Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. 2мкм ДНК дрожжей-сахаромицетов ... .....11
2.1.1. Структура и физико-химические свойства дрожжевой плазмиды 11
2.1.2. Внутриклеточная локализация 2мкм ДНК .... 19
2.1.3. Репликация 2мкм ДНК . 22
2.1.4. Функциональное значение 2мкм ДНК ...... 25
2.2. Экстрахромосомная рДНК (Змкм ДНК) дрожжей ... 30
2.3. Матохондриальная ДНК дрожжей-сахаромицетов. . . 32
2.4. Генетическая трансформация дрожжей ...... 39
3. Материалы и методы исследований . ........ . 45
3.1. Микробиологические методы . 45
3.1.1. Бактериальные штаммы и условия культивирования бактерий 45
3.1.2. Трансформация бактериальных клеток ... 45
3.1.3. Дрожжевые штаммы и условия культивирования дрожжей 46
3.1.4. Трансформация дрожжей 47
3.2. Биохимические методы 49
3.2.1. Выделение тотальной дрожжевой ДНК ... 49
3.2.2. Выделение суперспирализованной дрожжевой
3.2.3. Выделение бактериальной іілазмидной ДНК . 51
3.2.4. Раскапывание градиентов и подготовка к определению радиоактивности исследуемого материала 52
3.2.5. Фракционирование ДНК в градиентах нейтрального хлористого цезия 53
3.2.6. Синтез комплементарной радиоактивной РНК 53
3.2.7. РНК-ДНК гибридизация . 54
3.2.8. Рестрикция ДНК и лигирование рестрик-пионных фрагментов 54
3.2.9. Электрофорез ДНК в агарозном геле . . 55
3.2.10. Определение концентрации ДНК спектро-флюорометрическим методом 56
3.2.11. Фракционирование РНК электрофорезом
3.2.12. «отографарование флюоресцирующей ДНК в УФ 58
3.2.13. Определение радиоактивности препаратов 58
4, Результаты исследований 60
4.1. Выделение ковалентно-замкнутых ДНК дрожжей, . 60
4.2. Рестрикциоиный анализ 2шш ДНК 67
4.3. Исследование сравнительного содержания 2шш ДНК 73
4.3.1, Очистка ДНКазы от РНКазных примесей. . 76
4.3.2, Получение и очистка транскрипта 2мкм ДНК 79
4.3.3, Определение зависимости уровня гибридизации от количества ДНК на фильтре . 79
4.3.4, Определение влияния избытка гетерологи-чной ДНК на уровень гибридизации зн-кРНК ........ 81
4.3.5, Определение содержания 2мкм ДНК в различных штаммах дрожжей 83
4.4. Определение природы минорной фракции ДНК в препаратах кольцевых ковалентно-замкнутых молекул 87
4.4.1. Очистка и определение плавучей плотности минорной фракции кз ДНК 87
4.4.2. Гибридизация кзДНК с Н-транскриптом мтДНК 88
4.4.3. Электронная микроскопия легкой Фракции кзДНК I . . . 91
4.5. Конструирование двухрешшконной дрожжевой плазмидн 94
4.5.1. Конструирование плазмиды 95
4.5.2. Селекция и идентификация рекомбинантной плазмиды 99
4.5.3. Проверка трансформирующей активности и генетической стабильности плазмиды
в дрожжевых клетках 104
5. Обсуждение результатов НО
Выводы 119
Литература 122
- 2мкм ДНК дрожжей-сахаромицетов ...
- Микробиологические методы .
