Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературных источников 10
1.1. Биологические особенности вольфии бескорневой (Wolffia arrhiza) 10
1.2. Особенности индукции морфогенеза Lemnaceae 12
1.3. Методы трансформации растений
1.3.1. Агробактериальный метод трансформации растений 15
1.3.2. Биолистический метод трансформации растений
1.4. Методы генетической трансформации Lemnaceae 21
1.5. Особенности векторных конструкций, используемых для трансформации растений 25
1.5.1. Промотор 25
1.5.2. Интрон 26
1.5.3.Терминатор 26
1.5.4.Репортерный ген 27
1.5.5. Селективный ген 28
1.6. Lemnacea как экспрессионная платформа для биофарминга 30
1.7. Технология ферментационных процессов
1.7.1. Технология выращивания культур растительных клеток 35
1.7.2. Принцип действия биореакторов 38
1.7.3. Конструкция биореакторов
1.7.3.1. Система перемешивания 40
1.7.3.2. Система теплообмена 42
1.7.3.3.Система пеногашения 43
1.7.3.4. Система контроля кислотности 44
1.7.3.5. Система контроля парциального давления растворнного газа 44
1.7.3.6. Система стерилизации 45
1.7.4. Lemnaceae как объект культивирования в биореакторе 46
1.8. Питательные среды 48
1.8.1. Состав питательных сред и роль их отдельных компонентов 48
1.8.1.1. Неорганические составляющие сред 48
1.8.1.2. Органические составляющие сред 50
1.8.2.Типы питательных сред 51
1.9. Заключение по обзору литературы 52
Глава 2. Экспериментальная часть 54
2.1. Материалы и методы 54
2.1.1. Объекты исследования 54
2.1.2. Подготовка и приготовление сред 54
2.1.3. Генетическая трансформация 54
2.1.3.1. Биолистическая трансформация 54
2.1.3.1.1. Векторная конструкция для биолистической трансформации вольфии. 54
2.1.3.1.2. Подготовка ДНК и обстрел микрочастицами 56
2.1.3.1.3. Методика биолистической трансформации вольфии 56
2.1.3.1.4. Флуоресцентный анализ активности гена gfp 57
2.1.3.2. Агробактериальная трансформация 57
2.1.3.2.1. Штаммы Agrobacterium tumefaciens и бинарные вектора 57
2.1.3.2.2. Методика агробактериальной трансформации вольфии 58
2.1.3.2.3. Селекция трансгенных тканей 59
2.1.3.2.4. Гистохимический анализ активности гена uidA 60
2.1.3.3. Расчет эффективности трансформации 60
2.1.4. Молекулярно-генетический анализ трансгенных образцов вольфии .. 61
2.1.4.1. Выделение тотальной растительной ДНК 61
2.1.4.2. ПЦР-анализ трансгенных растений 62
2.1.4.3. Визуализация продуктов ПЦР 64
2.1.4.4. Выделение тотальной растительной ДНК в препаративных количествах 64
2.1.4.5. Саузерн блот анализ 65
2.1.5. Количественный анализ содержания белка 66
2.1.5.1. Выделение тотального водорастворимого белка 66
2.1.5.2. Определение концентрации белка, метод Мерион Бредфорд
2.1.6. Технические параметры биореакторов 68
2.1.7. Методика подготовки посевной дозы для биореактора 68
2.1.8. Физическое моделирование методом Монте-Карло 70
2.1.9. Построение и решение оптимизационных моделей средствами программ MSExcel 71
2.1.10. Статистическая обработка данных 72
2.2. Результаты и обсуждение 73
2.2.1. Изучение условий, влияющих на рост эксплантов вольфии в условиях in vitro 73
2.2.1.1. Индукция каллусообразования вольфии бескорневой 73
2.2.1.2. Субкультивирование каллусных структур вольфии бескорневой 95
2.2.1.3. Регенерация вольфии бескорневой 96
2.2.1.4. Цикл культивирования экспланов вольфии бескорневой 97
2.2.2. Определение концентраций селективных агентов для селекции трансгенных клеток и тканей 100
2.2.3. Генетическая трансформация вольфии бескорневой 103
2.2.3.1. Изучение факторов, влияющих на эффективность биолистической трансформации вольфии бескорневой 103
2.2.3.2. Изучение факторов, влияющих на эффективность агробактериальной трансформации вольфии бескорневой 105
2.2.4. Разработка режима культивирования вольфии бескорневой 111
2.2.4.1. Компоненты питательных сред как факторы повышения продуктивности вольфии 111
2.2.4.2. Моделирование индивидуально-сбалансированной среды для культивирования вольфии бескорневой 120
2.2.4.3. Абиотические условия культивирования как факторы повышения продуктивности вольфии 128
2.2.5. Глубинное культивирование вольфии бескорневой (Wolffia
