Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1 Биохимическая характеристика Withania somnifera 11
1.2 Противовоспалительные свойства Withania somnifera 13
1.3 Противоопухолевые свойства Withania somnifera 16
1.4 Антистрессовый эффект Withania somnifera 18
1.5 Антиоксидантное действие Withania somnifera 19
1.6 Иммуномодулирующие свойства Withania somnifera 21
1.7 Гематопоэтический эффект Withania somnifera 22
1.8 Общетонизирующее действие Withania somnifera 23
1.9 Воздействие Withania somnifera на нервную систему 25
1.10 Влияние Withania somnifera на эндокринную систему 26
1.11 Воздействие Withania somnifera на сердечно-сосудистую и дыхательную системы 27
1.12 Исследование общей токсичности Withania somnifera 28
1.13 Особенности культивирования Withania somnifera in vitro 31
Глава 2. Материал и методы исследований 36
2.1 Биологическая характеристика объекта исследования 36
2.2 Методы исследований в лабораторных условиях 40
2.3 Математическая обработка данных 50
Глава 3. Изучение морфогенетического потенциала Withania somnifera L. в условиях in vitro 51
3.1 Получение стерильной культуры 52
3.2 Влияние различных регуляторов роста на размножение ашваганды in vitro 56
3.2.1 Влияние БАП на размножение ашваганды in vitro 57
3.2.2 Влияние кинетина на размножение ашваганды in vitro 60
3.2.3 Влияние препарата Дропп на размножение ашваганды in vitro 61
3.2.4 Влияние препарата Цитодеф на размножение ашваганды in vitro 64
3.3 Получение каллусной культуры ашваганды 69
3.4 Регенерация растений из каллусной ткани 72
3.5 Получение суспензионной культуры 74
Глава 4. Получение растительных экстрактов Withania somnifera L. и изучение их биологической активности 80
4.1 Определение антифунгицидного действия растительных экстрактов Withania somnifera на грибах рода Fusarium L 82
4.2 Действие изучаемых экстрактов Withania somnifera на раковые клетки человека 86
4.3 Тест система для определения биологической активности изучаемых экстрактов Withania somnifera 89
Выводы 95
Список литературы 97
- Противовоспалительные свойства Withania somnifera
- Особенности культивирования Withania somnifera in vitro
- Влияние препарата Цитодеф на размножение ашваганды in vitro
- Тест система для определения биологической активности изучаемых экстрактов Withania somnifera
Противовоспалительные свойства Withania somnifera
Эффективность применения ашваганды в различных ревматологических условиях может быть отчасти из-за его противовоспалительных свойств, которые были изучены несколькими авторами. Так, например, в исследованиях Anbalagan и соавт. (Anbalagan K., Sadique J., 1981) корень Withania somnifera (1 г/кг) суспендировали в 2% смоле акации (50 мг/мл) и за один час до индукции воспаления полностью перорально вводили этот адъювант крысам. Эту процедуру осуществляли ежедневно в течение трех суток. В качестве контроля служил вариант с применением фенилбутазона (100 мг/кг). Экспериментально установлено, что использование суспензии Withania somnifera приводило к значительному снижению воспаления, за счет изменения в крови концентраций многих групп сывороточных белков (2-гликопротеид, 1-белок основной острой фазы, преальбумин). Содержание 2-гликопротеина в сыворотке крови крысы было снижено до неопределяемого уровня только в варианте с использованием суспензии ашваганды. В контрольном варианте с применением фенилбутазона было отмечено увеличение содержания 2 гликопротеина как у здоровых, так и больных артритом крыс. Что касается белка острой фазы (пик 2, -1- белок основной острой фазы), то при воспалении его содержание увеличилось приблизительно на 200% и снизилось до нормального уровня при лечении суспензией Withania somnifera. В контрольном варианте (применение фенилбутазона) уровень белка удалось снизить лишь только до уровня 132%. Кроме того, использование суспензии Withania somnifera оказало влияние у нормальных крыс и на несколько белковых модуляторов, что возможно, связанно с тем, что некоторые химические соединения растений ашваганды взаимодействуют в процессе синтеза белков печени.
