Содержание к диссертации
Введение
Глава I Обзор литературы 12
1.1 Ботаническая характеристика Agastache spp. 12
1.2 Синонимы названий изучаемых видов Agastache spp. 15
1.3 Фитохимическая характеристика Agastache spp. 16
1.4 Биоактивность Agastache spp. 34
1.5 Биосинтез активных компонентов Agastache spp. 48
1.6 Культура Agastache spp. in vitro 50
1.7 Витрификация в культуре in vitro 55
1.8 Синтез наночастиц металлов с использованием растительных экстрактов 57
Глава II Объекты и методы исследований 59
2.1 Растительный материал 59
2.2 Введение в культуру in vitro семян Agastache spp. 59
2.3 Изучение условий клонального микроразмножения Agastache spp. 60
2.4 Индукция каллусогенеза Agastache spp., получение суспензионной клеточной культуры и ее характеристика 61
2.5 Изучение влияния гормонального состава питательной среды и типа экспланта на регенерацию Agastache spp. 64
2.6 Изучение влияния условий культивирования in vitro на уровень витрификации A. foeniculum 65
2.7 Изучение биохимических особенностей Agastache spp. in vitro 67
2.8 Синтез наночастиц серебра с использованием экстрактов из растений и каллуса A. foeniculum и определение их бактерицидной активности 69
2.9 Исследование цитотоксичности водных экстрактов Agastache spp. 76
2.10 Статистическая обработка данных 77
Экспериментальная часть 78
Глава III Культивирование многоколосника (Agastache spp.) in vitro 78
3.1 Получение асептических растений Agastache spp. 78
3.2 Изучение влияния условий клонального микроразмножения растений Agastache spp. 80
3.3 Индукция каллусогенеза Agastache spp. и получение суспензионной клеточной культуры 84
3.4 Влияние гормонального состава питательной среды и типа экспланта на регенерацию Agastache spp. 93
3.5 Влияние условий культивирования in vitro на уровень витрификации A. foeniculum 106
Глава IV Биологическая активность вторичных метаболитов многоколосника (Agastache spp.) in vitro 111
4.1 Определение суммарного содержания фенольных соединений Agastache spp. 111
4.2 Определение суммарного содержания флавоноидов Agastache spp. 112
4.3 Синтез наночастиц серебра с использованием экстрактов из растений и каллуса A. foeniculum 114
4.4 Исследование цитотоксичности водных экстрактов Agastache spp. 122
Заключение 126
Список литературы 128
- Фитохимическая характеристика Agastache spp.
- Синтез наночастиц серебра с использованием экстрактов из растений и каллуса A. foeniculum и определение их бактерицидной активности
- Влияние гормонального состава питательной среды и типа экспланта на регенерацию Agastache spp.
- Исследование цитотоксичности водных экстрактов Agastache spp.
Фитохимическая характеристика Agastache spp.
Agastache как вид Lamiaceae содержит ВМ, такие как фенилпропаноиды и терпеноиды. Первая группа включает в себя флавоноиды, свободные фенольные кислоты и депсиды (Zieliska, Matkowski, 2014). Вторая обширная группа веществ - терпеноиды - включает в себя как летучие, так и нелетучие соединения из различных органов растений (Zieliska, Matkowski, 2014).
Два основных класса летучих компонентов эфирных масел – фенилпропаноиды и терпеноиды (Zieliska, Matkowski, 2014). В наибольшем количестве в эфирном масле Agastache представлены монотерпены и их производные, а сесквитерпены и их производные обычно встречаются в небольшом количестве.
Природные эфирные масла могут содержать от 20 до 100 различных ВМ, принадлежащих различным классам химических веществ (Carson, Hammer, 2011). У представителей рода Agastache идентифицировано в общей сложности 77 компонентов эфирных масел (табл. 1.1; Fuentes-Granados et al., 1998).
Летучие компоненты эфирных масел растений рода Agastache синтезируются и накапливаются в секреторных трихомах на поверхности листа. Листовая пластина различных видов Agastache в большей или меньшей степени также покрыта несекреторными волосками. У некоторых видов, таких как А. foeniculum, волоски покрывают поверхность листа особенно плотно (Svoboda et al., 1995). Содержание эфирного масла может достигать более 2 % в зависимости от вида и органа растения (Svoboda et al., 1995; Omidbaigi, Mahmoodi, 2010).