arrhiza) 131
2.2.5.1. Модификация узлов биореактора 131
2.2.5.2. Глубинное культивирование вольфии в биореакторе 137
Заключение 140
Выводы 142
Библиографический список
- Методы генетической трансформации Lemnaceae
- Генетическая трансформация
- Молекулярно-генетический анализ трансгенных образцов вольфии
- Определение концентраций селективных агентов для селекции трансгенных клеток и тканей
Введение к работе
Актуальность темы. В течение последних 30 лет технологии наработки рекомбинантных белков на базе различных экспрессионных систем привлекают внимание ряда исследователей (Дейнеко, 2014). В клетках прокариот-продуцентов гетерологичных белков не происходят посттрансляционная модификация и правильная укладка полипептидных цепей многих эукариотических белков. Клетки дрожжей, млекопитающих и насекомых лишены подобного недостатка, но использование их в качестве биопродуцентов ограничено трудоемкостью культивирования и, как следствие, высокой себестоимостью получаемых рекомбинантных белков (Russell et al., 1999). Наиболее экономически рентабельными и биологически эффективными представляются растительные платформы (Mett et al., 2008), что способствует развитию отрасли биофарминга [применение методов генной инженерии к живым организмам для индукции или увеличения производства ими биологически активных молекул (Тарантул, 2009)]. Процессы гликозилирования и фолдинга белков, происходящие в клетках высших растений, схожи с таковыми в клетках млекопитающих. Растительные платформы характеризуются отсутствием общих для человека и животных патогенов, а также высоким уровнем экспрессии гетерологичных белков (Daniella et al., 2001). Однако использование биофарминга предъявляет к растениям-продуцентам определённые требования: простота культивирования, высокие уровни содержания белка в тканях, прогрессии наработки биомассы и регенерационной способности в условиях in vitro. Растения семейства Lemnaceae в наибольшей степени соответствуют перечисленным критериям.
Степень разработанности. Методы генетической инженерии
Lemnaceae начали развиваться сравнительно недавно. В начале 21 века были получены первые трансгенные растения рода Lemna и Spirodela, экспрессирующие рекомбинантные терапевтические белки (Stomp and Rajbhandary, 2000; Gasdaska et al., 2003). Успешные работы по транзиентной наработке рекомбинантных белков в растениях рода Wolffia на данный момент ограничены видами W. australiana и W. globosa (Kruse et al., 2001; Boehem et al., 2001; Friedrich, 2005; Pham et al., 2010). Получение растений со стабильной экспрессией затруднено ввиду отсутствия эффективных протоколов каллусогенеза и регенерации ряски рода Wolffia.
Несмотря на то, что главной целью исследований, проводимых в последнее время в области биотехнологии с использованием вольфии, является генетическая трансформация и наработка рекомбинантных белков, коммерческая реализация подобных проектов требует разработки методики культивирования растений вольфии, в частности, определения оптимальных условий роста растения-продуцента и накопления синтезируемого им продукта.
Существующая в настоящее время методика поверхностного
культивирования растений семейства Lemnaceae не обеспечивает
максимально полезного использования рабочих объемов ферментера,
поэтому поиск новых подходов к решению данной проблемы является актуальным. Одним из альтернативных подходов может стать глубинное культивирование вольфии, которое позволяет использовать для продукции биомассы не только поверхность культивационного блока, но и его глубину.
Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования состояла в создании экспрессионной платформы для наработки рекомбинантных белков на основе растений Wolffia arrhiza.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Разработка протокола индукции морфогенеза вольфии бескорневой;
-
Разработка протокола генетической трансформации вольфии бескорневой;
-
Разработка трофического режима вольфии бескорневой;
-
Разработка режима глубинного культивирования с применением биореактора, обеспечивающего максимальную продуктивность растений вольфии.
