Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 12
1.1 Ботанико-географическая характеристика Mentha pulegium L. 13
1.2 Генетико-систематическая характеристика Mentha pulegium L . 17
1.3 Биохимическая характеристика Mentha pulegium L. 25
1.4 Культивирование представителей рода Mentha L.in vitro 29
1.5 Использование Mentha pulegium L. в кормлении домашней птицы 38
1.6 Активные фармацевтические ингредиенты (АФИ) из растительного
сырья 42
ГЛАВА II. Объекты и методы исследований 46
2.1 Растительный материал 46
2.2 Введение в культуру in vitro семян и проростков Mentha pulegium L. 46
2.3 Изучение влияния состава питательной среды на эффективность морфогенетических процессов в культуре Mentha pulegium L. in vitro 47
2.4 Генетическая трансформация растений Mentha pulegium L. 48
2.5 Изучение анатомических особенностей Mentha pulegium L. в культуре in vitro 51
2.6 Изучение биохимических особенностей Mentha pulegium L. в культуре in vitro 53
2.7. Статистическая обработка данных 57
Экспериментальная часть 58
ГЛАВА III. Культивирование мяты болотной (mentha pulegium l.) in vitro 58
3.1 Введение в культуру in vitro семян и проростков Mentha pulegium L.
3.2 Изучение влияния состава питательной среды на эффективность морфогенетических процессов в культуре Mentha pulegium L. in vitro 63
3.3. Генетическая трансформация растений Mentha pulegium L. 75
ГЛАВА IV. Изучение анатомических особенностей мяты болотной (mentha pulegium l.) в культуре in vitro 81
4.1 Гистологический анализ каллусной ткани Mentha pulegium L. 81
4.2 Анализ устьичного аппарата нижнего эпидермиса листьев Mentha pulegium L. различных ярусов, полученных при различных условиях культивирования 83
4.3 Анализ железистого аппарата нижнего эпидермиса листьев Mentha pulegium L. различных ярусов, полученных при различных условиях 88
4.4 Анализ крупных волосков (трихом) нижнего эпидермиса листьев Mentha pulegium L. различных ярусов, полученных при различных условиях культивирования 90
ГЛАВА V. Изучение биохимических особенностей мяты болотной (mentha pulegium l.) в культуре in vitro 93
5.1 Анализ цитотоксичности экстракта Mentha pulegium L. на линии клеток M HeLa 93
5.2. Анализ общего содержания фенольных соединений в растениях Mentha pulegium L., полученных при различных условиях 94
Выводы 101
Список литературы
- Генетико-систематическая характеристика Mentha pulegium L
- Введение в культуру in vitro семян и проростков Mentha pulegium L.
- Изучение влияния состава питательной среды на эффективность морфогенетических процессов в культуре Mentha pulegium L. in vitro
- Анализ железистого аппарата нижнего эпидермиса листьев Mentha pulegium L. различных ярусов, полученных при различных условиях
Генетико-систематическая характеристика Mentha pulegium L
Таксономическая классификация затруднена из-за высокой склонности к полиплоидизации и анеуплоидизации, вегетативного размножения и высокой частоты спонтанной межвидовой гибридизации (Morton, 1956; Harley and Brighton, 1977; Tucker and Chambers, 2002; Tucker, 2007).
Систематика рода Mentha L. в целом запутанная, статус рода до конца не определен. Монофилия Mentha L. вызывает сомнения, так как некоторых представителей рода относят к другим близкородственным родам, таким как Micromeria, Pulegium, Audibertia, Menthella, Thymus, Satureja и Preslia (Briquet, 1897; Tucker, 2007).
Briquet (1897) разделил виды Mentha на пять разделов (Eupulegia, Audibertiae, Verticillatae, Capitatae и Spicatae) в рамках двух подродов (Pulegium и Menthastrum), М. cervina поместил в род Preslia (Briquet, 1897). Harley и Brighton (1977) разделили род также на 5 разделов, но других: Audibertia, Eridontes, Mentha, Preslia и Pulegium. В классификации Tucker, основанной на морфологии, количестве хромосом, а также перечне основных компонентов эфирного масла, род Mentha L. состоит из 18 видов, разделенных на две секции – Mentha и Pulegium (Bansawatt, 2002).
