Введение к работе
Актуальность дроблены: Одной из главных придан гибели молодняка сельскохозяйственных животных з госпитальный период являются острые., гастроэнтериты, внзываемнэ бактериальной инфекцией &та знтеропатогевныш вирусами (Vaniar R. et al., 1983). Среда представитэлеЗ семейств энтеропатогвнных вирусов рота- я короназеруен составляют основную группу возбудителей инфекционных гастроэнтеритов (Holnes I.H.» et al., 1983; Estes Jf.K. et al., 1983; Spaan W. at al., 19Є8). ПО данным КеЪчв С.A. et.al. (1969), яэтблъвость для иоворозденнях теля? при ротавирусном гастрознтеритэ варьирует от 15 до 80. Исследованиями House J.А. (1973) было устансвжно, что каздый чагвартнй случай гибели телят от дабактериального гастроэнтерита происходит по причине коровавирусной ЕЕфекцяз. ;
Для диагностики рота-, и короневирусшх инфекций применяются
ракетчике метода; изоляция вирусов в культурах клеток,
серологические, прямая и ' шаыуноелзктроанзя ' микроскопия и
эдвк^юфорвз в иояяакриламадаэм .геле . (Букринекня А-Г., 1986;
Ґорбачев 2.Н. и соав., IS89).' J
Однатсо, метода изоляции рота- (BR7) .и хорэнавируса (ВС7) крупного рогаюго скота являются достаточно, трудоемкими и занимают большоо количество времени; методі электронной микроскопий - технически слоша и малспригодня для проведения массового анализа образцов (iaporta I. et al., 1979; Sharpee R.L. et al., 1973: Cfeasey D. & Lucas H.X., 1977; Prasad B.V.Y. et al., 1988). Штод алектрсфоретгоеского исследования вирусных нуклеиновых кислот в агврозшх z тагаакр&яашднах гелях широко применяется 'При изучении вариабельности вирусного генома и для электрсфорегйПйрованзя различиях штаммов ротавяруссв (Kodger S.M. qt al., 1977; woCrae Н.І.. et al,,19S2).
Дія идентгйихацня изого^нставнах- штакиов рота- и корона-вчгаусов яспояьгузтся їєкжз традиционные сзролеггчоские метода -реакдаї Еайтрааязгцаа, торжжепшг гвиагглзЕКвацви» связывания кометекенгв з ззьзвофэркаитннй анализ (Гоголзз S.H., Коромыслов Г.6.. ISS4; IS38). Дальнейшему раетрастраневла этех катодов в сяр&йзлэзшй сїїєнєня препятствует кна<жгелшная вариабельность новерхшстшх глннсаротзкнов рота- и коронавкрусов, обусловленная актявныин процессами генеткчэской реконожацаи пх ИйС (Faultoiex-Yalls G.?. et el,, 1932: Eundley F. etal., 1937; Spaan
w. et al., 1988). По этой же причине существущие на сегодняшний день вакцинные препарата нэ в полной степени обеспечивай? надежную защиту, животных от рота- и коронавирусного возбудителей. В сеязи с етм возникает необходимость создания эффективной генна-ишквнерЕоа вакцшш ( JSJidtheen К- et al., 1965; Offii P. et al., 1986; Estes K.K. et al., 1987; Spaan W. et al., 1988 ), a такЕ-з разработав новых методов диагностики рота- и короназирусной инфекция, основанных на достижениях современных методов молекулярной биологин я биотехнология. Таким перспективным диагностическим методом является метод молекулярных гябрвдизацйонкых зондов. - Этот метод основан на гибридизации тем или иным схюсобои меченого зонда с нуклеиновыми кислотвмк- вирусов, про- или эукариот, обусловленной комаленентарностью спецпйччэской нуклеотїтдьой последовательности зонда г уникальной последовательности нлслбшовой кислоты Спслсгяческого объекта. Учитывая оцределенауЕ консервативность конкретного участка генома, несущего полную шформаїїию о характерном для данного рода вирусов белке (например, Еирусосшцифетаской.РНК-иолимэразз рота-или коронаЕжрусоз), представляется возмохнш разработать шбриди-зацношкй зонд для обнаружения всех представителей этого рода (Соіїзп .7. et al., 1934-; Estee м.к. et al.,.1984). Использование же в качестве молекулярного зонда последовательностей генов, кодярушдас лазвргносетн& виоусше протеина, предоставляет реальную возможность для диЩіерзвциальной идентификации рота- и коронавирусэых еїзкмов, относящихся к разомчннм серотипам (Rioiiardaon Ы.А. et. al., 1964-; Potter А.А. et al., 1987? Haiagomi Т., Nabagoff.i О., 198S).
Нбсошзнзо, чта кокплэксная задача выделения последова-телъностой генов, кодирушлх вкдо- или азшоспвцЕфагаоскЕЭ антигены рота- и короназкруса KFC; не ашлвфакацяи в составе генетических векторов, продуктивного синтеза .вирусных антигэнов з эксягрессарухада векторах с -целью последуицай разработки генно-мваенэрЕоа вщщйеы долша решаться поэтапно путем:
(I) ?лолакуляршго синтеза - кДНК- вирусных посладозательностей,
(II) получения предсчавглвльной библиотека- варуезнх генов в
каком-либо фнговом Езк.торэ, (III) выбора подходящих для
разработки диагностического зонда фаговых гслоноз, (IV)
перегслонированая адалц^звковвяных Еирусннх последовательностей в
плазмидвый вехтср с ігасаздуицим их клонкрованиэм в составе
зкспрессируицах векторов.