Другие исследования, проведенные Anbalagan и соавт. (Anbalagan K., Sadique J., 1984) показали, что применение W. somnifera вызывало дозозависимое подавление 2-макроглобулина (показатель для противовоспалительных препаратов) в сыворотке крови крыс, которые заранее были инфицированы путем подкожного введения суспензии каррагенана. В качестве тестируемого препарата использовали различные концентрации сухого порошка, полученного из корней ашваганды (500, 1000, 1500 и 1200 мг/кг), которые вводили в виде суспензии перорально за 3-4 часа до индукции воспаления. В результате исследований был отмечен максимальный эффект (около 75%) при концентрации 1000 мг/кг. Однако, следует отметить, что авторами не было проведено фактического измерения воспаления.
В исследованиях Begum и соавт (Begum V.H., Sadique J., 1987) показано, что гранулема возникает в воздушном мешке при подкожной инъекции 4 мл 2%-ого (масса/объем) каррагинана на тыльных крысах-самцах линии Вистар (150-200 г) за одни сутки до введения в спинку 6 мл воздуха. Порошок из корня ашваганды (1000 мг/кг) давали крысам перорально в течение трех суток с 7 по 9 день. Радиоактивный раствор Na232SO4/100 г вводили внутрибрюшинно на 9 сутки, а в митохондриях гранулемной ткани определяли включение 35S в гликозаминогликан, окислительное фосфорилирование (коэффициент АДФ/О), ферменты Мg2+- зависимые Атфазы и активность сукцинат дегидрогеназы. Как показали исследования, в варианте с применением суспензии ашваганды содержание гликозаминогликанов в гранулемной ткани снизилось на 92% по сравнению с 43,6% в контрольном варианте, в котором для лечения применяли гидрокортизон (15 мг/кг). При лечении бутадионом (100 мг/кг) эффекта так же не было получено. Было показано, что лечение суспензией W. somnifera разобщает окислительное фосфорилирование путем значительного снижения соотношения в коэффициенте АДФ/О в митохондриях гранулемной ткани, что в последующем приводит к увеличению ферментов Мg2+- зависимых-АТФаз и снижению активности сукцинат дегидрогеназы. Никаких физических измерений воспаления не проводилось. Помимо исследований, приведенных выше, Begum и соавт (Begum V.H., Sadique J., 1988) в своих других исследованиях изучали влияние порошка корня W. somnifera (1000 мг/кг, при введении перорально ежедневно 15 суток) на отечность лапы и костные дегенеративные изменения в артритах, индуцированных адъювантом Фрейнда у крыс. Известно, что для лечения таких симптомов заболевания существует единственный лекарственный препарат – это гидрокортизон (15 мг/кг). Однако исследования Hindawi и соавт. (al Hindawi M.K., al Khafaji S.H., Abdul-Nabi MH.,1992) показали, что использование W. somnifera ингибирует образование гранулемы при имплантации пеллетов у крыс, и данный эффект сопоставим при лечении гидрокортизоном в концентрации 5 мг/кг. Метанольный экстракт W. somnifera (10 мг/кг, 0,1 доза ЛД50) был дан за один час до имплантации пеллетов и продолжалось до тех пор, пока гранулы не были собраны на 4-й день.