Новизна и практическая значимость работы. Впервые в мире разработан полный цикл культуры in vitro (индукция каллусогенеза, субкультивирование и регенерация) вольфии бескорневой. Впервые в мировой практике получены трансгенные растения вольфии бескорневой, геномная вставка рекомбинантной ДНК в которых подтверждена методами ПЦР и Саузерн блоттинга. Впервые с использованием оптимизационной модели биологических процессов разработан состав индивидуально-сбалансированной культивационной среды, обеспечивающей максимальную продуктивность вольфии как по приросту биомассы популяции, так и по выходу тотального водорастворимого белка, и разработан протокол стабильного глубинного культивирования вольфии в гидродинамическом биореакторе.
Методология и методы диссертационного исследования.
Диссертационная работа выполнена с использованием классических и современных методов культуры клеток и тканей, молекулярно-генетические и биохимические исследования проведены с использованием классических методов с применением сертифицированного оборудования. Подробно методология и методы исследования изложены в разделе «Материалы и методы».
Положения, выносимые на защиту:
-
Особенности индукции каллусогенеза, субкультивирования и регенерации эксплантов вольфии бескорневой;
-
Методики генетической трансформации вольфии бескорневой;
-
Особенности трофического режима вольфии бескорневой;
-
Глубинное культивирование растений вольфии бескорневой с применением биореактора, обеспечивающего максимальную продуктивность.
Степень достоверности и апробации результатов. Результаты исследований представлены на X, XI и XII Молодежных научных конференциях «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и
ветеринарии» (Москва, 2010, 2011, 2012), Международной научно-
практической конференции «Клеточная биология и биотехнология растений»
(Минск, 2013), Международной научной конференции «биология и
биотехнология растений» (Алматы, 2014), 3-ей Международной
конференции «Генетика, геномика, биоинформатика и биотехнология растений» (Новосибирск, 2015) и Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты биотехнологии» (Иркутск, 2015).
Личный вклад автора. Личное участие автора состоит в
непосредственном планировании и выполнении экспериментов, анализе
полученных данных и их оформлении для публикаций. Подавляющая часть
экспериментальной работы выполнена соискателем самостоятельно. Все
генетические протоколы и трансгенные растения вольфии, разработаны и
получены лично автором. Первоначальный дизайн узлов модификации
биореактора также разработаны лично автором. П.А. Хватков
самостоятельно выполнял молекулярно-биологический анализ трансгенных растений (за исключением Саузерн блоттинга). Теоретический анализ полученных результатов П.А. Хватков проводил совместно с научным руководителем диссертационной работы.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, 4 из которых входят в перечень научных изданий, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из
введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследований,
результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка
используемой литературы. Работа изложена на 172 страницах
Методы генетической трансформации Lemnaceae
Вне зависимости от метода трансформации для ее успешной реализации, прежде всего, необходимо иметь надежную и высокоэффективную систему регенерации целых растений в условиях in vitro (Bregitzer et al., 1998).
Регенерационная способность является свойством генотипа и зависит не только от видов и сортов, но даже от отдельных растений (Козырева и Дунаева, 1994; Шаяхметов, 2001; Чернобровкина и др., 2004; Magnusson and Bornmann, 1985; Luhrs and Lorz, 1987; Bregitzer, 1992; Lemaux et al., 1998; Jacobsen et al., 1999; Barro et al. 1999; Klcova et al., 2004; Filippov et al., 2006). В то же время успешное культивирование клеток и тканей в условиях in vitro в значительной степени определяется типом экспланта и условиями, при которых осуществляется индукция каллусогенеза и регенерации. Если такие условия достигаются не в полной мере, то клетки экспланта оказывается в относительно неблагоприятных физико-химических условиях, что приводит к невозможности реализации ее морфогенетических потенций (Войнов и др., 2009). Наиболее сложными в этом плане являются однодольные растения. Так у зерновых культур до недавнего времени для индукции каллусообразования и последующей регенерации использовали только незрелые зиготические зародыши (Luhrs and Lorz, 1987; King and Kasha, 1994; Oka et al., 1995; Stiff et al., 1995; Lemaux et al, 1999; Altpeter, 2000; Oldach, 2001; Chang et al, 2003).