- Выделение ковалентно-замкнутых ДНК дрожжей,
Введение к работе
Быстрое развитие биохимических методов исследования нуклеиновых кислот, открытие специфических и возникновение техники рекомбинантных ДНК при манипулировании с плазмидами и отдельными генами создало предпосылки для проведения экспериментов по конструированию новых комбинаций генов и переносу их в гетерологичные микроорганизмы. Очевидно, что эта методология в скором времени послужит базой для создания новых штаммов промышленных микроорганизмов, необходимых в медицине, сельском хозяйстве и микробиологической промышленности»
Следует отметить, что традиционное использование бактериальных клеток в качестве реципиентов рекомбинантных плазмид часто оказывается удачным лишь для клонирования последовательностей ДНК» Добиться экспрессии клонированного в бактериях гетерологичного генетического материала часто не удается Предполагают, что препятствием для экспрессии клонированных в бактериальной клетке генов являются различия в системе транскрипции и трансляции, а так- же посттранскрипционные модификации РНК и посттрансляционные перестройки полипептидов» В связи с этим для успешной экспрессии гете-рологичных генов требуется создание широкого спектра альтернативных систем "вектор-хозяин", в том числе и на основе эукариотиче-ских микроорганизмов» Для таких систем наиболее перспективным "хозяином" можно считать дрожжи-сахаромицеты, в которые уже сейчас удалось ввести некоторые эукариотические гены и получить полноценные биологические белки, например, интерферон человека» Для переноса генов в дрожжевые клетки создан ряд векторных молекул ДНК, реплицирующихся как автономно, так и в составе хромосомной ДНК. Наиболее подходящими векторами представляются многокопийные автономно реплицирующиеся молекулы, так как они позволяют увеличить дозу гена, что, в свою очередь, может привести к повышению выхода целевого продукта. Несмотря на большие успехи в области создания дрожжевых векторов, существует много невыясненных до конца вопросов, связанных с особенностями внутриклеточного поведения дрожжевых плазмид, как природных, так и рекомбинантных. В частности к моменту начала нашей работы оставались неясными вопросы о фракционном составе экстрахромосомных ДНК дрожжей и механизме их репликации. Кроме того, большая часть работ по исследованию экстрахромосомных ДНК дрожжей была выполнена в зарубежных лабораториях Поэтому, штаммы дрожжей, имеющиеся в отечественных генетических коллекциях, оставались мало изученными. Это позволило сформулировать цель работы следующим образом: изучить качественно и количественно фракционный состав экстрахромосомных ДНК дрожжей -сахаромицетов из Петергофской генетической коллекции и особенности их репликации Актуальность выбранной темы исследований подтверждается тем, что она выполнялась в рамках комплексной проблемы 0 74 05 "Разработать новые направления исследований генетического аппарата, биополимеров и структур клетки, осуществляющих важнейшие проявления жизнедеятельности, и внедрить достижения молекулярной биологии в народное хозяйство" в соответствии с постановлением ГК НТ СССР, Госплана СССР и АН СССР от 13 02.81 г. J& 24/25/13.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- подобрать оптимальный метод экстракции экстрахромосомных ДНК из дрожжевых клеток;
- выделить и проанализировать экстрахромосомные ДНК из выбранных дрожжевых штаммов; оценить содержание экстрахромосомных ДНК в исследуемых штаммах и попытаться обнаружить факторы, определяющие содержание плазмидной ДНК в дрожжевой клетке;
- сконструировать рекомбинантную плазмиду, способную эффективно трансформировать дрожжевые клетки и стабильно поддерживаться
в популяции В результате проделанной работы были получены новые знания о физиологии экстрахромосомных ДНК дрожжей-сахаромицетов. Наученая новизна представленных в диссертации результатов заключается в том, что впервые:
- проведен качественный и количественный анализ экстрахромосомных ДНК отечественных дрожжевых штаммов;
- показано, что наличие или отсутствие митохондриального генома не влияет на копийность дрожжевой плазмиды;
- обнаружена корреляция между плоидносты) клетки и копийностью плазмидной ДНК дрожжей;
- создана бифункциональная векторная плазмида нового типа,
содержащая два независимых дрожжевых репликатора.
Исходя из полученных экспериментальных данных, их анализа и сравнения с имеющимися в литературе сведениями, на защиту выносятся следующие положения: в исследованных штаммах отечественного происхождения 2 мкм ДНК представлена редко встречающейся укороченной формой, аналогичной scp-з и содержится в количестве 87±2 копий на гаплоидный геном; содержание 2 мкм ДНК на гаплоидный геном остается постоянным в изогенных In и 2п » J? и jf штаммах, что предполагает наличие ядерного контроля копийности плазмиды; выделена экстрахромосомная ковалентно замкнутая ДНК контурной длиной 24,8 0,6 мкм, гомологичная по последовательности мтДНК дрожжей, соответствующая по размеру полному митохонд-риальному геному, постулированному ранее на основе генетических данных; количество препаративно выделенной 25 мкм ДНК соответствует приблизительно одной копии на клетку; сконструирована плаз-мида с двумя дрожжевыми репликаторами йлкм и экстрахромосомной рДНК , которая эффективно трансформирует различные штаммы дрожжей и стабильно поддерживается в них без изменения молекулярной структуры.
2мкм ДНК дрожжей-сахаромицетов
2 мкм ДНК, она же омикронная ДНК или оДНК, впервые была обнаружена в 1967 году при электронно-микроскопическом исследовании препаратов тотальной ДНК дрожжей группой Рабиновича /151/. Несколько позднее эта плазмида была обнаружена в других лабораториях, после чего наступил период ее интенсивного изучения.