Из литературных данных установлено, что при лечении артрита было проведено клиническое исследование использования W. somnifera. В двойном слепом плацебо-контролируемом перекрестном исследовании 42 пациента с остеоартритом были рандомизированы для получения препарата, содержащего вторичные метаболиты ашваганды, или плацебо в течение трех месяцев. Первоначально, в течение одного месяца, до начала лечения проводили ежедневное наблюдение за пациентами, во время которого все предыдущие препараты были изъяты. На этапе предварительного лечения и в момент собственного лечения еженедельно оценивали такие показатели, как боль в суставах и инвалидность, а скорость седиментации эритроцитов (SED) и радиологические исследования проводили ежемесячно. Полученная вытяжка из растений ашваганды значительно уменьшала тяжесть боли (p 0,001) и показатель инвалидности (p 0,05), хотя существенных изменений в радиологических исследованиях состояния или скорости седиментации эритроцитов (SED) не было обнаружено (Kulkarni R.R., Patki P.S., Jog V.P., et al., 1991). Стоит отметить, что изучение механизма действия растений W. somnifera на противовоспалительные процессы привлекает все большее внимание исследователей. Так, в одном из исследований, проведенном на крысах, было показано, что при применении препарата на основе W. somnifera или препарата оксифенбутазона (ингибитор циклооксигеназы) наблюдалось снижение абсорбции 14C-глюкозы в их тонкой кишке крысы (Somasundaram S, Sadique J, Subramoniam A., 1983) и этот показатель в двух вариантах поддерживался на нормальном уровне. Оба препарата показали противовоспалительный эффект. Аналогичные результаты были получены в параллельных исследованиях с использованием 14C-лейциновой абсорбции из тонкой кишки (Somasundaram S, Sadique J, Subramoniam A., 1983). Эти исследования свидетельствуют о том, что в процессе ингибирования циклооксигеназы может участвовать вторичные вещества ашваганды.
Особенности культивирования Withania somnifera in vitro
Анализируя литературные данные по культивированию Withania somnifera in vitro, можно заключить, что это растение в настоящее время пользуется большим интересом у исследователей, работающих в области клеточной и генной инженерии. Безусловно, наиболее популярным направлением исследований является изучение вторичных метаболитов растения и факторов, направленных на управление этим процессом. Кроме того, интерес вызывают работы связанные с разработкой регламента клонирования ашваганды in vitro, а также работы по созданию трансгенных растений Withania somnifera.
Как отмечалось выше, одним из значимых вторичных метаболитов ашваганды является витаферин А. Поэтому в работах по культивированию клеток и тканей ашваганды in vitro этому веществу придается особое внимание.
Так, Sangwan и др. (2007) обнаружили биосинтез витанолида А в побегах W. somnifera. Были исследованы множественные побеги W. somnifera, образованные на МС - среде, дополненной 2,0 мг BA/L, из апикального экспланта, а также их потенциальные возможности синтеза витаферина A и витанолида D. В каллусных культурах синтеза этих веществ не наблюдалось, но во множественных побегах они синтезировались в значительном количестве, причем наибольшая их концентрация была отмечена на среде с добавлением 2,0 мг/л БАП и 10 % кокосового молока (Ray and Jha, 2001). Bandyopadhyay и др. (2007) указали, что концентрация алкалоидов в каллусе выше, чем в корнях культуры, выращенной в обычных условиях. Максимальная концентрация витанолидов (10 мг/г сухого вещества) была получена в биореакторе. Было изучено влияние ГК3 на увеличение длины побега в период размножения и вплоть до укоренения растения (George et al., 2008). Roja и др. (1991) отметили, что множественные побеги образовались из каллуса пазушных почек при морфогенезе. Hussain и Ilahi (1988) получили всхожесть свыше 80 % при обработке культуры тиомочевинной (ИУК + ГК3) отдельно или в качестве дополнения к механической скарификации при 25 С. Частота прорастания улучшалась в водонасыщенных почвах (pH 7.0). Было отмечено развитие побегов из адвентивных почек, полученных из эксплантов молодых листьев перца Чили на МС среде с добавлением БАП и ГК3 (Golegaonkar