Состав эфирных масел представителей рода Agastache зависит от времени сбора сырья, состояния окружающей среды и методов культивирования (Svoboda et al., 1995; Omidbaigi, Sefidkon, 2004; Suchorskaropio et al., 2004; Маланкина, 2007; Omidbaigi, Mahmoodi, 2010). Наибольшее количество эфирного масла из А. mexicana и A. rugosa было получено в начале цветения, а из A. foeniculum - в середине периода цветения (Suchorskaropio et al., 2004). Большее количество эфирного масла было получено из растений A. rugosa и A. scrophulariifolia, культивируемых условиях прохладных летних температур. Напротив, А. foeniculum и A. urticifolia предпочитают более теплый климат, в противном случае они не цветут и производят незначительное количество эфирного масла (Svoboda et al., 1995; Rudik, 2013).
Многие виды Agastache продуцируют значительно большее количество эфирного масла в период цветения, а не в период вегетации. После прекращения цветения количество масла снижается вновь.
Установлено, что на качественный и количественный состав эфирного масла A. foeniculuт влияет время посева (Omidbaigi, Sefidkon, 2004). Ранний посев (в марте) позволяет получить растения, содержащие большее количество эфирного масла (более 2 %) и метилхавикола в нем (92 %), чем растения, посев которых пришелся на поздние месяцы (май, июнь). В том же исследовании было продемонстрировано, что нитратные удобрения увеличивают содержание эфирного масла до 2,88 %. Умеренное орошение полей в окрестностях Тегерана (Иран) также увеличивало выход эфирного масла (до 2,3 %), но подобного рода воздействие не может быть одинаково эффективным для районов с менее засушливым летом (Omidbaigi et al., 2008; Omidbaigi, Mahmoody, 2010). В другом исследовании было изучено влияние органических (коровий навоз и биогумус) и неорганических (нитратные удобрения) удобрений на состав и содержание эфирного масла у A. foeniculum. Максимальное содержание эфирного масла было отмечено у растений, выращенных с использованием навоза и биогумуса. Основным компонентом эфирного масла был метилхавикол (Moghaddam et al., 2015).
На качественный и количественный состав эфирного масла Agastache оказывает влияние поражение вирусными инфекциями. Вирус мозаики огурца вызывает изменение в качественном составе эфирного масла A. foeniculum (Bruni et al., 2007). Значимые различия наблюдались в составе и содержании метилхавикола, изоментона, пулегона и лимонена. Концентрация лимонена и изоментона увеличивалась, соответственно, с 2,8 до 12 % и с 27 до 43,9 %, в то время как концентрация метилхавикола и пулегона уменьшалась с 16,2 до 3,2 % и с 31,2 до 18,7 %, соответственно (Bruni et al., 2007). Было отмечено уменьшение содержания эфирного масла (3,5 мл/кг у здорового растения; 0,4 мл/кг - у инфицированного) (Bruni et al., 2007).
Также на качественный и количественный состав эфирного масла влияют такие факторы, как условия сушки и хранения сырья. Из растительного материала A. foeniculum, высушенного при комнатной температуре (25 С) было получено больше эфирного масла (2,2 %), чем из сырья, высушенного при температуре 40 С (1,6 %) (Sourestani et al., 2014). Время экстракции не оказывало существенного влияния на количественный состав эфирного масла A. foeniculum (Sourestani et al., 2014). Также было установлено, что при сушке сырья А. foeniculum содержание эфирного масла уменьшается с 2,58 до 2,20 % и изменяется его качественный состав (Чумакова, Попова, 2013).