В 1971 г. Guereneau et ai обнаружили, что значитель -ные количества оДНК удается получить из митохондриально-мембран-ной фракции дрожжей /67/. В 1972 г. был описан метод выделения дрожжевой плазмиды, обеспечивающий количественный выход исследуемого материала /33/.
Собственно 2 мкм - средняя величина дрожжевой плазмиды, так как по данным различных авторов ее контурная длина варьирует от 1,8 до 2,2 мкм /17, 67, І5ІД Однако эти различия связаны не с истиным расхождением контурных длин, а с различиями в методах, используемых при их измерении в различных лабораториях /66/. По многочисленным данным плавучая плотность оДНК в градиенте нейтрального хлористого цезия равна плавучей плотности ядерной ДНК дрожжей /67, 151/, что составляет 1,698 г/см3. Так как оДНК внутри клетки находится в суперспирализованном состоянии, она легко могла быть выделена из клеточных лизатов дрожжевых клеток центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия с бромистым ЭТИДИеМ, Как ЭТО бЫЛО Предложено Radloff et ай /139/.
При анализе этих суперспирализованных ковалентно замкнутых молекул было показано, что их контурная длина равна 2 мкм /17, 151/, откуда и название плазмиды. Кроме колец с контурной длиной 2 мкм были обнаружены молекулы длина которых в 2, 3 и более раз превышает длину изучаемой плазмиды /67/. С помощью рестрикционного и гетеродуплексного анализа было показано, что эти молекулы являются олигомерами 2 мкм ДНК /87, 141/. Содержание олигомеров в клетке как правило не превышает 10-15 % общего пула 2 мкм ДНК, причем девять десятых из них являются димерами, а на долю три-меров приходится, соответственно, 1-2 % /141/. Кинетическая сложность дрожжевой плазмиды соответствует ее контурной длине и составляет 6 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.) /104/ По данным разных авторов содержание 2 мкм плазмиды в гаплоидной клетке варьирует от 30 до 100 копий /33, 37, 104, 147/. По-видимому, эти различия в содержании плазмиды связаны с различным происхождением изученных штаммов дрожжей.
Интересные данные были получены при изучении рестрикционных карт 2 мкм ДНК и электронно- шкроскопическом исследовании дрожжевой плазмиды методом гетеродуплексного анализа /II, 64, 69, 70, 141/. Было установлено, что обработка кольцевой ковалентно замкнутой оДНК рестриктазой ЕСО RI приводит к образованию 4-х фрагментов с молекулярными массами 2,45.10 , 2,35.10 , 1,55.10 и 1,45.10 дальтонов, обозначаемых, соответственно, как "I, 2, 3 и 4-й фрагменты". Таким образом суммарная молекулярная масса рестриктов составляет 8.10 Д, что ровно в два раза превышает размер молекулы. С другой стороны обработка 2 мкм ДНК рестриктазой Hind ш приводила к образованию 5 фрагментов: с молекулярными массами 2,48.I06, I.77.I06, 1,44.ТО6, 0,9.106 и 0,6.10? то есть суммарный размер плазмиды в этом случае составляет 7,2.10 дальтонов. Различие между суммарной молекулярной массой фрагментов при обработке рестриктазой ЕСО RI и Hind xii -0,8.10 Д. Результаты рестрикционного анализа в сочетании с тем фактом, что кинетическая сложность дрожжевой плазмиды не превышает 6000 нуклеотидных пар /104/ позволили предположить существование двух генетически однородных типов 2 мкм ДНК. Различие между суммарной массой фрагментов Hind ш и ЕСО RI объясняется наличием общего для обеих форм фрагмента Hindi ш и представленного таким образом в двойной молярной концентрации. Речь идет о четвертом Hindin фрагменте с молекулярной массой 0,9.10 Д. Таким образом истиная сумма фрагментов
Микробиологические методы