and Kantharajah, 2006). Совместное добавление бензилового аденина и кинетина повлияло на морфогенез, а также на биосинтез витанолида А in vitro в побегах двух линий. Sen and Sharma (1991) впервые описали размножение побегов in vitro с последующим ризогенезом из асептических проростков, культивируемых на МС среде, дополненной БАП. Govindraju и др. (2003) сообщали о прямой регенерации из эксплантов листового происхождения, для того же самого растения, но адвентивные почки формировались при добавлении в МС среду БАП (1,0-3,0 мг/л), ИУК (0,5 мг/л) и кокосового молока (10%). Shukla и др. (2010) отмечали регенерацию видов W. somnifera из различных эксплантов. Abhyankar и Chinchanikar (1996) описали регенерацию W. somnifera из экплантов листового происхождения, культивируемых на МС среде, дополненной ИУК и БАП, минуя стадию каллусогенеза. Размножение in vitro через органогенез, с использованием различных эксплантов и дифференциация множественных побегов были получены на МС среде с БАП (Kulkarni et al., 2000). Регенеранты были пересажены в горшки со смесью почвы и песка, адаптированы в комнатных условиях и, в конечном итоге, укоренившиеся растения были пересажены в почву (Siddique et al., 2004). Sivanesan и Murugesan (2008) при изучении этого же растения, отмечали, что ИМК эффективно влияла на корнеобразование (100 %) у регенерантов, полученных из узловых эксплантов. Также сообщалось о каллусогенезе таких эксплантов W. somnifera, как пазушных листьев, пазушных побегов, гипокотиле и сегментах корня на средах МС и 1962 с добавлением 2 мг/л 2,4-D и 0,2 мг/л кинетина (Rani et al., 2003). Побеги опытных линий, культивируемые на среде с 1,0 мг/л БАП и 0,5 мг/л кинетина имели наивысшую концентрацию витанолида А, равную 0,238 %. Наиболее активное корнеобразование и пролиферация были получены у Stevia rebaudiana при добавлении в среду 0,5 мг/л НУК (Rafiq et al., 2007). Также в литературе говорится о массовом микроразмножении W. somnifera при помощи узловых и побеговых эксплантов.
Sharma M.M. и др. (2010) в своей работе показали, что возможна регенерация растений W. Somnifera путем соматического эмбриогенеза in vitro. Эмбриогенный каллус был получен из листовых эксплантов, культивируемых на среде по прописи Мурасиге и Скуга, содержащей 2,4-Д в концентрации от 0,5 до 5,0 мг/л и 6-БАП в концентрации от 0,5 до 5,0 мг/л. Высокая частота индукции соматического эмбриона (10,89 ± 0,78) была отмечена на варианте с 0,5 мг/л 2,4-Д и 1,0 мг/л 6-БАП вместе с гидролизатом казеина в концентрации 10,0 мг/л. Полученный морфогенный каллус регулярно культивировали на той же среде и том же режиме, однако, при этом наблюдались все стадии развития эмбриоидов, начиная от глоулы и заканчивая формированием проростков. Хорошо развитые эмбрионы прорастали на среде MS, обогащенной 6-БАП в концентрации 0,5 мг/л. В дальнейшем эти проростки культивировали на среде MS, содержащей ИМК в концентрации 1 мг/л. Выживаемость составила 55 %. Полученные растения были морфологически похожи на маточные растения. Полученный протокол Sharma M.M. и др. (2010) внес вклад для проведения в дальнейшем исследований по генетической трансформации Withania somnifera.
Так, Kalpesh B Ishnava и др. (2012) проводилась генетическая трансформация Withania somnifera (L.) Dunal с использованием Agrobacterium tumefaciens (штамм MTCC431). В качестве эксплантов для генетической трансформации использовали листья, корень и семена. Данные экспланты культивировали на питательной среде по прописи MS, содержащей гормоны в различной комбинации, с целью получения растений регенерантов. Различные показатели, такие как период заражения A. tumifaciens, продолжительность времени, концентрация гиббереллиновой кислоты и сахарозы, значительно влияют на увеличения производства биологически активных метаболитов. Оптимальным периодом заражения Agrobacterium tumefaciens при генетической трансформации являлось 24 часа. Замачивание семян в течение 72 часов до периода заражения увеличило их всхожесть до 80%, что было сравнительно выше, чем через 24 и 48 часов. Показано, что концентрация сахарозы 35 и гормонов роста ГК 2 мг / мл продуцируют 60% всходов за 7 дней, если семена заражены 24 часа.
