Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Классификация, структура и свойства вируса бешенства 11
1.1.1. Классификация лиссавирусов .
1.1.2. Морфология и структура вируса бешенства .
1.1.3. Репродукция вируса .
1.2. Эпизоотологические особенности
1.3. Диагностика бешенства 19
1.3.1. Метод флюоресцирующих антител 20
1.3.2. Выделение вируса бешенства как метод диагностики 22
1.3.3. Серологические методы диагностики .
1.4. Профилактика бешенства .
1.4.1. Вакцины против бешенства
1.4.2. Типы вакцин против бешенства, используемые в ветеринарии 32
1.4.3. Адъюванты для вакцин против бешенства 34
Заключение по обзору литературы 38
2. CLASS Собственные CLASS исследования 40
2.1. Материалы и методы исследований 40
2.1.1. Материалы 40
2.1.1.1. Вирусы
2.1.1.2. Культуры клеток
2.1.1.3. Референтные сыворотки и вакцины
2.1.1.4. Экспериментальные животные .
2.1.1.5. Адъюванты .
2.1.1.6. Среды и растворы 404040
2.1.1.7. Реагенты 41
2.1.1.8. Оборудование
2.1.2. Методы .
2.1.2.1. Культивирование вируса бешенства .
2.1.2.2. Титрование в культуре клеток
2.1.2.3. Определение инфекционной активности .
2.1.2.4. Титрование вируса на белых беспородных мышах
2.1.2.5. Инактивация вируса
2.1.2.6. Определение контаминации бактериальной и грибной микрофлорой
2.1.2.7. Определение контаминации вакцины микоплазмами
2.1.2.8. Антигенные свойства
2.1.2.9. Определение титра антирабических вируснейтрализующих антител в сыворотках крови животных методом FAVN
2.1.2.10. Cчитывание и интерпретация результатов опытов .
2.1.2.11. Определение иммуногенной активности вакцины методом NIH .
2.1.2.12. Статистическая обработка результатов
- Эпизоотологические особенности
- Серологические методы диагностики
- Референтные сыворотки и вакцины
- Определение контаминации бактериальной и грибной микрофлорой
Введение к работе
1.1. Актуальность темы. Повышение эффективности производства
биопрепаратов, в том числе вакцин против бешенства, является актуальной задачей XXI века (Самуйленко А.Я., Рубан Е.А., 2000). Напряжённая эпизоотическая ситуация по бешенству в РФ требует разработки вакцин нового поколения, обладающих высокой иммуногенной активностью. В связи с этим весьма актуальными представляются исследования, направленные на разработку и применение экспресс-метода оценки активности вакцин против бешенства на основе иммуноферментного анализа.
Производство вакцин это сложный и длительный технологический
процесс, требующий постоянного контроля на различных его этапах. В
настоящее время нормативные документы предусматривают оценку
подлинности и специфичности биопрепаратов в опытах на животных, что требует длительного времени, позволяя проводить дифференцировку серий вакцины с низким ТЦД50 (50%-тканевая цитопатическая доза) до проведения заключительных этапов производства - лиофильной сушки и упаковки вакцины. Установление низкой биологической активности вакцинного препарата исключает его из применения. Повышение качества биологических препаратов, эффективности их производства и экологическая безопасность является актуальной задачей.
Производству биопрепаратов против бешенства и оценке их
эффективности посвящены научные работы многих отечественных
исследователей (Вагабов Р.М.,1969; Селимов М.А., 1978; Сафаров Р.К., Кузнецов П.П. и Иванов В.С.,1972-2009; Бучнев К.Н.,1985; Сафонов Г.А.,1991; Грибенча С.В., 1993; Никишин И.В., Жестерев В.И. и др.,1997; Недосеков В.В.,1998; Луницин А.В,2001; Красуткин С.Н., 2002; Сливко И.А.,
2003; Ковалёв Н.А. и др., 2009; Гулюкин А.М., Рахманин П.П., 2010; Грибова И.Ю., Верховская Л.В. и др., 2011; Самуйленко А.Я., 2014).