Морфогенез любой культуры зависит от состава питательной среды. В литературных источниках было отмечено 7 основных факторов, влияющих на процесс каллусогенеза рясковых:
1. Тип добавляемого в среду углевода. Чаще всего для индукции каллусогенеза у рясковых используют сахарозу (Edelman et al, 1998; Stomp and Rajbhandary, 2000; Li et al, 2004; Vunsh et al., 2007; Firsov et al., 2015), или глюкозу, мальтозу и галактозу (Li et al, 2004). Так было отмечено положительное влияние галактозы на морфологию каллуса и его регенерационные возможности на Spirodella oligorhiza и сахарозы на растения рода Lemna (Li et al., 2004).
2. Концентрация углевода. Углеводы добавляют в среду для индукции каллусогенеза как правило в концентрациях от 1% (Edelman et al, 1998; Li et al, 2004; Vunsh et al., 2007) до 3% (Stomp and Rajbhandary, 2000; Firsov et al., 2015). Наиболее успешный каллусогенез Spirodella oligorhiza и Lemna gibba отмечался при прекультивации эксплантов на среде с добавлением 1,5% галактозы с последующей индукцией каллусогенеза на средах с добавлением 1% сахарозы (Li et al, 2004; Vunsh et al., 2007).
3. Возможно применение маннитола и сорбитола в концентрациях от 1% до 2% (Li et al, 2004; Vunsh et al., 2007). Так успешная индукция каллусогенеза Spirodella oligorhiza и Spirodella punctata отмечалась в присутствии в среде 2% сорбитола (Li et al., 2004).
4. Тип ауксина. Для индукции каллусогенеза у рясковых используют 2,4-D (Edelman et al, 1998; Stomp and Rajbhandary, 2000; Li et al, 2004; Friedrich, 2005; Pham Thi Ly Thu et al., 2010; Firsov et al., 2015), PCL (4-Амино-3,5,6-13 трихлорпиридинкарбоновая-2 кислота) или Dicamba (Li et al, 2004);
5. Концентрация ауксина. Чаще всего 2,4-D используют в концентрациях от 1 мг/л (Li et al, 2004) до 20 мг/л (Edelman et al, 1998; Stomp and Rajbhandary, 2000; Pham Thi Ly Thu et al., 2010), Dicamba используют в концентрациях от 15 мг/л до 50 мг/л (Edelman et al, 1998; Li et al, 2004), PCL в концентрации от 2 мг/л применяется в комплексе с другими ауксинами (Li et al, 2004). Исследованиями Li с соавторами (2004) и Friedrich (2005) установлено, что 2,4-D в концентрациях от 1,0 - 3,5 мг/л (Li et al, 2004) для Spirodella punctata или 5,0 мг/л для Wolffia australiana (Friedrich, 2005) оказывает наиболее эффективное влияние на процессы морфогенеза. Также было отмечено аналогичное влияние Dicamba в концентрации 50,0 мг/л на процесс каллусогенеза у Spirodella oligorhiza и Lemna gibba (Li et al, 2004).
6. Тип цитокинина. 2,4-D и Dicamba для индукции каллусогенеза у рясковых применяют как правило совместно с ВА (Edelman et al, 1998; Stomp and Rajbhandary, 2000; Pham Thi Ly Thu et al., 2010), в отдельных случаях возможно применение TDZ, 2iP (Li et al, 2004) или кинетина (Friedrich, 2005);
7. Концентрация цитокинина. Эффективной концентрацией ВА в зависимости от типа и концентрации используемого ауксина считают от 0,5 мг/л (Stomp and Rajbhandary, 2000; Pham Thi Ly Thu et al., 2010) до 2 мг/л (Edelman et al, 1998), TDZ от 0,5 мг/л до 3 мг/л (Stomp and Rajbhandary, 2000; Li et al, 2004; Firsov et al., 2015), а 2iP в концентрации 2 мг/л (Li et al, 2004). Было показано, что ВА при добавлении в среду для каллусообразования вызывал улучшение качества каллуса и регенерационных потенций эксплантов Wolffia australiana (Friedrich, 2005). Некоторые исследователи в качестве альтернативы ВА предлагают использовать TDZ (Li et al, 2004; Vunsh et al., 2007). Регенерация рясковых преимущественно происходит на безгормональных средах содержащих сахарозу в концентрации 1-2% (Stomp and Rajbhandary, 2000; Li et al, 2004; Friedrich, 2005; Pham Thi Ly Thu et al., 2010). Однако рядом исследователей отмечалось положительное действие TDZ (для Spirodella oligorhiza, Lemna gibba и Lemna minor) и 2iP (для Spirodella punctata) в концентрациях 1 мг/л (Li et al, 2004; Firsov et al., 2015) и ВА (для Lemna gibba G3) в концентрации 0,5 мг/л (Stomp and Rajbhandary, 2000). Также отмечалась возможность субкультивирования каллусных структур рясковых на среде для индукции каллусогенеза с редуцированным содержанием ауксинов (Stomp and Rajbhandary, 2000).