При использовании HB IOI для трансформации рекомбинантными плазмидамй, бактерии выращивали в L -среде, содержащей I % бактотриптона, 0,5 # дрожжевого экстракта и 0,5 % Naci Если бактериальную культуру применяли для выделения из нее амплифипиро- ванной хлорам$иниколом плазмиды, то его выращивали в минималь ной среде - М9. Для ее приготовления к 100 мл солевого раствора ( Na HPO 7Н О - 13,2д, К НРО - Зд, NaCl - 5д , NH С1 - 2 4 2 2 4 4 ю д ) прибавляли 840 мл воды, по 10 мл 0,01 М Caci и 0,1 М Mgci , и по 20 мл 20 % глюкозы и 20 % раствора каза миновых кислот Все исходные растворы автоклавировали.отдельно и объединяли в стерильных условиях после охлаждения до комнатной температуры Инокулят для заражения выращивали в течение ночи в L к ре-де и заражали свежую среду, прибавляя 1/200 ее объема ночного инокулята Выращивание проводили в термостатированной качалке при температуре 37
Для выращивания культуры на чашках в среды добавляли агар до конечной концентрации 2 %,
Трансформация бактериальных клеток Бактериальные клетки трансформировали по методу, предложенному Cohen и соавт /41/. Штамм НВ 101 выращивали в 200 мл L -среды до оптической плотности А - 0,3, после чего среду охлаждали в ледяной бане и все дальнейшие операции проводили на холоду. Охлажденную суспензию клеток осаждали десятиминутным центрифугированием при 3000g , промывали 50 мл буфера, содержав щего 5 мМ трис, рН 7,5, 5 мМ M9Ci2 , 100 мМ Naci , и после промывки ресуспендировали клетки в 30 мл этого же буфера, но содержащего 50 мМсасі2. После 20-минутной инкубации в ледяной бане клетки собирали центрифугированием и суспендировали в буфере с caci в объеме I мл. К каждой аликвоте клеточной суспензии, объемом 100 мкл, добавляли трансформирующую ДНК (10 мкл) и инкубировали их во льду в течение 30 минут. По окончании инкубации пробы переносили на 90 сек в водяную баню с температурой 42, а затем вновь инкубировали 30 мин во льду. После этого в пробы добавляли 1,9 мл L -среды с выбранным антибиотиком и инкубировали их при 37 в течение часа. Проинкубированные клетки высевали на чашки с антибиотиками (выбор антибиотика диктовался селектируемым признаком). Выросшие колонии проверяли по другим признакам (чувствительность к определенным антибиотикам, способность к росту на минимальных средах и т.д.).
Дрожжевые штаммы и условия их культивирования.
В экспериментах по исследованию экстрахромосомных ДНК дрож- жей-сахаромицетов использовались штаммы из Петергофской генетической коллекции: pI92 , а# ade , pI92/I, а#ade2,rho,6ПГ-3 , ade ads oCade./ ПГ-60#Зг-г -r-2l4P-48 /c adexcC/i /%/ Кроме того в х а аае аае работе использовался штамм 6-ІГ-Ш88, a, hisi, lys 9 /2/; DC-5 cir и DC«5, cir+ , полученные от Ларионова В.Л. (ВНИИ особо чистых биопрепаратов, Ленинград).
Дрожжевые клетки выращивали либо в полной среде УЕРД (2 % пептон, 2 % глюкоза, I % дрожжевой экстракт), либо в минимальной Среде (3,5 % Yeast Nitrogen Base,(DIFCO), 2 % ГЛГОКОЗа).
Дрожжевой инокулят выращивали в течение 60 час и заражали им свежую среду добавлением 1/100 ее объема» Іфльтивирование про водили при 30 на термостатированной качалке в условиях хорошей аэрации.
Для введения радиоактивной метки в ДНК дрожжей in vivo среду подкисляли концентрированной неї до рН 1,0 и обрабатывали ее активированным углем в течение 2 час. Активированный уголь удаляли фильтрованием, подводили рН до 6,2 «аон и авто-клавировали среду. В качестве радиоактивного предшественника использовали I4G или 3Н-аденин, которые добавляли в среду непосредственно перед заражением до конечной концентрации I и 10 мкЕ/л, соответственно.