Степень разработанности проблемы. По данным многих
исследователей содержание гликопротеина вируса бешенства коррелирует с иммуногенностью антирабических вакцин (8-й доклад ВОЗ, 1994; Недосеков В.В., 1998; Cliquet F.,2006-2008; Лосич М.А,2011, Hervijnen V.R.,2011).
Для оценки иммуногенной активности испытуемых инактивированных
антирабических вакцин использовали «сэндвич»-вариант ИФА, результаты
которого выражали в международных единицах (ME). Титром испытуемых
вакцин считали конечные положительные разведения, с оптической
плотностью выше 0,2 и контроля в > 2,1 раза. При сенсибилизации твёрдой
фазы смесью моноклональных антител и использовании для выявления
связавшегося антигена пероксидазного конъюгата на основе
поликлональных антител метод позволял обнаружить гликопротеин вируса бешенства в инактивированных вакцинах в титре до 1:160-320, что соответствовало 0,0063-0,0031 МЕ. Коэффициент корреляции результатов, полученных при тестировании вакцин методом ИФА и тестом NIH, составлял 0,95 (Недосеков В.В.,1998).
Имеются сообщения о разработке иммуноферментной тест-системы на
основе пары моноклональных антител (МкА) для оценки содержания
гликопротеина (G-белка) вируса бешенства в нг/мл (Грибенча С.В.,2012).
Установлено, что препараты с титром в ИФА 1:160 обладали иммуногенной
активностью 1 МЕ/см3 (Лосич М.,2014).
Предложен способ определения иммуногенной активности
инактивированных антирабических вакцин с использованием калибровочной кривой, отличающийся тем, что определение иммуногенной активности осуществляют путём сравнения поствакцинального титра антирабических антител, полученного после введения мышам пяти разведений референс-вакцины и исследуемой вакцины с использованием разработанного шаблона [Нiкiтова А. П., 2015 (Украина)].
Наши исследования и полученные результаты расширяют возможности
практического использования «сэндвич»-варианта ИФА для
количественного определения гликопротеина вируса в вакцинах против бешенства.
1.2. Цель и задачи исследований. Целью данной работы явилась
разработка метода иммуноферментного анализа для оценки активности вакцин
против бешенства с применением компьютерного обеспечения.
Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи:
- разработать тест-систему на основе «сэндвич»-варианта ИФА для определения
гликопротеина вируса в различных биологических системах с использованием
компьютерной программы статистической обработки результатов;
- оценить методы построения калибровочной кривой для количественной
оценки гликопротеина вируса бешенства в «сэндвич»-варианте
иммуноферментного анализа;
приготовить экспериментальные серии инактивированной вакцины против бешенства на основе штамма «Щёлково-51» и иммуностимулирующего комплекса, оценить их активность и специфичность;
изучить эффективность практического применения тест-системы на основе «сэндвич»-варианта ИФА для оценки иммуногенности вакцин против бешенства, в том числе в процессе хранения.
1.3. Научная новизна. Впервые показана принципиальная возможность
применения «сэндвич»-варианта ИФА для оценки подлинности, полноты
сорбции и экспрессного слежения за целевым продуктом на этапах
технологического процесса при производстве вакцины против бешенства.
Впервые в экспериментальных исследованиях с использованием
образцов вакцины против бешенства для животных, на основе штамма
«Щёлково-51» отработан метод определения иммуногенности, отличающийся
тем, что количественная оценка гликопротеина вируса выражается в МЕ/см3 на
основании регистрации сигнала оптической плотности разведения
исследуемого образца вакцины и проекции его показателей в калибровочную
кривую, построенную по результатам оценки разведений стандартной
эталонной референс-вакцины против бешенства с известным показателем
индекса иммуногенности.