Хотя состав эфирного масла и соотношение летучих компонентов в нем у различных представителей Agastache является переменным, некоторые составляющие, к правило, преобладают. Наиболее распространенными компонентами эфирных масел у представителей рода Agastache являются метилхавикол (синонимы: эстрагол, пара-аллиланизол, 4-метоксиаллилбензин) и лимонен. Состав соотношение остальных летучих соединений может существенно варьировать (Fuentes-Granados et al., 1998). Считается, что типичный для представителей Agastache анисоподобный аромат связан с преобладанием в составе эфирного масла метилхавикола. Но аромат эфирного масла также может быть обусловлен наличием веществ, обнаруженных в следовых количествах, таких как хавикол, р-ментон, коричный альдегид и жасмон (Weyerstahl et al., 1992). Содержание метилхавикола в составе эфирного масла A. rugosa и А. foeniculum составляет от 18,6 до 98 % (Fujita, Fujita, 1973; Charles et al., 1991; Weyerstahl et al., 1992; Wilson et al., 1992; Svoboda et al., 1995; Tirillini et al., 1997; Omidbaigi, Sefidkon, 2004; Skakovskii et al., 2010; Wang, 2010; Zieliska et al., 2011; Lim et al., 2013). В эфирном масле других видов Agastache {A. mexicana, А. mexicana subsp. xolocotziana и A. scrophulariifolia) сообщается о различном количественном содержании метилхавикола: от полного его отсутствия до 86 % (Svoboda et al., 1995; Estrada-Reyes et al., 2004; Suchorskaropio et al., 2004).
Пулегон - летучий монотерпеноид, продуцируемый в относительно больших количествах различными видами Agastache. Содержание пулегона в эфирном масле A. rugosa составляет 13,4...50,8 % (Svoboda et al., 1995; Mo et al., 2009; Mo, Ma, 2011); A. foeniculum - 22,6 %; A. scrophulariifolia - 45,2 %; A. mexicana subsp. xolocotziana - 80 %, но в эфирном масле A. mexicana subsp. техісапа пулегон отсутствует (Estrada-Reyes et al., 2004). В образцах эфирных масел из различных сортов A. mexicana и A. scrophulariifolia не был обнаружен метилхавикол, но в их составе преобладал пулегон (содержание 75,3 и 45,2 %, соответственно) (Svoboda et al., 1995; Estrada-Reyes et al., 2004).
Вариации в качественном и количественном составе эфирных масел могут наблюдаться не только в пределах рода, но и среди различных популяций одного вида (Zieliska, Matkowski, 2014). Описываются популяции A. foeniculum, где метилхавикол является основным компонентом эфирного масла, но содержание его значительно ниже, чем у других популяций данного вида (Wilson et al., 1992). В популяциях с низким уровнем метилхавикола в эфирном масле содержание мирцена значительно выше, чем в других популяциях. Аромат эфирного масла А. foeniculum больше схож с ароматом тарагона, а не аниса, что может указывать на высокое содержание в нем транс -анетола, а не метилхавикола (Tutcer, 1994). Анализ коммерческого эфирного масла A. foeniculum («Scents & Sensibility Ltd.», США) показал, что основными компонентами этого масла являются цис-пинокамфон (34,4 %), транс -пинокамфон (23,3 %) и -пинен (11,3 %) (Nikoli et al., 2016).
Синтез наночастиц серебра с использованием экстрактов из растений и каллуса A. foeniculum и определение их бактерицидной активности
Фитохимический скриниг растительных экстрактов осуществляется с целью идентификации основных групп метаболитов, таких как алкалоиды, ФС, терпеноиды, гликозиды, восстанавливающие ахара, белки. Образование наночастиц металлов в ходе «зеленого синтеза» связывают с восстанавливающей активностью этих веществ.
Тест на танины. 0,5 мл экстракта смешивали с 1 мл воды и добавляли 1...2 капли раствора хлорида железа. На наличие танинов указывает появление темно-синей или темно-зеленой окраски и осадка (Aiyegoro, Okoh, 2010).
Тест на флавоноиды. К экстракту добавляли несколько капель раствора ацетата свинца. Формирование желтого или белого осадка указывает на наличие флавоноидов (Baghel, Ray, 2017).
К экстракту добавляли несколько капель раствора гидроксида натрия. Формирование интенсивной желтой окраски с обесцвечиванием при добавлении разбавленной кислоты говорит о наличии флавоноидов в растворе (Baghel, Ray, 2017).