В роде Mentha L. встречается четыре основных числа хромосом (гаплоидный набор) x = 9, 10 и 12 (Harley and Brighton, 1977; Chambers and Hummer, 1994). Большинство видов имеют основание число хромосом x = 12. M. requienii – единственный вид с основным числом хромосом x = 9, а у M. japonica, М. gattefossei и М. pulegium основное число хромосом x = 10 (Makarov, Reznikova, 1972; Harley, Brighton, 1977). По данным Chambers и Hummer (1994), а также Harley и Brighton (1977), только пять видов мяты (M cervina, M. longifolia, M. pulegium, M. requienii и M. suaveolens) диплоидны. Однако также сообщалось, что у М. longifolia и М. pulegium встречаются тетраплоидные формы. Уровни плоидности остальных видов в диапазоне от 3n до 10n. Наиболее распространенными являются гекса-(например, М. arvensis) и октоплоидные (например, M. aquatica) формы (Harley and Brighton, 1977; Chambers and Hummer, 1994).
Изучение филогенетических связей позволяет понять, «как развивались организмы, их черты и взаимодействия между видами» (Wiens, 2000). Эта информация может быть полезна для селекционеров, молекулярных генетиков, специалистов в области защиты растений, систематиков и биогеографов, а также в исследовании видов, находящихся под угрозой исчезновения. В случае Mentha знание эволюционных отношений может помочь молекулярным генетикам и селекционерам улучшить вид, создать гибриды, сорта, обладающие более высокой урожайностью и выходом масла с заданными свойствами, а также более высокой устойчивостью к заболеваниям (Kellogg et al., 1996; Krasnyanski et al, 1998; Khanuja, 2000).
По результатам построения филогенетического древа на основе последовательности trnLrnF, M. pulegium более тесно связана с М. requienii из секции Audibertia, чем с M. gattefossei из секции Pulegium (рис. 1.3) (Bansawatt, 2002). Однако на основе ITS было показано, что M. gattefossei тесно связана с М. cervina из секции Preslia. Это подтверждает предположение Harley и Brighton (1977) о возможной тесной взаимосвязи между M. gattefossei и М. cervina на основе морфологического и экологического сходства этих двух видов. Кроме того, Chambers и Hummer (1994) обнаружили, что M. gattefossei занимает по морфологии промежуточное положение между М. cervina и М. pulegium. Рис. 1.3. Филогенетическое древо, построенное на основе последовательности TRNLRNF (Bansawatt, 2002) 1.3 Биохимическая характеристика Mentha pulegium L. Мята болотная (Mentha pulegium L.) является экономически важным источником эфирного масла и природных антиоксидантов. Состав эфирного масла может быть очень различным (табл. 1.1).
Однако, основным компонентом эфирного масла М. pulegium L. является пулегон (например, в эфирном масле из мяты болотной в популяции, произрастающей в Индии, содержится 85...95 % пулегона, в Болгарии - 42,9...45,4 %; в Уругвае - 73,4 %, в Египте - 43,5 % и т.д. (Habiba et al., 2001; Bhat et al, 2002).
Пулегон, в свою очередь, может быть предшественником при синтезе ментола и ментофурана (Croteau et al, 1994; McConkey et al, 2000; Bhat et al, 2002) (рис. 1.4).
Растения рода Mentha L. развивались в природных условиях в результате спонтанной гибридизации и естественного отбора, демонстрируя существенные изменения в ареале, характеристиках роста и аромате (Tutin, 1972; Franco, 1984). В большинстве дикорастущих видов мяты и гибридов наибольшее фитохимическое разнообразие наблюдается в отношении компонентов эфирного масла (Kokkini, 1991, 1992; Mimica-Dukic & Bozin, 2008) (табл. 1.1). На основе базовых метаболических путей различные виды мяты делят на те, где преобладает линалоольный путь (накопление линалоола и линалилацетата), ментольный путь (накопление ментола, ментона и ментофурана) (рис. 1.4.) и карвоновый путь (накопление карвона, дигидрокарвона и карвеола) (Schalk & Croteau, 2000; Lawrence, 2007). Представителями этих путей являются М. aquatica var. citrata, М. х piperita и М х spicata, соответственно. Согласно этой классификации, М pulegium и М. cervina принадлежат к представителям ментольного пути (Lawrence, 2007).
Введение в культуру in vitro семян и проростков Mentha pulegium L.
Для изучения влияния добавления в питательную среду для регенерации антибиотика клафорана и селективного агента фосфинотрицина (действующего вещества гербицида BASTA) на морфогенез мяты болотной стеблевые и листовые экспланты помещали на среду для регенерации МС с добавлением 0,5 мг/л кинетина и 1 мг/л -нафтилуксусной кислоты с добавлением клафорана в концентрациях 0, 250, 500, 750 и 1000 мг/л или, соответственно, фосфинотрицина в концентрациях 2, 4 и 6 мг/л.