Впервые для количественной статистической обработки результатов
иммуноферментного анализа и расчёта концентрации гликопротеина вируса
бешенства в вакцинном сырье и готовых препаратах адаптирована современная
компьютерная программа, которая по данным ИФА (значения оптической
плотности в зависимости от концентрации титруемых биопрепаратов) в
автоматическом режиме определяет активность испытуемого вакцинного
материала относительно стандарта, доверительные интервалы этой активности,
критерий линейности для графиков логарифмической зависимости оптической
плотности от концентрации сравниваемых биопрепаратов. Показано, что
наиболее точно природе существующих в ИФА зависимостей сигнал-
концентрация соответствуют методы построения калибровочной кривой:
преобразование «logit-log» и 4-параметрический логарифмический
логистический метод («4PL»). Результаты, полученные с их помощью, имеют наименьшую вариабельность и высокую воспроизводимость. Учёт результатов ИФА стандартизован таким образом, что позволяет оценить содержание важного компонента в вакцинных биопрепаратах в МЕ/cм3.
1.4. Практическая значимость работы. Предложена
иммуноферментная тест-система для контроля качества вакцинных препаратов
в технологическом процессе изготовления инактивированной вакцины против
бешенства животных и её хранения. Создание иммуноферментной тест-
системы для количественной оценки специфической активности
антирабической вакцины является важным звеном в разработке системы
контроля вакцинных препаратов.
Компьютерная программа на основе преобразования «4PL» или «logit-log»
рекомендуется для построения калибровочной кривой с целью
количественного определения гликопротеина вируса бешенства в «сэндвич»-варианте ИФА в не инактивированном и инактивированном, в сорбированном
и несорбированном антигене, в материале органо-тканевого и культурального происхождения. Метод контроля субстанции вакцины по показателю «специфическая активность» с помощью разработанной ИФА тест-системы включён в проект «Опытно-промышленного регламента на производство инактивированной вакцины против бешенства из штамма «Щёлково-51», утверждённый директором ВНИТИБП 21.09.2015 г.
1.5 Методология и методы исследования. Методология проведённых исследований включает стандартные процедуры с использованием различных материалов и естественно восприимчивых животных. В работе использовали культуральный и мозговой вирус бешенства, перевиваемые культуры клеток, стволовые клетки жировой ткани лошади, растворы и питательные среды, бактериологические среды, сыворотки, вирусологические (титрование, культивирование вируса) и серологические (ИФА, РН, РИФ, «FAVN», РДП) методы исследований.
1.6. Основные положения, выносимые на защиту.
иммуноферментная тест-система для оценки содержания гликопротеина вируса в вакцинном сырье и её валидация;
обработка результатов «сэндвич»-варианта ИФА с помощью элементов компьютерного обеспечения;
- практическое применение метода ИФА для оценки содержания гликопротеина
в вакцинах против бешенства на различных этапах технологического процесса
и хранения.
1.7. Апробация работы. Материалы диссертации доложены:
- на заседаниях Учёного совета ВНИТИБП, Щёлково, 2012-2015 гг.;
на Международной научно-практической конференции, посвященной 55-летию ВНИИВВиМ «Актуальные вопросы контроля инфекционных болезней животных»,01-02 октября, Покров, 2014 г.;
на Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щёлково, 2014 г.;
- на Международной научно-практической конференции «Актуальные
проблемы биотехнологии в аграрно-промышленном комплексе» 26-27 ноября 2015 г, Минск;
- на V Международном съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов
ЕАЭС «Актуальные проблемы и инновации в современной ветеринарной
фармакологии и токсикологии», 26-30 мая, Витебск, 2015 г.
- на выставке «Золотая осень-2015» получена серебряная медаль и диплом «За
разработку и производство «Иммуноферментная тест-система для определения
гликопротеина вируса бешенства в вирусвакцине, в культуральной жидкости и
головном мозге животных»».
1.8. Публикации результатов исследований. По теме диссертации
опубликовано 8 научных работ, в том числе 3 работы в журналах,
рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации материалов
диссертаций.