Традиционные методы селекции позволяют получать растения, характеризующиеся высокой урожайностью, повышенным качеством продукции и устойчивостью к болезням и стрессовым факторам. Однако получение растения с желаемыми признаками является очень длительным процессом, а полезные гены могут быть перенесены только от совместимых генотипов. Применение неполовых методов переноса генов позволяет получить растения с приобретенными полезными признаками от неродственных организмов, представленных не только другими родами или семействами, но и даже царствами, что, в свою очередь, позволило появиться такому направлению, как биофарминг. Сама идея биофарминга заключается в создании экпрессинных платформ для наработки белковых препаратов (вакцин) в растительных организмах. Техника неполового переноса ДНК получила название трансформации. Наиболее распространенными методами трансформации растений являются биолистический и агробактериальный методы.
Генетическая трансформация
В аппаратах с механическим перемешиванием мешалка механически насажена на ось. Е диаметр обычно составляет до половины внутреннего диаметра реактора. Расположение оси мешалки зависит от того, верхний или нижний привод у реактора. Верхний привод реализуется конструктивно проще, так как упрощается уплотнение. Техническое обслуживание при этом также проще: отсоединяется мотор, затем снимается крышка вместе с осью и мешалкой. В свою очередь, нижний привод дат ряд преимуществ, связанных с режимами эксплуатации. В этом случае, можно обеспечить перемешивание в биореакторе со снятой верхней крышкой. Это важно для моделирования смешивания, а также для очистки и промывки. При этом также проще обеспечить однородность смеси, так как мешалка находится близко ко дну. Наиболее распространнная конструкция мешалки - стандартная турбина Руштона. Е диаметр обычно составляет около половины внутреннего диаметра реактора. Турбина Руштона - это типичная мешалка, создающая радиальные потоки.
Лопасти мешалки могут быть прямыми или изогнутыми, часто их располагают в несколько ярусов, что обеспечивает более эффективное перемешивание больших объемов жидкости. В систему входят также отражательные перегородки - узкие металлические пластинки, прикрепленные к внутренним стенкам биореактора. Они необходимы для предотвращения образования воронки, обеспечения вихревого движения жидкости, равномерно распределяемого по всему объему реактора, так как образование воронок может значительно снижать максимально возможную скорость вращения мешалки (Березин, 1987).
В аппаратах с пневматическим перемешиванием мешалка отсутствует, а перемешивание жидкости осуществляется пузырьками газа. Естественно, что скорость массообмена в них намного ниже, чем в ферментерах с механическим перемешиванием. Классическим аппаратом такого типа является эрлифтный реактор (airlift-- подъем воздуха). Биореакторы с пневматическим перемешиванием характеризуются более мягким (плавным) перемешиванием содержимого и получили распространение при выращивании клеток животных и растений. Пневматические аппараты привлекают также простотой конструкции и малыми энергозатратами. Основной их недостаток - "тихоходность". Однако и это не всегда является недостатком, поскольку в условиях "тихоходных" установок культуры клеток растений, например, характеризуются биосинтетическими способностями, присущими целому растению (Demain, 1999). Биореакторы циркуляционного или гидродинамичесиого типа оснащены насосами и эжекторами, создающими направленный ток жидкости по замкнутому контуру. Жидкость увлекает за собой пузырьки газа и тем самым культуральная среда, одновременно с перемешиванием, может насыщаться либо атмосферным кислородом, либо (с использованием специальных устройств и эжекторов) газом иного типа. Эти аппараты (биореакторы) отличаются простотой конструкции и надежностью в эксплуатации (Евтушенков и Фомичев, 2002).