Клональное микроразмножение – это важный метод получения ценных биохимических веществ, таких как ферменты, флавоноиды, пигменты, витамины и т.д. W. somnifera является важной, с медицинской точки зрения, культурой в области сельского хозяйства, но различные сорные примеси негативно влияют на рост и всхожесть данной культуры. Сорняки уменьшают скорость прорастания семян ашваганды, а применение гербицидов и удобрений является дорогостоящими мероприятиями. В настоящее время нет никаких сомнений в том, что культура клеток и тканей играет важную роль в улучшении сельскохозяйственного производства. Культура клеток и тканей растений, необходимая для того чтобы удовлетворить требования производства, была разработана для массового размножения лекарственных растений (Thomas and Philip, 2005;Thomas and Shankar, 2009). Сохранение Curculigo orchioides и других исчезающих видов (Nagesh, 2008; Offord and Tyler, 2009), а также биологически активные компоненты W. somnifera изучались Wadegaonkar и др. (2006). Культура клеток и тканей применительно для ашваганды будет предназначена для массового производства посадочного материала, производства растительного материала, освобожденного от вирусов, селекционных целей, сохранения и размножения сельскохозяйственных растений и животных. Кроме того, данное исследование может способствовать фитохимическим анализам ашваганды для получения биологически активных компонентов.
Составленный протокол по каллусогенезу и пролиферации может быть использован в последующих работах, посвященных массовому размножению
Традиционное производство W. somnifera (семенами) крайне нежелательно по нескольким причинам, а именно – низкая урожайность и энергия прорастания семян, и подверженность заболеваниям, вызванным патогенными грибами (Misra et al., 1997). Культура клеток и тканей растений является неотъемлемой частью молекулярных методов, направленных на улучшение характеристик культур, и выступает как посредник, благодаря которому ученые могут применить достижения молекулярной биологии в выделении и модификации генов к изучению растительных клеток. Был разработан эффективные протокол инициации каллусогенеза, с использованием эксплантов из стебля. Протокол может быть использован для синтеза и выделения метаболитов в каллусной культуре, поскольку естественное размножение W. somnifera занимает много времени из-за длительного периода и низкого уровня энергии прорастания.
Таким образом, анализируя литературные данные следует заключить, что интерес у исследователей к ашваганде постоянно растет из-за ее ценных вторичных метаболитов, которые широко применяются в медицине. Поэтому изучение данной культуры в условиях in vitro, остается актуальной проблемой, а полученные данные, несомненно, будут иметь как практическое, так и научной значение.
Влияние препарата Цитодеф на размножение ашваганды in vitro
В последнее время препарат Цитодеф стал широко применяться в качестве индуктора морфофизиологических процессов в культуре in vitro. Прежде всего, Цитодеф является синтетическим производным природного регулятора роста дифенилмочевины. По своей активности он не уступает таким цитокининам, как БАП и кинетин, а в некоторых случаях его применения он превосходит их. В связи с тем, что такой эффект был отмечен на плодовых, сельскохозяйственных, цветочных и других культурах в условиях in vivo, то представляется интерес его испытания и в культуре in vitro. Как и для препарата Дропп, препарат Цитодеф был испытан в низких концентрациях, исходя из литературных данных. Полученные результаты приведены на рисунках 28-30.
В результате проведенных исследований было показано, что препарат Цитодеф в исследуемых концентрациях оказывает ингибирующий эффект на морфофизиологические процессы. Причем, с увеличением концентрации препарата в питательной среде этот эффект усиливался. Наглядно это проявлялось на формировании адвентивных микропобегов, средняя высота которых по вариантам уменьшалась от 2,5 до 1,1 см. Что касается индукции образования адвентивных почек, то этот процесс во всех вариантах не превышал 1, что свидетельствует о неэффективности применения препарата Цитодеф для размножения ашваганды в культуре in vitro.
Следует отметить интересный факт, что только на питательных средах, содержащих препарат Цитодеф, был отмечен флоральный морфогенез.
Сформировавшиеся цветки по своей морфологии были схожи с цветками, формирующиеся в условиях in vivo (Рис. 31).
Таким образом, на основании многоплановых исследований по влиянию различных регуляторов роста на клональное микроразмножение ашваганды, а также на основании полученных результатов нами была установлена наилучшая концентрация гормона, при которой наблюдали максимальный положительный эффект. Обобщенные результаты по регуляторам роста приведены на рисунках 32 и 33.
Таким образом, на основании полученных данных нами был разработан регламент, позволяющий клонировать Witania somnifera и получать необходимое количество зеленой биомассы для проведения последующих исследований по изучению вторичных метаболитов как в растениях-регенерантах, так в каллусной и суспензионной культуре.