1.9. Структура и объём диссертации. Материалы диссертации изложены на
128 страницах компьютерного текста и состоят из следующих разделов:
введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных
результатов, выводы и данные о практическом использовании научных выводов,
список использованной литературы включает 136 источников, в том числе 74
отечественных и 61 зарубежных. Работа содержит 9 таблиц, 25 рисунков, 4 страницы
приложений.
1.10. Достоверность результатов исследований подтверждается
соответствием теоретических данных с полученными результатами
экспериментов и лабораторных испытаний. Экспериментальные данные,
выводы и рекомендации основаны на общепринятых теоретических
закономерностях, не противоречат и с достаточной степенью точности
согласуются с общеизвестными данными, апробированы и подтверждены
эффективным применением.
1.11. Личный вклад. Основная часть диссертационной работы выполнена
автором самостоятельно. Отдельные опыты проведены с участием сотрудников
отдела молекулярной биологии и вирусологии, за что автор выражает им
искреннюю благодарность. Диссертант выражает благодарность за
консультативную помощь сотрудникам института д.б.н., профессору Клюкиной В.И. и д.б.н., профессору Кузнецовой С.В., а также руководителю ООО «Файзеркрафт» А.Б. Майборода (г. Москва) и сотрудникам сторонних организаций, причастных к настоящей работе.
Эпизоотологические особенности
За последние 10 лет число субъектов Российской Федерации, неблагополучных по бешенству животных, возросло на 25% (с 49 в 2000 году до 61 в 2010 году). В 2007- 2010 годах болезнь регистрировали на территории 64-х субъектов страны. При этом в Центральном, Южном и приволжском федеральных округах были неблагополучны по бешенству все 100% субъектов РФ, входящих в указанные округа [20].
Интенсивность эпизоотии весьма высока – на территории 50% неблагополучных субъектов страны ежегодно выявляется свыше 50 случаев бешенства животных. В одной трети субъектов этот показатель превышает 100 случаев в год.
Ежегодно регистрируется свыше 4,4 тысяч случаев бешенства. Заражённые и больные животные представляют смертельную угрозу для человека. По данным Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека в Росси ежегодно за медицинской помощью в связи с укусами диких и домашних животных обращаются около 440 - 450 тысяч человек, из них более 200 тысяч получают назначение на курс антирабических прививок [11,14].
За 2000- 2010 гг. в России зарегистрированы 152 случая гибели людей от бешенства. Заражение и гибель людей происходили в наиболее неблагополучных субъектах России и в полном соответствии с расширением географии бешенства животных.
С 2000 года число случаев бешенства в России неуклонно росло. При этом отмечается цикличность эпизоотического процесса, связанная с природно – климатическими условиями и вымиранием части популяции переносчиков возбудителя болезни в дикой природе. Почти во всех регионах страны периодически отмечается активизация природных очагов бешенства, растёт число случаев заболевания среди диких плотоядных животных, вовлекаются в эпизоотический процесс домашние животные (собаки, кошки) и сельскохозяйственные животные.
Ухудшение эпизоотической обстановки в РФ за прошедшие годы связано, прежде всего, с распространением болезни среди диких плотоядных. Удельный вес случаев бешенства среди диких плотоядных за последние 11 лет вырос в полтора раза. На их долю приходится более 50% от общего числа зарегистрированных случаев (в 2010 году – 52,2%). При этом установлена прямая корреляция между динамикой развития эпизоотического процесса среди диких плотоядных в природных экосистемах и распространением болезни среди домашних и сельскохозяйственных животных [9].
Серьёзную угрозу в плане распространения бешенства среди людей и животных представляют также безнадзорные животные (преимущественно собаки и кошки).