Температура — важный параметр ферментации, потому что при культивации многих организмов отклонение температуры на 2-3 градуса может привести к существенному снижению продуктивности роста и биосинтеза. Обычно температура культивации поддерживается с точностью не ниже ±0,5C. Для измерения температуры часто используются датчики Pt100 из нержавеющей стали. В лабораторных биореакторах температура регулируется одним их следующих образов: 1. Нагреватель находится внутри биореактора, а для охлаждения применяются тонкостенные трубочки, опускаемые через верхнюю крышку, в которые при помощи электромагнитного клапана податся охлаждающая вода; 2. Нагревание или охлаждение происходит в термостате, а термостатированная вода циркулирует в рубашке биореактора. Первый вариант проще и обеспечивает более экономичное конструктивное решение. Этот вариант оправдан для небольших реакторов мкостью до 5 литров. Второй вариант обеспечивает равномерное распределение тепла по мкости биореактора, что существенно для культивации, в основном, микроорганизмов (Баулина, 1995).
Пеногашение - средство борьбы с избыточным пенообразованием. Существуют химические, механические, акустические и другие виды пеногашения. Наиболее часто применяют два прима или их комбинацию:
Дозирование противопенного средства, опираясь на информацию, полученную от датчика пены; 2. Механическое сбивание пены. Механические пеногасители представляют собой различные устройства, сбивающие пену: диски, лопасти, барабаны, располагающиеся в верхней части реактора. Более сложными приспособлениями являются сепараторы пены, которые одновременно служат для сбора биомассы, содержащейся в пенном слое (Елинов, 1995). Стоит отметить, что для фитобиореакторов для культивирования макрообъектов, таких как, например, целые растения ряски, система пеногашения не является необходимой, так как культура не образует какой либо пены или «корки» из мертвых клеток или метаболитов.
Молекулярно-генетический анализ трансгенных образцов вольфии
При любом методе трансформации целевые ткани (экспланты) подвержены целому ряду стрессов, например, взаимодействие с агробактерией, физическое проникновение частиц, дегидратация при обработке осмотиками, контакт с антибиотиками на селективных средах. В связи с этим регенерация целого растения является одним из критических этапов всей процедуры переноса гена. Поэтому, прежде чем начинать исследования в сфере трансформации растения, необходимо провести ряд экспериментов, направленных на разработку протокола эффективной и стабильной регенерации целых растений в культуре in vitro.
Для получения наиболее эффективного каллусогенеза был осуществлен поиск оптимального сочетания типа экспланта (цельное растение, половина растения, растение с нанесенными скальпелем насечками и гомогенизированная в течении 5 сек с помощью Power Gene 125 растительная масса), типа среды и регуляторов роста, добавляемых в среду (Friedrich, 2005). В эксперименте исследовали влияние 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D) в сочетании с 6-бензоаминопурином (ВА) или тидиазуроном (TDZ) (Luhrs and Lorz, 1987; Brettschneider et al., 1997; Jiang et al., 1998; Fernandez et al., 1999; Nhut et al., 2000; Caswell et al., 2000; Dahleen and Bregitzer, 2003; Sharma et al., 2005a,b). Было составлено 20 вариантов комбинаций регуляторов роста с использованием 2,4-D от 5 до 25 мг/л с шагом в 5 мг/л, как совместно с ВА или TDZ 0,5 мг/л, так и без него. Регуляторы роста добавляли в среды Хогланда-Арнона (Hoagland and Arnon, 1938), Мурасиге-Скугга (Murashige and Skoog, 1962) и Шенка-Хильдебранда (Schenk and Hildebrandt, 1972), содержащих 2% сахарозы каждая. Экспланты помещали на агаризированные питательные среды в количестве 10 шт на одну чашку Петри в пятикратной повторности для каждого варианта. Итого в эксперименте были задействованы 3 типа среды, 4 типа экспланта и 20 комбинаций регуляторов роста, т.е. всего 240 вариантов в повторении 5х10 эксплантов (12000 образцов).
В результате было установлено, что при эксплантации любое поранение растения приводит к полному некрозу. Повышение концентрации 2,4-D выше 5 мг/л ингибирует пролиферацию тканей экспланта, а понижение относительно означенного уровня не позволяет получить каллусоподобных структур. Использование тидиазурона привело к тотальной витрификации тканей экспланта. При использовании в качестве основы среды Хогланда-Арнона отмечалось исключительно увеличение популяции вольфии без признаков индукции каллусогенеза (рис. 4А), при использовании же среды Мурасиге-Скуга происходил массовый прогрессирующий некроз растений (рис. 4В).
