Введение к работе
Актуальность проблемы
Последнее десятилетие отмечено интенсивным изучением аналитических возможностей и практическим применением биосенсорных систем. Потребности медицинской диагностики, различных областей биотехнологии, промышленности, экологических служб ставят перед аналитической химией комплекс задач, связанных с разработкой простых в применении, недорогих, высокочувствительных и специфичных методов и приборов на их основе для обнаружения заданных веществ в образце. Одновременное удовлетворение указанным требованиям достаточно проблематично. Вместе с тем в биосенсорах, совмещающих идеи и достижения современной биологии, электронных технологий , химических наук многие из перечисленных условий выполняются.
Принцип детекции, реализованный в биосенсорах, 'основан на том, что биоматериал (ферменты, клетки, антитела и др.), иммобилизованный на физическом датчике (преобразователе), при взаимодействии с определяемым соединением генерирует зависимый от его концентрации сигнал, который регистрируется преобразователем электрохимического, оптического или иного типа и после обработки данных представляется в численном виде. Простота устройства, оперативность, специфичность и низкая стоимость биосенсорного анализа создают развитию этой области аналитической биотехнологии высокую степень приоритета.
Ион-селективные полевые транзисторы (ПТ) относятся к полупроводниковым потенциометрическим преобразователям, широко используемым для создания биосенсоров; интерес к ПТ обусловлен рядом их достоинств: миниатюрностью, возможностью размещать на одном кристалле полупроводника несколько электродов, сопряженных со схемой обработки сигнала, низкой себестоимостью при массовом производстве. На основе таких приборов созданы биосенсоры, в рецепторной части которых находится биоматериал, катализирующий реакции, сопровождающиеся изменением рН.
Несмотря на значительное количество публикаций, потенциал этого типа преобразователей к настоящему времени полностью не использован. Так, сравнительно мало изучены аналитические возможности биосенсоров, сочетающих ПТ и бактериальные клетки. В моделях иммуносенсо-ров, основанных на ПТ, как правило, используется только уреаза в качестве ферментной метки, что сужает представления о перспективах применения иных ферментов. Незначительно число публикаций, описывающих использование ПТ для регистрации зарядового состояния рецепторного элемента.
Большое внимание уделяется изучению свойств биосенсоров ампе-рометрического типа, в которых в качестве преобразователя используется электрод Кларка. Типичным для биосенсоров этого типа является применение микроорганизмов в рецепторном элементе.
К важным проблемам в области создания амперометрических микробных биосенсоров следует отнести повышение селективности анализа; поиск штаммов, окисляющих чужеродные соединения с целью создания приборов эффективного экологического мониторинга; исследование возможности высокоэффективной детекции ксенобиотиков штаммами, несущими плазмиды их деградации; возможность использовать генно-инженерные метода для получения микроорганизмов с заданными свойствами для повышения аналитического потенциала микробных сенсоров.
Анализ упомянутых проблем и вопросов, направленный на создание и изучение свойств новых биосенсоров потенциометрического типа на основе ПТ, светоадресуемых сенсоров, амперометрических преобразователей служит продвижению в решении основных задач биосенсорики -созданию надежных, высокочувствительных и селективных методов и устройств биодетекции.
Цель работы
Исследования были ориентированы на теоретическое и экспериментальное развитие биосенсорной методологии и создание моделей биосенсорных анализаторов на основе электрохимических преобразователей -полевых транзисторов, светоадресуемых сенсоров и амперометрических преобразователей.
Основной критерий при формулировке задач состоял в получении более совершенных по сравнению с известными биосенсорных систем.
Достижение поставленной цели требовало решения ряда задач, основными из которых являлись
Для группы полупроводниковых биосенсоров:
исследование параметров микробного (детекция глюкозы, ксилозы) и ферментного (детекция ингибиторов хрлинэстеразы) биосенсоров на основе рН-чувствительного полевого транзистора;
разработка модели иммуносенсора и метода формирования унифицированного рецепторного элемента для детекции низкомолекулярных соединений, белков, клеток микроорганизмов;
создание фоточувствительных сенсоров на основе полевого транзистора и белков бактериального родопсина, уреазы;
разработка макета светоадресуемого потенциометрического сенсора;
применение биосенсорной техники для изучения особенностей метаболизма растущих и хемотактирующих популяций бактерий E.coli.
разработка макета светоадресуемого потенциометрического сенсора и регистрирующего усилителя с функциями первичной обработки сигнала.