На основании проведенных исследований и установления оптимальных условий культивирования нами были предприняты попытки изучить способность листовых эксплантов, изолированных с микрорастений ашваганды, к регенерации растений. В экспериментах были испытаны две наилучшие среды: 1 – МС + препарат Дропп 0,05 мг/л, 2 – МС + БАП 0,5 мг/л. Полученные результаты наглядно представлены на рисунке 34.
В результате проведенных исследований нами было установлено, что гормональный состав питательной является важнейшим фактором, регулирующим процесс морфогенеза. Так, на питательной среде МС + препарат Дропп 0,05 мг/л наблюдали множественное образование адвентивных почек, которые в дальнейшем развивались в микропобеги высотой 1 см. В среднем коэффициент размножения в этом варианте составлял 20-23 (Рис. 34а), в то время как в варианте МС + БАП 0,5 мг/л данный показатель не превышал 5-6 (Рис. 34б), а сформировавшиеся адвентивные почки характеризовались замедленным ростом, что приводило к образованию микропобегов высотой не более 0,5 см.
Таким образом, показано, что клонировать растения ашваганды возможно не только за счет активации развития существующих меристем, но и за счет индукции образования адвентивных почек непосредственно на первичном экспланте.
Тест система для определения биологической активности изучаемых экстрактов Withania somnifera
Наши исследования показали, что вторичные метаболиты могут оказывать не только ингибирующий эффект на рост мицелия грибов рода Fusarium L. и раковые клетки человека, но и могут проявлять биологическую активность при прорастании семян растений.
В нашей работе, как и в предыдущих опытах, была изучена биологическая активность экстрактов, полученных из растений-регенерантов и каллусной ткани на семенах растений из разных таксономических групп (лук, капуста белокочанная, томат, лен долгунец). Полученные экстракты были изучены в следующих концентрациях: 100 мг/л, 10 мг/л, 1 мг/л, 0,1 мг/л и 0,01 мг/л. В качестве растворителя применяли диметилсульфоксид.
Первоначально были проведены исследования по изучению влияния различных концентраций изучаемых экстрактов на проростках лука репчатого. В современных исследованиях Allium cepa L. считается эталонным растительным тест-объектом для анализа мутагенности, митотоксичности и токсичности различных факторов, например, экстрактов, полученных из растений-регенерантов и каллусной ткани ашваганды. Наряду с Alliumest используются и другие тест-объекты (среди растений наиболее часто горох Pisum sativum и бобы Vicia faba). Данный метод не требует знания кариотипа и идентификации типов повреждений хромосом, является простым, экономичным и достаточно чувствительным для определения «мутаген» или «не мутаген» фактор. Метод позволяет регистрировать хромосомные мутации типа делеций и транслокаций, следствием которых является наличие мостов и фрагментов в ана- и телофазе. Метод позволяет выявить изменение поведения хромосом на веретене деления. Исследования показали, что исследуемые экстракты в изучаемых концентрациях не приводят к хромосомным мутациям.
Кроме того, в результате проведенных исследований были установлены некоторые закономерности в биологической активности изучаемых экстрактов: 1) экстракты в концентрации 100 мг/л оказывали ингибирующий эффект на прорастание семян. В этом варианте всхожесть составила 0%; 2) с уменьшением концентрации экстрактов увеличивается их стимулирующий эффект, который проявлялся на формировании как подземной, так и надземной части проростков; 3) наибольшую ростстимулирующую активность проявили экстракты, полученные из растений-регенерантов (Рис. 51, 52).
Аналогичные исследования были проведены и на семенах растений других таксономических групп (томат, лук, капуста). В результате проведенных исследований были получены аналогичные результаты. Основные результаты приведены на рисунках 53-56.
Таким образом, в результате проведенных исследований нами было показано, что экзометаболиты дифференцированных и дедифференцированных клеток ашваганды, культивируемых в условиях in vitro, обладают разной биологической активностью, которая проявлялась на грибах рода Fusarium L., раковых клетках человека, а также на семенах растений разных таксономических групп.