Тест на сапонины. 1 мл экстракта добавляли к 5... 10 мл дистиллированной воды. Интенсивно встряхивали в градуированном цилиндре. Формирование слоя пены высотой в 1 см указывает на наличие сапонинов в экстракте (Aiyegoro and Okoh, 2010).
Тест на алкалоиды. Тест Майерса: К 1 мл экстракта прибавляли 2 мл концентрированной азотной кислоты и 1...2 капли реагента Майерса. Присутствие зеленой окраски или белого осадка указывает на наличие алкалоидов (Baghel, Ray, 2017).
Тест Драгендорфа: К 5 мл экстракта прибавляли 2 мл соляной кислоты. В смесь добавляли 1 мл реактива Драгендорфа. Появление оранжево-красного осадка указывает на наличие алкалоидов (Kumar et al., 2009).
Тест на терпеноиды и стеролы. Реакция Салъковского: К 5 мл экстракта добавляли 2 мл хлороформа и 3 мл концентрированной серной кислоты. Формирование красно-коричневого кольца подтверждает наличие терпеноидов и стеролов (Obianime, Uche, 2008).
Тест на восстанавливающие сахара. Смешивали по 1 мл растворов Фелинга А и B, кипятили в течение 1 минуты. Добавляли равный объем экстракта. Нагревали на водяной бане в течение 5... 10 минут. При наличии восстанавливающих сахаров наблюдается появление сначала желтой, а затем кирпично-красной окраски (Ruthiran, Selvaraj, 2017).
Тест на моносахариды. Смешивали равные объемы реактива Барфорада и анализируемого экстракта. Нагревали 1...2 минуты на водяной бане, после чего охлаждали. Появление красной окраски указывает на наличие моносахаридов (Ismail et al., 2016).
Тест на протеины. Биуретовая проба к 1 мл исследуемого раствора добавляли 1 мл 10 %-ного раствора NaOH и 2...3 капли 1 %-ного раствора сульфата меди. При положительном результате появляется фиолетовая окраска с красным или синим оттенком (Ruthiran, Selvaraj, 2017).
Тест на гликозиды. Реакция Келлера-Килиани: К 2 мл экстракта добавляли 5 мл ледяной уксусной кислоты и 1 каплю 5 %-ного раствора хлорида железа. Аккуратно добавляли 0,5 мл концентрированной серной кислоты по стенке пробирки. При наличии гликозидов на границе двух слоев появляется бурое или темно-бурое окрашивание, сверху окрашенной полосы постепенно возникает сине-зеленый или синий слой (Baghel, Ray, 2017).
Для определения восстанавливающей активности экстрактов использовали метод Фолина-Чокальтеу (Singleton, Rossi, 1965). 2 г растительного сырья измельчали в жидком азоте, смешивали с 5 мл 80 %-ного этанола и нагревали на водяной бане в течение 30 минут. Для отделения растительных остатков экстракт фильтровали через 2 слоя марли и центрифугировали при 13 000 об/мин в течение 10 минут. Конечный объем экстракта доводили до 5 мл. Аналитическая смесь состояла из 400 мкл экстракта, 400 мкл реактива Фолина-Чокальтеу и 3200 мкл воды. Раствор сравнения содержал аналогичный объем 80 %-ного этанола вместо экстракта. Поглощение измеряли при 720 нм. Опыт проводили в трехкратной повторности для каждого образца. Расчет производили по калибровочной кривой, построенной по растворам гидрохинона (рис. 2.4) (Makarov, Makarova et al., 2014).
Для определения оптимальной концентрации солей и экстрактов из растений для синтеза наночастиц серебра 20 мкл AgN03 в концентрации 5, 25, 50 и 100 мМ смешивали с 500 мкл экстрактов, разбавленных в 2, 4 и 8 раз. Время синтеза наночастиц серебра составило 2 часа при комнатной температуре. После этого снимали спектры поглощения, по которым определяли оптимальную концентрацию исходных компонентов ля синтеза. Спектры поглощения измеряли в диапазоне 390...600 нм с использованием спектрофотометра Hitachi UV-2600. Известно, что благородные металлы обладают уникальным оптическим свойством поверхностного плазмонного резонанса (Bindhu and Umadevi, 2013). Интенсивность пика отражает эффективность синтеза наночастиц. На образование наночастиц серебра указывает изменение цвета реакционной смеси и спектры поглощения в УФ-диапазоне (Haytham, 2015). Появление пика поверхностного плазмонного резонанса в диапазоне длин волн 430...460 нм указывает на формирование наночастиц серебра (Haytham, 2015).