Для лабораторной диагностики бешенства использовалась микроскопия мазков тканей мозга с целью выявления телец Бабеша-Негри, присутствие которых служит 100% диагностическим признаком. Однако тельца Бабеша-Негри выявляются лишь в 80% случаев. Диагностика бешенства на основании наличия телец Бабеша-Негри, а также другие гистопатологические тесты, такие, как тест Селлера или тест Манна, в наши дни практически не применяются. В случае начавшего разлагаться материала они считаются непригодными [9,13]. Современная постмортальная диагностика высокоэффективна и базируется на выделении вируса (in vivo или in vitro), детекции нуклеопротеина (антигена) и генетической информации (генома РНК или его фрагментов). К золотым стандартам относятся два метода выделения вируса in vivo и in vitro. Один путь – это заражение мышей (MIT), второй – культивирование вируса в культуре клеток мышиных нейробластом N2a (RTCIT). Детекция антигена (нуклеопротеина) вируса бешенства осуществляется прямым методом флюоресцирующих моноклональных антител (МФА) [76]. Диагностика бешенства у человека бывает прижизненной и посмертной. Прижизненная диагностика базируется на детекции антигена N-белка в криостатных срезах кожи (волосяного мешка) и РНК в моче методами МФА и ОТ-ПЦР; выделение вируса in vitro и in vivo, а также детекция РНК в образцах слюны, слезах и спинномозговой жидкости (СМЖ); определение антител в крови невакцинированных пациентов и в СМЖ, независимо от проведённой вакцинации или без неё. Эффективность прижизненной диагностики низка и варьирует в пределах 0-45%. Поэтому перечисленные выше методы повторяются до установления диагноза. Посмертная диагностика основывается на выделении вируса или детекции N-белка [20,21].
Наивысшей чувствительностью обладают молекулярные методы исследования: ОТ-ПЦР и секвенирование генов N- и G-белков. Однако ОТ-ПЦР не рекомендуется для рутинной диагностики бешенства из-за возможности получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Секвенирование генов N- и G-белков используется для классификации вирусов по видам, филогенетическим группам и идентификации вариантов вируса, циркулирующих в определенной географической зоне или хозяине [35,11,92, 116,118].
Серологические методы диагностики
Адъюванты, как правило, работают по двум механизмам. Первое – это обеспечение гуморального ответа. В этом случае, адъювант выступает как переносчик, помогая антигену попадать в селезенку и лимфоузлы, где его захватят дендритные клетки и предъявят В-лимфоцитам, которые после активации превращаются в плазматические клетки, в больших количествах синтезирующие специфичные антитела, обладающие высоким сродством к антигену. Второе - они формируют депо антигена в месте инъекции, что приводит к постепенному выбросу антигена в небольших количествах в течение длительного времени. Такой подход обеспечивает продолжительную стимуляцию иммунной системы с минимальным угнетением. К этой группе адъювантов относятся лектин, гидроокись и фосфат алюминия, минеральные масла, полиакрилаты и др.[6,18]. Другие адъюванты (сапонин например) усиливают клеточный иммунитет. Это наиболее широко известный механизм действия адъюванта: адъювант активирует клетки иммунной системы различных типов, напрямую или косвенно, в первую очередь макрофаги, которые, в свою очередь, активируют не только Т-клетки, но и В-лимфоциты [15]. Однако молекулы алюминия, остающиеся длительное время в тканях в месте введения вакцины, могут вызывать у кошек новообразования, и, прежде всего, гранулемы или саркомы [78]. Кроме того, адъюванты на основе гидроокиси или фосфата алюминия стимулируют в большей степени выработку антител, т. е. гуморальный иммунный ответ, практически не затрагивая клеточный тип иммунного ответа, играющего важную роль в противовирусной защите [Лосич М.А.,2011].
Адъюванты в составе инактивированных вакцин обеспечивают корпускулирование и депонирование антигена, развитие воспалительной реакции на месте введения со стимуляцией фагоцитарной активности и плазмоцитарной реакции; оказывают митогенное действие на лимфоциты с активацией макрофагов и выделением медиаторов, влияющих на клетки иммунной системы [107]. При изготовлении сорбированных вакцин из инактивированного вируса в качестве адъювантов применяют гель ГОА и сапонин [6]. Сапонины — поверхностно-активные агенты, вызывающие гемолиз эритроцитов in vitro. В 1995 г. Kensil с коллегами выделил чистую фракцию Quil А сапонина с низкой токсичностью (QS 21) и определил структурные доли, ответственные за адъювантную активность [107]. Было доказано, что QS 21 стимулирует выработку цитотоксичных Т-лимфоцитов, цитокинов (IL-2 и IFN-g) и антител IgG2a [57].