Для группы амперометрических биосенсоров на основе электрода Кларка:
изучение характеристик микробных сенсоров для детекции легкоути-лизируемых субстратов: углеводов, спиртов, полиолов;
оценка возможности детекции микробными сенсорами веществ чужеродной природы - ароматических ксенобиотиков, ПАВ;
разработка модели микробного медиаторного электрода;
повышение селективности биосенсорной детекции: применение элементов теории распознавания образов;
использование принципа стабилизации параметров микробных биосенсоров путем дополнительной оксигенации среды измерения с помощью полностью фторированных углеродов.
Научная новизна
Работа является комплексным исследованием по оценке аналитического потенциала полевого транзистора и светоадресуемого сенсора как преобразователей в биосенсорах ферментного, иммунохимического и микробного типов. Впервые для группы биосенсоров, основанных на полевых транзисторах, выполнен детальный анализ эффективности использования сменного биорецепторного элемента для иммобилизации ферментов, бактериальных клеток и иммунокомпонент. Предложены две новые модели, содержащие фото-чувствительные элементы на основе белка бактериального родопсина и аналога красителя спиробензопирана. Модели перспективны с точки зрения технологий будущего, сопрягающих процессы переноса/разделения зарядов в органических и биологических материалах с приборами твердотельной электроники; такие системы уже в ближайшее время могут найти эффективное применение в качестве устройств ввода-вывода информации в биологических компьютерах.
Иммунобиосенсоры характеризуются новым, разработанным в диссертации подходом к формированию рецепторного элемента, позволяющим отказаться от традиционно используемого метода химической обработки поверхности ПТ для ковалентной иммобилизации иммунокомпонент. Впервые в практике биосенсоров на основе ПТ в качестве ферментной метки использована пероксидаза хрена (ПХ). Предложена новая композиция субстратов ПХ, обеспечивающая высокую эффективность ее электрохимической детекции, что показано на примере анализа пестицида 2,4-дихлрфеноксиуксусной кислоты, иммуноглобулина G (IgG) человека, термофильных микроорганизмов Clostridium thermocellum. Метод сменных мембран был эффективно применен при создании биосенсора, определяющего содержание пестицидов на основании их ин-гибирующего воздействия на фермент холинэстеразу.
Биосенсоры, основу которых составляют клетки микроорганизмов и амперометрические преобразователи характеризуется следующими элементами новизны:
на основе теоретического анализа предсказана и экспериментально подтверждена эффективность использования бактерий рода Gluconobacter в биосенсорах для определения Сахаров, спиртов, полиолов. Показана их потенциальная полезность для оценок концентрации глюкозы в сыворотке крови человека; глюкозы, ксилозы, глицерина в ферментационных средах, не содержащих другие утилизируемые субстраты.
впервые использованы штаммы бактерий рода Pseudomonas в электрохимических биосенсорах для детекции ароматических соединений, представляющих серьезную опасность для экосистем - нафталина, бифе-нила, бензоата, хлорароматических соединений, поверхностно-активных соединений (ПАВ);
получены новые данные о возможности создания медиаторных ам-перометрических электродов с использованием в качестве биокатализатора бактериальных клеток Gluconobacter oxydans. Результаты создают основы формирующегося в настоящее время нового направления - медиа-торных клеточных электродов и открывают новые перспективы практического применения микробных биосенсоров;
разработана концепция применения элементов теории распознавания образов и экспериментально реализован принцип повышения селективности детекции микробным биосенсором при анализе двухкомпонент-ной среды "глюкоза-этанол". Подход перспективен своей общностью в решении проблемы повышения селективности биосенсорной детекции.
впервые предложена и экспериментально реализована идея стабилизации условий измерения микробными биосенсорами и способ повышения их чувствительности за счет дополнительной оксигенации среды измерения с помощью перфтордекалина - полностью фторированного органического соединения.
Практическая значимость
Созданные модели биосенсоров позволяют представить рекомендации по их наиболее эффективному практическому использованию.
Амперометрический биосенсор на основе бактериальных клеток G. oxydans имеет высокую стабильность и точность, высокую чувствительность к глюкозе (нижний предел определения находится в области 20 мкМ) и позволяет производить надежную оценку ее содержания в сыворотке крови человека. Эта же модель сенсора успешно апробирована в биотехнологической практике для определения содержания глюкозы в ферментационной среде при культивировании грибов рода Мисог; показана возможность оценки содержания ксилозы, глицерина, этанола в однокомпонентных средах.