Для получения изображения синтезированных наночастиц и определения их размера использовали трансмиссионный электронный микроскоп (ТЭМ) LEO912 AB OMEGA, работающий при 100 кВ. Образцы полученных наночастиц разбавляли 1:10 и 1:100 и капали на медные сетки, покрытые формварной пленкой, которые затем сушили на воздухе.
Для получения экстракта использовали растения in vitro A. foeniculum, культивируемые в течение 3 месяцев на питательной среде МС с добавлением 0,2 мг/л БАП и каллус A. foeniculum, полученный на питательной среде, содержащей 0,5 мг/л 2,4-Д в сочетании с 0,1 мг/л кинетина и культивируемый в течение 6 месяцев.
Для определения минимальной ингибирующей концентрации полученных наночастиц серебра использовали следующие патогенные штаммы микроорганизмов:
1. Staphylococcus aureus, штамм Z 73-14 (золотистый стафилококк, шаровидная грамположительная бактерия, вызывает широкий диапазон заболеваний от легких кожных инфекций до пневмонии и менингита);
2. Staphylococcus haemolyticus, штамм F 1059-16 (гемолитический стафилококк, грамположительный микроорганизм, вызывающий различные гнойные воспаления);
3. Klebsiella pneumoniae, штамм Ts 45-16 (палочка Фридлендера, грамотрицательная факультативно-анаэробная палочковидная бактерия, возбудитель пневмонии);
4. Acinetobacter baumannii, штамм Ts 50-16 (акинетобактерия Бауманна, грамотрицательный микроорганизм из да Acinetobacter, вызывает оппортунистические заболевания);
5. Streptococcus pneumonia, штамм R 363-17 (пневмококк, грамположительный микроорганизм, основной возбудитель менингита, отита, синусита, пневмонии).
Ночную культуру (5 мл) бактериального штамма разбавляли и подращивали до оптической плотности OD600 = 0,6. Полученную культуру (2 мл) осаждали центрифугированием (3000 g, 10 мин.), клетки ресуспендировали в таком же объеме 5 мМ HEPES-HCl, pH 7,2; мутность полученной суспензии должна соответствовать стандарту мутности МакФарланда 0,5. Затем бактериальную культуру разбавляли в 100 раз таким же буфером (конечная плотность клеток составляет 10 клеток/мл).
Во все лунки планшета добавляли по 100 мкл питательной среды (LB) и 100 мкл препарата наночастиц. Затем проводили раститровку препарата по 100 мкл в последующие ряды согласно схеме (рис. 2.5) (Wiegand et al., 2008).
В подготовленные лунки добавляли по 100 мкл бактериальной суспензии. Для контроля роста (growth control, GC) в один из рядов добавляли смесь 100 мкл бактериальной суспензии и 100 мкл среды. Ряд, содержащий только питательную среду, - контроль стерильности (sterility control, SC).
Влияние гормонального состава питательной среды и типа экспланта на регенерацию Agastache spp.
Регенерация побегов из эксплантов различного типа может быть использована как эффективный способ размножения лекарственных растений. Она также критична при получении трансгенных растений (Saito et al., 1992).