Приготовление агробактерии осуществляли по стандартной методике. Для изучения влияния прекультивации на эффективность трансформации мяты болотной использовали 2 варианта опыта: без прекультивации и с прекультивацией в течение 3 суток. Обработка агробактерией проводилась в течение 20 мин. в колбе на шейкере (100 об./мин.).
После кокультивации экспланты помещали на среду для регенерации. Каждые 2 суток снижали концентрацию антибиотика клафорана с 500 мг/л до 0 мг/л для избавления от агробактерии. Итоговая среда содержала дополнительно ауксин ИУК для индукции корневого органогенеза в концентрации 0,5 мг/л.
Регенеранты после генетической трансформации были пересажены на селективную питательную среду без фитогормонов и регуляторов роста, но с содержанием селективного агента фосфинотрицина в концентрации 6 мг/л. Выжившие растения проверяли на наличие селективного гена с помощью ПЦР. Для полимеразной цепной реакции использовали наборы реактивов производства «Биомастер» и Sigma. Амплификацию ДНК проводили в реакционной смеси объемом 10 мкл, содержащей 10х буфер (1 мкл) из соответствующего набора, 0,2 мМ каждого dNTP; 0,4 мкМ праймера; 0,2 единиц Taq-полимеразы, 7,2 мкл деионизированной воды и добавляли по 0,2 мкл ДНК и добавляли по 1 капле вазелинового масла в каждую пробирку. В качестве праймеров были использованы последовательности pr 1: gtg gag cgg cta ttc ggc tat gac tg и pr 2: ggc cac agt cga tga atc cag aaa agc, комлементарные гену bar. При использовании выбранных праймеров амплифицируется фрагмент длиной 450 н.п. Амплификацию проводили в термоциклере «MJResearch P-150» (США) с предварительной денатурацией - 5 мин (94 С) в режиме: денатурация - 30 с при 94 С; отжиг праймера - 30 с при 64 С; синтез ДНК - 1 мин при 72 С с числом циклов - 30. Заключительная элонгация ПЦР-фрагментов проводилась 10 мин при 72 С. Реакции были выполнены в двукратной повторности. В качестве положительного контроля использовалась ПЦР-смесь, содержащая ДНК вектора ( 10 пкг), в качестве отрицательного контроля использовали ПЦР-смесь, не содержащую ДНК.
Продукты реакции амплификации разделяли электрофорезом в 5х ТВЕ буфере в 1,75 %-ном агарозном геле, содержащем бромистый этидий (4 мкг/мл), и фотографировались в проходящем ультрафиолетовом свете. В качестве маркера длины фрагментов ДНК использовали 1kb DNA ladder (Gibco BRL).
Гистологическое исследование проводили на каллусной ткани, образованной листовыми и стеблевыми сегментами Mentha pulegium L. сорта Соня. Участки каллусной ткани фиксировали в 2,5 %-ном глутаровом альдегиде на 0,1 М фосфатном буфере Серенсена (рН 7.2) в сочетании с 1,5 % сахарозы. После отмывки от фиксатора материал дополнительно фиксировали 1 %-ной четырехокисью осмия (ОsО4), обезвоживали в этиловом спирте растущей концентрации (30, 50, 70, 96 и 100 %), затем в окиси пропилена и заключали в смесь эпоксидных смол Эпона-812 и Аралдита (Уикли, 1975). Полутонкие срезы толщиной 1...2 мкм приготавливали с использованием ультрамикротома LKB-V (LKB, Швеция), затем монтировали их на предметные стекла и заключали в смесь эпоксидных смол. Препараты фотографировали и анализировали с помощью микроскопа Olympus BX51 (Olympus, Япония) с камерой Color View II (Soft Imaging System, Германия) (Мубарак и др., 2015). 2.5.2 Анализ устьичного и железистого аппарата растений как косвенной характеристики продуктивного и адаптивного потенциала Было проведено изучение морфолого-анатомических особенностей строения листовых пластинок и стеблей растений, используя микроскопы Primo Star Carl Zeiss и ЛОМО МИКМЕД-1 при увеличении 70х, 150х и 280х, согласно общепринятым методикам (Сербин, 2006). Размер волосков, устьиц и желёзок определяли при помощи окуляр-микрометра 9х Ernst Leitz Wetzlar и объект-микрометра ОМ-П с длиной основной шкалы 1 мм. Фотофиксация результатов проведенного анализа проводилась с использованием цифровой фотокамеры Саnon Power Shot A 95.