де^_и_за8ш?_исслеаовяяийл
Целью настоящих исследований являлось конструирование специфического. гиСрвдизационного зонда для идентификации коронаЕируса крупного рогатого скота, осуществляемое путем молекулярного синтеза кДНК на матрще геномной Ж штамма КЛ 2 коронавируса ЕРС, а такка клонирование - синтазирзвенных кДЯК в фаговом векторе л gt ю ив экспрессирущем пдззмидном векторе PGEM4-Z. Кромэ того, предусматривалась, -разработка гибридиза-циоеного ротавирусного зонда на основе рекоыбинштвой плазмида pBRY.06.; отработка оптимальных условий проведения дот-гибрндизациояного анализа, используемого для здектификации рота-к корокавирусов KKJ, а также -сравнение его с .другими методами обнаружения'Этих вирусов.
Для .достшшяия поставленной цели в процессе работы необходимо біло решить следующие задачи:
1. Провести электрофоретическоз исследование Ж выделенных в
различных регионах страны штаммов и полевых изолятов ротавируса
КРС для послэдупцего педтвэрвдешя результатов дот-
габрядизациовного анализа..
2. Получить кДНК- .ротавируезкй зонд и отработать условия
достижения максимальной чувствительности и споцв^чностя ДНК-РНК
гибрядизащкзьногс анализа, используя образца выделенных
ротаваруешх РНК.
-
Осуществить молекулярний синтез цДНК короназяруса крупного рогатого скота; провести молекулярное .клоняровзвЕЭ последовательностей коронаверусноЗ кДНК в фаговом. Езкторе., Я gt ю и переклонкровать их в вкеярэссирущий вектор, рСНИ-2. .
-
Отобрать рекокбинантнкй клон, содержащий. дЩЗК- последовательность, подходящую для конструирования специфического коронавкрусного ГЕбридкзациовногс зонда. '
Ь. Отработать дот- гибрядазацвонвыа метод сиНЕруявния . РЯН коронавируса KPG в культуральном и фекальной материале с Еспользсзэнием сконструированного молекулярного згадв.
Научная нозиива работа. Впервые е стрззэ осуществлен молекулярная синтез. кДНК' на матрице геномной Ж .втачка КЛ 2 коронавируса НРС. Получена- кДНК- библиотека коровэвгрусных гзнов в фзгэ X gt 10, а также их клоиотека г клетках е.call. Разработан агабрэднзацяоянка зонд для идентификации коронавируса КРС, имеющий
протяженность 2.7 тысяч нухлэотидннх пар Сг.н.п.) и содержащий кДНК- последовательности коронавирусных генов, кодирующих структурные: я- нуклеокапсидный и м- мембранный, а также неструктурный 9.5 кД вирусный протеина.
Проведено здактрсфорвишированяе РНК 8 штаммов и 19 изолятов ротавируса КРС, вкд&леннкх в различных регионах страны; предложен кДНК- гибридизациоЕный зонд для обнаружения ротанарусов у КРС. С использовавиек разработанных кДНК- зондов показана высокая эффективность применения дот- гиОридазационного метода для независимого обнаружэняя в фекальном . матариале рота- и коронавирусов SPG.
Практическое значение работы. Предложен .экспресс- метод
электрсфорвтишрования РЖ в микрошгастинах полаакриламидаого геля, яспользуешй для сравнительного анализа- и дафференциации различных изолятов и штаммов ротавяруса у КРС. Отработаны условия ДНК-РНК дот- тибридЕзапдснного анализа, рекомендуемого для точной идентификации з надежной диф$эрбяциацдг- рога- и коронавирусов у КРС при смешавши форыа инфекции. ',-
Нспользуеше для ашшфкации .. коронавирусных -кДНК рекомбинантвке фаги и плазмзды являются.-основой для получения продуктивной экспрессии генов коронавирусных протеинов в клетках E.coli.
Материалы диссертационной работы вошли в подготовленные 'Методические рзЕшендации по идентификации ротавирусов методом РНК-ДНК гибридизацин", одобренные Ученым, советоч ВИЭЗ от 07.12.SO и, экспертной аокиссией по биотехнологии отделения ветеринарной медицины ВАСХНЙЗ от П.12.1990. Методоюсіше рекомендаций предназначены для ' игаюльзованЕШ. - в , практике, и научно-исследовательской работе.
Апробация результатов исследований. . Материалы диссертационной работы получили палояительную.- оценку на научной конференции молодых ученых ЗИЭВ "Проблемы ветеринарной биотехнологии и инфекционной патологии животных" .1967 и 1988 гг., использованы в докладах на заседании Секции биохимии с.-х. жквотаых Всасовзного биохимического общества (1388 г.),. на- заседании Ученого совета ВИЗЗ (1988 г.), на научно-методическом секянаре.по биотехнологии (1989 г.) и скипозауиэ, посвященном вопросам иммунологической диагностики и Емунопроилактики вирусов животных (ГрЕйфевальд, Германия, 1989).
Публикации. Основные положения диссертации опубликованы
в 3 научных работах.
-,, Объем работа. . Материалы диссертации навожены на 160 : страницах-машинописного текста и состоят из следущих разделов: : введения, . обзора-; литературы,- -результатов собственных исследовании, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы и прилокения. Материалы диссертации иллюстрированы 13 рисунка. и 4 таблицами. Список цитируемой литературы содержит 30 работ отечественных и ISO иностранках авторов.