Рисунок 4. Экспланты вольфии, культивируемые на различных питательных средах (через 30 дней после эксплантации): А- среда Хогланда, Б - среда Шенка-Хильдебранда, В - среда Мурасиге-Скуга.
В ходе исследования в варианте с использованием среды Шенка-Хильдебрандта (SH), удалось получить структуры, которые в литературе ранее были описаны как «кластеры». Предполагается, что термин «кластер» должен быть использован, как более подходящий для описания этих частично дедифференцированных пролиферирующих, как правило, округлых структур, которые развиваются из почек или других меристематических тканей (Ziv 1999). Кластеры вольфии формировались из дочерних растений, находящихся в латеральном кармане материнского растения (рис. 5А). При этом по мере развития эти дочерние растения подвергались деформации и дедифференциации, но сохраняли аппарат вегетативного размножения (рис. 5Б).
Наиболее удачным оказался вариант использования среды Шенка-Хильдебрандта (SH) с добавлением 5 мг/л 2,4-D + 0,5 мг/л ВА (рис. 4Б). Во всех повторностях данного варианта средняя масса кластеров варьировала от 5,025 г до 6,658 г, в то время как в остальных вариантах она не превышала 0,193 г.
Таким образом, результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод о том, что единственным возможным типом экспланта является цельное неповрежденное растение вольфии, культивируемое на среде Шенка-Хильдебрандта с добавлением 2,4-D в количестве 5 мг/л и ВА 0,5 мг/л.
Интересно отметить, что в процессе образования кластеров вольфии отмечается 6 характерных стадий (рис. 6). На протяжении первых 2 недель одиночные растения (рис. 6 этап 1) размещенные на среду Шенка-Хильдебрандта с добавлением 2,4-D в количестве 5 мг/л и ВА 0,5 мг/л визуально не проявляли какой либо реакции на экзогенные регуляторы роста и размножались (рис.6 этап 2) аналогично контрольному варианту на среду Шенка-Хильдебрандта. На протяжении следующих 2 недель происходила частичная гибель сформировавшихся растений на уровне 30-38% от общего числа растений популяции (рис. 6 этап 3). Гибель наступала в виде постепенного побеления старых листецов, что схоже симптомами с естественной гибелью, но не является таковой, так как в контрольном варианте подобная гибель растений происходила только спустя 6 недель в связи с истощением минеральной базы среды. Селедующие 3 недели живые растения популяции деформировались (рис. 6 этап 4) в разнообразные по форме (неправильные кубические, призматические, цилиндрические, реже конусообразные или октаэдрические) и размеру (диаметром от 0,3 до 4,2 мм) структуры. На протяжении следующих 3 недель деформированные структуры образовывали между собой спайные агрегаты с растрескавшейся эпидермой (рис. 6 этап 5). Спустя около 12 недель от размещения одиночных растений вольфии на среду Шенка-Хильдебрандта с добавлением 2,4-D в количестве 5 мг/л и ВА 0,5 мг/л образовывались нестабильные, гетерогенные кластерные структуры (рис. 6 этап 6), включающие в себя как визуально каллусоподобные образования, так и кластерные структуры, быстро переходящие в каллусоподобные образования или целые растения. Этап Этап Этап
Определение концентраций селективных агентов для селекции трансгенных клеток и тканей
В данном участке системы плотность популяции объекта культивирования на порядок ниже, при этом происходит постоянное движение среды, что в свою очередь позволяет осуществлять кратковременное воздействие на объект растворами титранта в малых концентрациях, обусловленных явлением локального градиента концентрации при растворении его в среде. Штуцер подачи титранта монтируется в специальный адаптер на выводном участке спирального сегмента, при этом отверстие, предусмотренное для него в крышке основного резервуара, заглушается. Для обеспечения исключительно капельной подачи титранта и исключения возможности диффузного поступления его в среду, на штуцер, помимо шлангов подачи титранта, монтируется шланг нагнетания избыточного давления с использованием газовой компоненты с вывода (overlay), находящегося на основном системном модуле реактора.