Целью данного этапа было изучение морфогенеза в культуре in vitro на различных типах экспланта. Необходимо было определить зависимость регенерационной способности от гормонального состава питательной среды и типа экспланта. Изучение регенерации A. foeniculum
Растения-регенеранты A. foeniculum нормальной морфологии на всех вариантах питательных сред (кинетин - 0,1, 0,5, 1,0, 1,5 мг/л; БАП - 0,5, 1,0, 2,0, 5,0 мг/л; ТДЗ - 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 мг/л) удалось получить только из нодальных сегментов. При этом изначально нодальные сегменты образовывали каллус, после чего наблюдалось формирование обегов. Наибольшая эффективность регенерации была достигнута на питательных средах, содержащих 0,1...0,5 мг/л кинетина (табл. 3.8, ис. 3.9). С увеличением концентрации кинетина эффективность регенерации снижалась (табл. 3.8). Эффективность регенерации побегов из нодальных сегментов на питательных средах, содержащих 0,5...5 мг/л БАП была низкой, но было отмечено интенсивное образование каллуса на листовых и стеблевых эксплантах. Образовавшийся каллус - рыхлый, светло-зеленого цвета (рис. 3.9). На питательных средах, содержащих ТДЗ в различных концентрациях, также было отмечено формирование каллуса из листовых и стеблевых эксплантов. Результаты эксперимента представлены в табл. 3.8.
У части эксплантов был отмечен стеблевой органогенез (табл. 3.9). Ризогенез был отмечен у около 30 % каллуса, культивируемого на питательных средах, содержащих 0,5...1,5 мг/л кинетина (табл. 3.9, рис. 3.10С).
Стеблевой органогенез был отмечен на нодальных сегментах и характеризовался интенсивным формированием листьев без выраженного стебля (рис. 3.10А) при культивировании на питательных средах, содержащих 1 мг/л ТДЗ и 0,5 мг/л БАП (75 и 81,5 %, соответственно). Стеблевые почки без ярко выраженных листьев (рис. 3.10B) формировались при культивировании на питательных средах, содержащих 2 мг/л и 5 мг/л БАП (22,5 и 15,0 %, соответственно) (Поливанова, Чередниченко, 2017б).
На втором этапе было определено влияние ауксинов на рост побегов-регенерантов, так как доступны данные о положительном влиянии ауксинов на коэффициент клонального микроразмножения A. rugosa (Zieliska et al., 2011). Экспланты помещали на питательную среду МС, содержащую 0,5 мг/л кинетина в комбинации НУК ли ИУК (0,1, 0,2 мг/л). Результаты эксперимента представлены в табл. 3.10 и на рис. 3.11.
Регенерация из листовых и стеблевых эксплантов была отмечена только на питательной среде МС, содержащей 0,5 мг/л кинетина и 0,2 мг/л ИУК, и составила 0,1...12,4 %. На питательной среде, содержащей 0,2 мг/л НУК и 1 мг/л кинетина, было отмечено интенсивное формирование листьев у 60 % эксплантов.
Изучение регенерации A. urticifolia
Регенерация А. urticifolia, как и в случае с A. foeniculum, была возможна преимущественно из нодальных сегментов на всех вариантах питательных сред (рис. 3.12). Регенерация из других типов экспланта составила 0...1,7 % (0,1...1,7 % из стеблевых эксплантов и 0...1,2 % для каллуса для питательной среды, содержащей 0,1 мг/л кинетина; 0...1,2 % для листовых эксплантов для питательной среды, содержащей 1 мг/л БАП; 0...0,2 % для питательной среды, содержащей 1 мг/л ТДЗ; отсутствие регенерации для остальных вариантов). Формированию побегов предшествовало образование каллуса.
Большее количество регенерантов нормальной морфологии было получено на пит ательных средах, содержащих кинетин. На питательной среде МС без фитогормонов и регуляторов роста (контроль) была отмечена почти 100 %-ная регенерация из нодальных сегментов (табл. 3.11). Для питательных сред, содержащих БАП и ТДЗ, эффективность регенерации снижалась с увеличением концентрации фитогормонов (табл. 3.11), ри этом увеличивалась оля эксплантов с признаками органогенеза (табл. 3.12, рис. 3.13). На питательной среде, содержащей 0,1 мг/л кинетина, 0,5...2,5 % каллуса и стеблевых эксплантов образовывали корни, что не было характерно для других вариантов питательных сред.
Для каллуса на всех вариантах питательных сред было характерно увеличение каллусной массы. При этом морфология каллуса различалась в зависимости от гормонального состава питательной среды. При больших концентрациях кинетина (0,5...1,5 мг/л) формировался более рыхлый светло коричневый каллус. Плотный ярко-зеленый каллус формировался при увеличении концентрации БАП и ТДЗ (рис. 3.14).