Модель биосенсора на основе рН-чувствительного полевого транзистора с иммобилизованной холинэстеразой (ХЭ) имеет высокую чувствительность и позволяет оценивать присутствие в образце модельных ингибиторов эзерина и прозерина, начиная с концентраций 10'8 М, а
также присутствие фосфорорганических пестицидов, начиная с концентраций порядка 10'7 М. Биосенсор можно применять для проведения экологического мониторинга с целью обнаружения соединений, модифицирующих активность ХЭ - ионов тяжелых металлов, фосфор-, хлороргани-ческих соединений, веществ нервно-паралитического типа действия.
Создана унифицированная модель иммуносенсора, содержащая минимально необходимый набор элементов, которая дополнена разработанными схемами иммуноанализа и оптимизированным набором субстратной смеси. Биосенсоры эффективны при детекции гербицида 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (нижний предел чувствительности 1 нг/мл); определении иммуноглобулина G человека (диапазон детектируемых концентраций 10'" - 10'7 М); обнаружении в образце микробных клеток (минимальная детектируемая концентрация клеток 104 клеток/мл.
Разработан компактный вариант регистрирующего усилителя, позволяющего производить обработку сигналов (начальной скорости и амплитуды) биосенсоров, основанных на ПТ. Создан автономный прибор - основа биосенсоров потенциометрического типа - светоадресуемый потен-циометрический сенсор, обеспечивающий высокоточные измерения сигналов иммобилизованных ферментов, клеток микроорганизмов и составляющий базу для разработок многоканальных сенсоров нового поколения.
Созданные модели биосенсоров можно рассматривать как прототипы для разработки промышленных высокочувствительных и надежных биосенсорных систем для эффективного использования в медицине, биотехнологии, службах санитарно-эпидемиологического контроля для анализа качества питьевых источников, продуктов питания; службах экологического мониторинга; на промышленных предприятиях для анализа состава и концентрации загрязнителей, поступающих в сточные воды.
Методи исследования
Область проблем, сформулированных в работе, является междисциплинарной и относится к биотехнологии, аналитической химии, электрохимии, биохимии, иммунохимии, микробиологии, электронному приборостроению. В этой связи в работе были использованы соответствующие методы, а именно:
- разработка регистрирующих электронных усилительных устройств;
потенциометрический и амперометрический методы регистрации биохимической активности иммобилизованных биоматериалов;
методы иммобилизации бактериальных клеток, ферментов, имму-нокомпонент в полимерные носители различной природы;
оценка кинетических параметров реакций, протекающих в биорецепторе сенсоров;
методы иммуноанализа и их адаптация для детекции заданного типа антигена;
компьютерные программы регистрации и обработки данных.
Апробация работы
Результаты работы докладывались на III Всесоюзной конференции "Химические сенсоры" (Ленинград, 1989); Международной конференции "Сенсор-91", (Ленинград, 1991); Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология" (Москва, 1991); 8th International Conference of Young Scientists on Organic and Biological Chemistry (Riga, 1991); International Simposium on Biosensors (Moscow, 1992); Международной конференции "Сенсорные системы и компоненты" (Санкт-Петербург, 1993); CIS-German Workshop Biosensors (Muenster, 1993); Конференции грантодержа-телей "Биотехнология защиты окружающей среды" (Пущино, 1994 ); The Third World Congress on Biosensors (New Orleans, 1994); Международной конференции "Enzymatic and Genetic Aspects of Environmental Biotechnology" (Пущино, 1995); Международной научно-практической конференции "Проблемы экологически безопасных технологий производства, переработки и хранения сельскохозяйственой продукции (Сергиев Посад, 1996); Международной конференции памяти А.А.Баева (Москва, 1996); Second Workshop on Biosensors and Biological Techniques in Environmental Analysis (Lund, 1996); 3rd NEXUSPAN Workshop on Microsystems in Environmental Monitoring (Moscow, 1996); 2м Съезде общества биохимиков (Москва, 1997); Fourth International Workshop "Biosensors and biosensing devices in medicine and environmental sciences (Tashkent, 1997); Российско-Германском семинаре по технологической кооперации (Потсдам, 1997); The Fifth World Congress on Biosensors (Berlin, 1998).
Исследования были поддержаны программами "Новейшие методы биоинженерии", направления "Биотехнология защиты окружающей среды", "Инженерная энзимология"; контрактом с Национальным центром по утилизации сельхозпродукции (США); Международным Российско-Американским Консорциумом по техническому, образовательному и экономическому развитию.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 64 печатных работ.
Структура и объем диссертации