В качестве адъювантов используют огромное количество веществ разной природы: минеральные и масляные адъюванты, препараты тимуса, синтетические вещества, цитокины и пептиды со свойствами цитокинов, микробные и растительные адъюванты и др. Одни из них в большей степени обеспечивают гуморальный иммунный ответ, другие – клеточный.
Вакцины с использованием ГОА являются простыми в изготовлении, относительно дешевыми и безопасными. Многими разработчиками ГОА в качестве адъюванта принят как «золотой стандарт» по безопасности при разработке новых адъювантов для вакцин [31]. Этот адъювант остаётся единственным разрешённым к использованию при производстве вакцин для людей в США. Хотя побочные эффекты при его использовании полностью не исключены, остаются возможными образование гранулем, аллергические реакции [15,18]. Вакцины, изготовленные с использованием ГОА в качестве адъюванта, хорошо инициируют развитие гуморального иммунного ответа. ГОА создает эффект депо, обеспечивая оптимизацию контакта между антигеном и АПК. Значительным недостатком ГОА - адъюванта является слабая индукция цитотоксического иммунного [35].
В диссертации Лосич М. сообщается, что интерес вызывают адъювантные свойства сапонинов (это гликозиды растительного происхождения), из них самый известный Квил-А – экстракт из коры южноамериканского дерева Quillaja saponaria. На основе сапонинов был предложен новый класс адъювантов – ISCOM (Immuno Stimulating Complex, иммуностимулирующий комплекс), представляющий собой устойчивую пространственную структуру с инкорпорированным антигеном и стимулирующий клеточный (за счет Тх 1-го типа) и гуморальный (за счёт Тх 2-го типа) иммунный ответ [100]. К адъювантам нового поколения относится ISCOM «Matrix M» (торговая марка AbISCOR-100), разработанная шведской компанией Isconova. ISCOM «Matrix M» изготовлен на основе сапонинов, выделенных из коры южно-американского дерева Quillaja saponaria molina, холестерола и фосфолипидов, и представляет собой устойчивую, пространственную структуру, размером около 40 нм. В отличие от ISCOM, в комплексах ISCOM, приготовленных на основе «Matrix M», антиген не заключается внутрь частички. «ISCOM Matrix M» даёт увеличение силы иммунного ответа и его продолжительности [39]. Он также улучшает качество вакцин, потому что, помимо стимуляции гуморального иммунного ответа, как это делают большинство вакцин, он также стимулирует клеточный иммунный ответ [15].
Значит, решающим условием разработки вакцин является подбор такого сочетания штамма вируса и адъюванта, который позволит стимулировать у вакцинированных животных напряжённый и длительный антирабический иммунитет.
Референтные сыворотки и вакцины
Контроль вакцин против бешенства проводится на двух этапах: в «процессе производства» и определение активности готовых серий вакцины. Контроль активности вакцин в «процессе производства» проводится путём определения вирусной активности материала. Необходимость количественной оценки иммунизирующей активности готовых серий антирабических вакцин стала очевидной буквально с момента изготовления первых вакцин. Хотя уже более 60 лет существуют стандартные методы во многих лабораториях, производящих вакцины, определение иммуногенной активности до сих пор не стало ежедневной практикой.
Кроме того, известно, что не всегда применение стандартной технологии гарантирует получение биопрепарата, обладающего постоянно высокой иммуногенной активностью. Лаборатории сталкиваются нередко с тем, что выпущенная ими вакцина против бешенства с низкой, а порой и вовсе с незначительной активностью. Полную информацию об активности вакцины получают при испытании на целевых животных. Оценивать иммуногенность антирабических вакцин на основании иммунизации в полевых условиях, при которых отсутствует необходимый контроль и невозможно учитывать все многочисленные, довольно изменчивые факторы, осложняющие сравнения степени защиты вакцинированных животных и оценки риска заражения. Кроме того, готовую серию вакцины необходимо оценивать до того, как она будет выпущена для применения в медицинской или ветеринарной практике (Недосеков В., 1998).
