1976).
Для постановки непрямого варианта ИФА инактивированный эпсилон-токсин сорбировали в оптимальной концентрации в карбонатно-бикарбонатном буферном растворе рН 9,6. Свободные участки блокировали 1% раствором БСА в трис-буфере («Sigma»). Исследуемые сыворотки вакцинированных кроликов и стандарт предприятия (предварительно откалиброванный против международного стандарта содержания антитоксинов (NIBSC, London), вносили в разведениях, начиная с 1: 10. Образовавшийся комплекс выявляли конъюгатом протеина G, меченного пероксидазой в разведении 1:5000. Содержание антител к эпсилон-токсину определяли с помощью компьютерной программы «ИФА-Мастер» (Биотехнологический холдинг «Алкор Био», г. Санкт-Петербург), с построением калибровочного графика зависимости ОП450 от содержания антител в стандарте предприятия.
Результаты исследований статистически обрабатывали в соответствии с методами, описанными в работах И.П. Ашмарина и др. (1962), Н.А. Плахинского (1970), Е.В. Гублера (1978). Достоверность результатов подтверждали путём статистической обработки и определения различий средних значений с помощью критерия Стьюдента. Результаты считали достоверными при Р<0,05.
1.6. Основные положения, выносимые на защиту.
- Иммуноферментная тест-система и её валидация для оценки содержания
антител к эпсилон-токсину клостридий;
- компьютерная программа оценки результатов непрямого варианта ИФА;
- практическое применение тест-системы на основе непрямого варианта ИФА
для контроля качества при изготовлении вакцины против клостридиозов
животных.
1.7. Апробация работы. Материалы диссертации доложены:
- на заседаниях Учёного совета ФГБНУ ВНИТИБП, Щёлково, 2014-2017 гг.;
- на IV Международной научной конференции, посвященной 55-летию
аспирантуры ФГБУ "ВНИИЗЖ", 6 декабря 2016 г.;
- III Всероссийской научной конференции молодых ученых
с международным участием «Современное состояние, проблемы и перспективы
развития агропромышленного комплекса» 5-9 июня 2017 г. Симферополь,
Республика Крым, Россия.
1.8.Публикации результатов исследований. По теме диссертации
опубликовано 6 научных работ, в том числе 2 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации материалов диссертаций.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Результаты исследований соответствуют п.п. 1,3,4,5,8,11 паспорта специальности 03.01.06 и п.п. 3, 9,14 паспорта специальности 06.02.02.
1.9. Структура и объём диссертации. Материалы диссертации изложены на
129 страницах компьютерного текста и состоят из следующих разделов:
введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных
результатов, выводы и данные о практическом использовании научных выводов,
список использованной литературы включает 258 источников, в том числе 132
отечественных и 126 зарубежных. Работа содержит 6 таблиц, 14 рисунков, 5
страницы приложений.
1.10. Достоверность результатов исследований подтверждается
соответствием теоретических данных с полученными результатами
экспериментов и лабораторных испытаний. Экспериментальные данные,
выводы и рекомендации основаны на общепринятых теоретических
закономерностях, не противоречат и с достаточной степенью точности
согласуются с общеизвестными данными, апробированы и подтверждены
эффективным применением. Полученные результаты не противоречат данным, представленным в независимых источниках по данной тематике.
1.11. Личный вклад. Основная часть диссертационной работы выполнена автором самостоятельно. Отдельные опыты проведены с участием сотрудников отдела молекулярной биологии и вирусологии, за что автор выражает им искреннюю благодарность.