Произведенные модификации позволили осуществить эксперимент по определению наиболее предпочтительной системы перемешивания среды для культивирования вольфии, предусматривающий единовременный запуск биореакторов разных типов с одинаковыми исходными параметрами [состав среды (W3M), посевная доза (5 г)] и заданными условиями культивирования [кислотность (5,8 – 6,0), температура (25:С), фотопериод (24/0)]. Согласно результатам эксперимента наиболее предпочтительной является гидродинамическая схема ферментации. Эффективность данной системы по наработке биомассы популяции оказалась в 2,1 раз выше по сравнению с механической схемой (таблица 18). 135
Модификации внесенные в систему культивирования биореактора Biostat PBR 2S, где А – схема магистральных патрубков основного резервуара системы, Б – сегмент отделения растительного компонента от реакционной среды (отсекатель), В – электросхема АСУ (контроллера) перистальтического насоса, Г – сегмент перемещения подачи титранта (адаптер), Д – систему культивирования биореактора после модернизации с установленными: на входе спирального сегмента отсекателем (1), на верхнем выводном участке спирального сегмента адаптером (2), независимым контроллером управления работой насоса (3) и дополнительным роликом на диске привода насоса (4).
Для определения наиболее сбалансированной питательной базы для ферментации вольфии был проведен эксперимент, как применительно к выращиванию в колбах, так и к наработке биомассы в биореакторе. Основной задачей эксперимента стало не только сравнение между собой наиболее сбалансированных для культивирования аквакультур культуральных сред [Хогланда-Арнона (HA), Шенка-Хильнбрандта (SH), Стейнберга (St)] и разработанной нами индивидуально сбалансированной средой для культивирования вольфии бескорневой (W3M) (патент RU 2472338 C1), но и установить, насколько продуктивность популяции вольфии при выращивании в колбах совпадает с продуктивностью популяции вольфии при выращивании в биореакторе (таблица13). Так как среда W3M содержит в своем составе широкий спектр органических добавок, все известные среды (HA, SH, St) были дополнены наиболее распространенными органическими компонентами. В каждой из них присутствовали: 20 г/л сахарозы, 150 мг/л гидролизата казеина, 100 мг/л мезоинозита и витаминный комплекс, состоящий из тиамина, пиридоксина и никотиновой кислоты в концентрациях 0,1, 0,5 и 0,5 мг/л (Войнов и др. 2009), соответственно. В эксперименте было задействовано два варианта культивирования:
1. Растения помещали на жидкие питательные среды в количестве 100 растений на одну колбу емкостью 500 мл в трехкратной повторности для каждого из вариантов. Объем среды в каждой колбе составлял 300 мл, культивацию осуществляли на шейкере при 90 об/мин. Учетный период – 1 месяц со дня посадки. Интенсивность освещения по ФАР составляла 33 Вт/м2, температура 28С, рН 6,0.
2. Растения помещали в биореактор Sartorius BioStat PBR 2S. Посевная доза составляла 10 г биомассы на сосуд рабочим объемом 3 л. Интенсивность освещения по ФАР составляла 33 Вт/м2, температура 28С, рН 6,0. В результате проведенных исследований было установлено, что скорость увеличения биомассы популяции (коэффициент геометрической прогрессии популяции за 1сут.) при культивировании вольфии в биореакторе возрастает в среднем на 5,8% (для среды W3M прибавка составила 5,2%, для HA 4,7%, для St 5,3%, для SH 7,8%) относительно культивирования ее в колбах. Также было отмечено повышение содержания белка в сухом веществе в среднем на 7,8% (для среды W3M прибавка составила 7,1%, для HA 5,3%, для St 3,5%, для SH 15,6%) при культивировании в биореакторе по сравнению с выращиванием в колбах. Среды HA и St статистически достоверно не отличаются друг от друга по учетным показателям, в то время как использование среды SH стабильно приводит к наиболее низким показателями при сравнении всех тестируемых сред. Содержание сухого вещества во всех вариантах эксперимента оставался практически неизменным и соответствовал физиологической норме (4,5%) (таблица 19).
На основании этих данных был сделан вывод о том, что использование биоректора позволяет достичь более благоприятных условий для культивирования вольфии. Вариантом, обеспечивающим максимальную продуктивность вольфии, вне зависимости от способа выращивания (в биоректоре или колбах), является использование среды W3M. Данная среда по всем показателям, кроме содержания сухого вещества, существенно превышает все тестируемые общепринятые среды для культивирования водных растений в условиях in vitro. В результате проведенных исследований установлено, что наибольшей продуктивности биомассы популяции вольфии удалось достичь при культивировании в гидродинамическом биореакторе с использованием среды W3M и соблюдении следующих параметров культивирования: температура 27-29 С, pH 5,7-6,0,фотопериод 24/0.