Известный способ определения иммуногенной активности инактивированных антирабических вакцин - метод NIH (National Institutes of Health), который был разработан в США в 1953. В условиях научно-технического прогресса, это исследование проводится без каких-либо серьёзных изменений или улучшений в течение шести десятилетий. Методом NIH, как в мире, так и в РФ пользуется большинство лабораторий: производственные лаборатории, биологические фабрики, лаборатории контроля, научные лаборатории. Однако, несмотря на такое широкое использование этого теста, рядом авторов отмечены определённые недостатки постановки этого метода [Недосеков В., 1998; Никитова А.П., 2015 и др.]. Интрацеребральное заражение не воспроизводит естественный путь попадания вируса в организм животного, а сам тест предусматривает 2 вакцинации с интервалом в 7 дней, вторая из которых Бустерная и может маскировать настоящие результаты теста и завышать результаты в вакцинах с низкой иммуногенной активностью.
С помощью метода NIH мы можем оценить только протективную активность антирабических вакцин.
В методе NIH для заражения животных используют фиксированный штамм «CVS», имеющий антигенные и генетические отличия от уличных изолятов вируса бешенства [113].
В течение последних лет широко исследуются различные модификации стандартного теста, поскольку условия контроля вакцин тестом NIH отличаются от условий проведения вакцинации целевых животных на практике [Никитова А.П., 2015]. Были разработаны модификации относительно маскирующего влияния бустерной вакцинации (Barth R., 1988, Цетлин Е. М., 1993 и Недосеков В. В., 1999). До этого следует добавить модификации, заключались в воспроизведении природного пути попадания вируса и вакцины в организм животных (Недосеков В. В., 1998). Однако, несмотря на все вышесказанное, в постановке метода NIH и его модификаций существуют проблемы в неточности и значительной разницы полученных результатов в пределах лабораторий. К этому следует добавить риск опасности для персонала при работе с живым вирусом бешенства, который относится к возбудителям II группы патогенности. Также существуют проблемы, связанные с гуманным обращением с животными, ведь интрацеребральное введение вируса очень жёстокое, как и сам ход болезни.
На основе данных, полученных при изучении молекулярной структуры вируса бешенства, установлено, что основные антигенные детерминанты, индуцируют защитный иммунный ответ, находятся на гликопротеине, содержание которого коррелирует с иммуногенностью антирабических вакцин.
Поэтому, при оценке качества вакцин Комитет экспертов ВОЗ с 1992 года предлагает использовать альтернативные методы in vitro, которые уже с 1984 г. совершенствуются для определения содержания антигенов в вакцинах против бешенства. В качестве примера, можно привести такие, как тест связывания антител (ТЗА), метод радиальной иммунодиффузии (РИД) и различные варианты твёрдофазного иммуноферментного анализа (ТФ-ИФА) [96,125].
Определение контаминации бактериальной и грибной микрофлорой
Итоговая схема культивирования клеток ВНК-21 практически полностью исключала как риск получения сбора вируса с невысоким выходом гликопротеина, так и риск деградации и «сползания» клеток с поверхности стекла. Адъювант обеспечивает более выраженный иммунный ответ, чем сам антиген, что создает: повышение иммуногенности слабых антигенов; увеличение скорости развития и длительности иммунного ответа; модулирование авидности, специфичности, распределения подклассов антител; стимуляцию клеточно-опосредованного иммунитета; индукцию мукозального иммунитета; усиление иммунного ответа у иммунологически незрелых или пожилых лиц; возможность снижения дозы антигена в вакцине и др. При создании адъювантных вакцин необходимо, чтобы они отвечали следующим требованиям: адъювант не должен вызывать поликлональную стимуляцию, приводящую к перегрузке иммунной системы, усиливать реактогенность (местные и общие воспалительные реакции с формированием болезненных абсцессов, язвенных поражений), тератогенность и индукцию аутоиммунных процессов и др.