Выделение ковалентно-замкнутых ДНК дрожжей
В соответствии с ранее сформулированной целью исследования нашей первоочередной задачей являлось получение экстрахромосомной ДНК дрожжей и изучение ее физико-химических свойств» Для этого нами был использован метод извлечения ковалентно-замкнутой дрожжевой ДНК, предложенный ранее /33/, с некоторыми изменениями, описанный в методической части данной работы Модификация состояла в максимальном упрощении метода с целью сокращения времени выделения и, соответственно, уменьшения степени деградации препарата. В результате исключения одной из стадий дифференциального центрифугирования и технических усовершенствований на остальных стадиях удалось вдвое (до I часа) сократить затраты времени от момента добавления бромистого эти-дия до добавления csci . Так как этот этап наиболее критичен для сохранения нативности ковалентно-замкнутой ДНК в препаратах, введенные усовершенствования позволяли рассчитывать на су щественное увеличение выхода кзДНК из дрожжевых клеток. Лизат митохондриально-адембранной фракции подвергали равновесному ульт-рацентри$угированию в градиенте csci . бромистый этидий. После 48 часов ультрацентри угирования образовавшиеся зоны визуализировали ультрафиолетовым светом. На рис.6 приведена фотография распределения фракций ДНК, полученных из митохондриально мембранной фракции. Так как ультрацентрифугирование проводили в условиях избытка бромистого этидия, плавучая плотность линёй-г ных и релаксированных молекул ДНК в результате связывания бромистого этидия уменьшалась в значительно большей степени, чем плавучая плотность ковалентно-замкнутых молекул ДНК /139/. В Рис,6« Распределение ДНК митохондриально-мембранной фракции дрожжей S. cerevisiae. ПГ-60 в градиенте CsCl-бромитсый этидий. А - фотография центрифужной пробирки при ультрафиолетовом освещении; В - денситограмма негатива фотографии, кз ДНК, П - ядерная ДНК, Ш - линейная митохондриальная ДНК, соответствии с этим кзДНК располагаются в более тяжелой зоне градиента, а линейные молекулы - в более легкой. Так как линейные молекулы ДНК неоднородны по нуклеотидному составу, то они в свою очередь тоже образуют две дискретные зоны: более тяжелую фракцию хромосомной ДНК и более легкую фракцию мито-хондриальной ДНК. Таким образом, нижняя зона соответствует фракции ковалентно-замкнутых молекул, вторая зона представляет собой ядерную ДНК и третья (верхняя) представлена линейными молекулами мтДНК. Рядом приведена денситограмма негатива, дающая представление о количественном соотношении фракций ДНК.
Аналогичным образом в градиенте CsCl. - бромистый этидий анализировали и другие клеточные фракции, полученные в ходе выделения: цитозол и фракцию ядер и крупных клеточных обломков (1500 g). Ви в одной из них обнаружить фракцию ковалентно-замкнутых ДНК обнаружить не удалось.
Для более строгого анализа фракционного состава ДНК мито-хондриально-мембранной фракции определяли распределение радиоактивного материала в градиенте CsCi -бромистый этидий. В этом случае ДНК выделяли из дрожжей, выращенных в присутствии радио-активномеченых предшественников нуклеиновых кислот ( Н - адени-на или С - урацила) Содержимое пробирки после ультрацентрифугирования с помощью перистальтического насоса отбирали со дна и раскапывали в тефлоновые блоки, примерно по 100 мкл фракция. После раскапывания градиента аликвоты из каждой фракции переносили во второй тефлоновый блок и удаляли щелочелабилъный материал гидролизом в 0,3 М кон. После нейтрализации пробы переносили на фильтры Ватман ЗММ и определяли радиоактивность кислотонерастворимой фракции на сцинтилляционном счетчике в толу ольном сцинтилляторе. Профили распределения радиоактивного материала представлены на рис.7. Полученный профиль, в основном совпадал с профалем флуоресценции комплекса ДНК-бромистый 9ТИДИЙ» представленный на рис.6. При анализе графиков распределения радиоактивной ДНК мы обратили внимание на определенную ассиметричность пика ковалентно-замкнутых молекул, связанную с его растяжением в область меньшей плавучей плотности Наиболее естественное объяснение этого факта значительная гетерогенность этой фракции молекул ДНК по нуклеотидному составу. Для экспериментального подтверждения фракцию ковалентно-замкнутых молекул освобождали от бромистого этидия и фракционировали ультрацентрифугированием в градиенте нейтрального csci . Результаты фракционирования полностью подтвердили предположение о неоднородности нуклеотидного состава дрожжевой ДНК во фракции ковалентно-замкнутых молекул. График распределения ДНК по радиоактивности в этом эксперименте приведен на рис.8. Основная фракция совпадала по плотности с очищенной дрожжевой ядерной С - ДНК, использованной в качестве маркера. Такое совпадение плавучей плотности характерно для 2 мкм ДНК дрожжей /67, 151/. Природу тяжелого лика кзДНК исследовали методом электрон-но« аикроскопического анализа, микрофотография препарата дрожжевых плазмидных ДНК приведена на рис.9. Более 99 % ДНК тяжелого пика представлено кольцевыми суперспирализованными молекулами. 88 % молекул имели контурную длину 1,98 0,05 мкм (по данным измерения 80 молекул). На микрофотографиях наблюдаются и димер-ные молекулы (около 12 %)