При изучении влияния ауксинов на регенерацию побегов A. urticifolia лучший результат был получен при культивировании на питательной среде МС, содержащей 0,1 мг/л ИУК в сочетании с 1 мг/л кинетина (табл. 3.13). Данный результат сопоставим с контролем. Увеличение концентрации ауксинов снижало эффективность регенерации (табл. 3.13). Доля эксплантов, образующих каллус, значительно ниже по сравнению с результатами, полученными для A. foeniculum, на тех же вариантах питательных сред.
На питательной среде МС, содержащей 1 мг/л БАП, 6,0...34,0 % нодальных сегментов также образовывали терратомы. На питательных средах, содержащих 0,5...2,0 мг/л ТДЗ, эффективность регенерации была низкой. До 92,2 % нодальных сегментов на питательной среде, содержащей 2 мг/л ТДЗ, образовывали рыхлый, светло-зеленый каллус; 0,2…1,2 % нодальных сегментов образовывали терратомы. На питательной среде , содержащей 0,1 мг/л ТДЗ, было отмечено образование побегов с признаками витрификации, короткими стеблями и множеством удлиненных листьев. 31,6...78,0 % стеблевых и листовых эксплантов на питательных средах с различной концентрацией ТДЗ образовывали каллус (табл. 3.14).
У нодальных сегментов, культивируемых на питательных средах с 0,1...2,0 мг/л ТДЗ, был отмечен органогенез, характеризующийся интенсивным формированием множества листьев (табл. 3.15).
Исследование цитотоксичности водных экстрактов Agastache spp.
В данном эксперименте было установлено наличие цитотоксических свойств водных экстрактов растений рода Agastache. Для экстракции использовали растения in vitro в возрасте 3 месяцев, полученные на питательной среде МС. Опыт проводили на клетках карциномы яичника человека SK-OV-3. Данная клеточная линия была получена из асцитической жидкости 64-летней женщины европейского происхождения с опухолью яичников в 1973 году.
При воздействии водного экстракта из каллуса и растений A. foeniculum не наблюдалось значительного снижения жизнеспособности клеток с увеличением концентрации экстракта (рис. 4.8).
Было отмечено резкое падение жизнеспособности клеток от 90 до 30 % при достижении концентрации растительного экстракта A. urticifolia 3,5 %. Для экстракта из каллуса A. urticifolia снижение жизнеспособности с увеличением концентрации экстракта было менее выраженным (рис. 4.9).
Для растительного экстракта A. scrophulariifolia резкое падение жизнеспособности клеток от 100 до 30 % отмечалось при концентрации растительного экстракта 1,5 %. При более низких концентрациях экстракта жизнеспособность оставалась на уровне 100 %.
Как видно из рис. 4.8-4.10, 5 %-ные водные экстракты из растений A. urticifolia и A. scrophulariifolia демонстрируют больш ую цитотоксическую активность (жизнеспособность клеток около 50 %) по сравнению с растительным экстрактом A. foeniculum (жизнеспособность на уровне 78 %). Различия в уровне цитотоксичности между видами могут быть связаны с различиями в их биохимическом составе . Согласно полученным данным, A. foeniculum характеризовался меньшим содержанием растворимых ФС и флавоноидов по сравнению с другими изучаемыми видами (табл. 4.1-4.2). При 5 %-ной концентрации экстракта из каллуса ж изнеспособность клеток остается приблизительно на одинаковом уровне и составляет 60...70 % для всех трех видов (рис. 4.7-4.10), что также согласуется с ранее полученными данными, согласно которым содержание флавоноидов и других ФС в каллусах всех изучаемых видов раличается незначительно (табл. 4.1-4.2).
Цитотоксические свойства метанольных экстрактов, эфирных масел и их отдельных компонентов Agastache spp. были установлены на разных типах клеток (Kim, Chung et al., 2001; Haiyan et al., 2016; Gong et al., 2017; Lee, Ryu et al., 2017). Нами было установлено, что цитотоксической активностью также обладают водные экстракты из растений и каллуса Agastache spp. Эти и ранее полученные данные говорят о высоком потенциале представителей рода как источников противоопухолевых активных компонентов.