Всем этим требованиям наиболее полно соответствует иммуноадъювант полиоксидоний — первый оригинальный отечественный препарат нового класса синтетических гетероцепных алифатических полиаминов. Полиоксидоний успешно прошёл испытания в клинической иммунологии, и как классический иммуномодулятор, и как основа для создания новых лекарственных форм, в частности – Лонгидазы. В вакцинологии полиоксидоний используется как адъювант, обеспечивающий: презентацию антигенов, сходную с презентацией в составе вириона, дающий возможность снижения дозы антигенов без ущерба для иммуногенности вакцины, высокую эффективность и выраженность иммунного ответа у всех групп населения, повышение общей резистентности организма к респираторным инфекциям. Под руководством профессора Некрасова было осуществлено включение полиоксидония в качестве иммуноадъюванта в состав противогриппозной вакцины, что привело к созданию нового поколения вакцин, не имеющих аналогов в мире, отличающихся высокой иммуногенностью и самым высоким профилем безопасности, позволяющих использовать её как у младенцев (с 6 мес.), так и у иммунокомпрометированных контингентов населения.
Синтетические иммуномодуляторы получают путём направленного химического синтеза. К этой группе относятся давно известные препараты как левамизол и диуцифон. Представитель нового поколения синтетических иммуномодуляторов – полиоксидоний (N-оксидированное производное полиэтиленпиперазина с высоким молекулярным весом). Препарат обладает широким спектром действия. Он стимулирует функциональную активность фагоцитов, что проявляется в повышенной способности фагоцитов поглощать и переваривать микробы, в образовании активных форм кислорода, повышении миграционной активности нейтрофилов. Суммарным следствием активации факторов естественного иммунитета является повышении устойчивости к вирусным и бактериальным инфекциям. Полиоксидоний повышает функциональную активность Т- и В-лимфоцитов, NK-клеток. Он является мощным детоксикантом, так как обладает способностью сорбировать на своей поверхности различные токсические вещества и выводить их из организма. С этим связана его способность снижать токсичность рада лекарственных средств. Препарат показал высокую эффективность при всех острых и хронических инфекционно-воспалительных процессах любой локализации и происхождения. В силу своих иммуномодулирующих, антиоксидантных, детоксицирующих, мембраностабилизирующих свойств полиоксидоний занял ведущие позиции в урологии, гинекологии, хирургии, аллергологии, онкологической практике. Препарат сочетается с антибиотиками, противовирусными противогрибковыми средствами, с интерферонами, их индукторами и входит в комплексные схемы лечения многих инфекционных заболеваний. Полиоксидоний является одним из немногих иммуномодуляторов, рекомендуемых для применения при острых инфекционных и аллергических процессах.
В нашу задачу входил поиск нового адъюванта, обладающего высокими иммуностимулирующими свойствами и способного заменить импортный препарат сапонин при изготовлении различных антигенов, используемых для получения вакцин против инфекционных заболеваний животных и диагностических сывороток. При этом адъювант должен быть свободным от балластных веществ, не иметь в своем составе антигенов, похожих на антигены хозяина, не обладать онкогенными, аллергенными и токсическими свойствами, легко метаболизироваться в организме животных.
Поиск адьюванта для вакцинации животных антирабической вакциной, заставил нас обратить внимание на отечественные синтетические полиэлектролиты (полиоксидоний, вегетан) успешно применяемые в настоящее время в медицине и в ветеринарии в качестве адьювантов и иммуномодуляторов. Полиэлектролиты обладают иммуностимулирующим действием и избирательно влияют на отдельные звенья иммуногенеза, вызывают значительное повышение интенсивности антителообразования, не нарушая резервных возможностей кроветворной системы. Описанные свойства и послужили основанием для применения полиэлектролитов в качестве адьюванта при вакцинации животных против бешенства.