Растительный экстракт выделяли из микропобегов мяты болотной, полученных на питательной среде Мурасиге и Скуга. Для экстракции брали сухую массу образца (от 150 до 500 мг) (рис. 2.2а), которую экстрагировали 100 %-ным метанолом (3-5 мл), путем растирания ее в ступке (рис. 2.2б-г). После этого полученную массу помещали в стеклянные пробирки и оставляли при комнатной температуре на 1 сутки (рис. 2.2д). По истечении времени экстракции анализируемый образец дважды фильтровали через фильтровальную бумагу (рис. 2.2е-ж), после чего полученный растительный экстракт лиофильно высушивали. Полученный осадок растворяли в дистиллированной воде (1 мл) (рис. 2.2з) и стерилизовали через бактериологический фильтр. Полученные экстракты растворяли в культуральной среде в различных концентрациях (Балакина и др., 2015). Анализ фармакологического действия вторичных метаболитов Изучение цитотоксичности проводили в лаборатории молекулярной биологии Института проблем химической физики РАН, при непосредственном участии кандидата биологических наук Балакиной А.А.
Для исследования цитотоксичности использовали линию клеток M-HeLa (эпителиоидная карцинома шейки матки человека, сублиния HeLa, клон M HeLa, коллекция Института цитологии РАН, Санкт-Петербург). Культивирование опухолевых клеток проводили согласно общепринятой методике (Фрешни, 2011). Клетки выращивали на среде EMEM (Игла-МЕМ) с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки и 1 % NEAA (незаменимые аминокислоты) в атмосфере 5 % СО2 и температуре 37 С (Балакина и др., 2015).
Для проведения экспериментов клетки рассевали в 96-луночные культуральные планшеты с плотностью культуры 50 000 кл/мл по 100 мкл среды в лунку. Через 24 ч после посева культуральную среду удаляли и заменяли средой с различными концентрациями растительных экстрактов. Инкубацию клеток с экстрактами проводили в течение 72 ч. Повторность в одном эксперименте каждого варианта 8-кратная, представлены данные 3 независимых экспериментов (Балакина и др., 2015).
Изучение влияния состава питательной среды на эффективность морфогенетических процессов в культуре Mentha pulegium L. in vitro
Генетическая трансформация растений является мощным инструментом преобразования природы человеком. С ростом объема информации по отдельным генам, а также в сфере омиксных технологий (геномика, протеомика, метаболомика, транскриптомика, интерактомика и др.) растет и потенциал генетической инженерии. В случае лекарственных растений этот метод внесения целенаправленных изменений позволит повысить как выход продукции, так и ее качество, то есть улучшить компонентный состав вторичных метаболитов.
Большинство экспериментов по генетической трансформации представителей рода Mentha L. были проведены на самых распространенных и популярных гибридных видах – мяте перечной (Mentha piperita L.) и мяте колосистой (Mentha spicata L.). Нашей задачей была разработка методики агробактериальной трансформации растений мяты болотной.
В данном разделе рассмотрены этапы подготовки и проведения генетической трансформации растений Mentha pulegium L. имевшимися в нашем распоряжении векторными конструкциями. Изучение влияния антибиотика клафорана на эффективность регенерации
Для изучения влияния антибиотика клафорана на морфогенез мяты болотной экспланты помещали на среду для регенерации МС + 0,5 мг/л Кин + 1 мг/л НУК с добавлением клафорана в различных концентрациях. Регенерация проходила на всех концентрациях антибиотика клафорана, но с различной эффективностью (табл. 3.8). На рис. 3.11 показаны растения мяты болотной, растущие на питательной среде с добавлением 750 мг/л клафорана. Таблица 3.8
Из данных, приведенных в табл. 3.8, видно, что отсутствует четкая зависимость между концентрацией антибиотика клафорана и эффективностью регенерации. Это может быть связано с быстрой деградацией клафорана в условиях освещенности. Таким образом, растительные экспланты выдерживали концентрации до 1000 мг/л клафорана, что дает больше возможностей для избавления от поверхностной агробактерии после проведения генетической трансформации. Изучение влияния фосфинотрицина на эффективность регенерации
Для изучения влияния действующего вещества селективного гербицида BASTA фосфинотрицина на морфогенез мяты болотной экспланты (сегменты листьев, сегменты междоузлий) помещали на среду для регенерации МС + 0,5 мг/л Кин + 1 мг/л НУК с добавлением фосфинотрицина в концентрациях 2, 4 и 6 мг/л. Результаты приведены в табл. 3.9.
Эффективность регенерации растений M. pulegium L. на питательных средах, содержащих различные концентрации фосфинотрицина Концентрацияфосфинотрицина(мг/л) Эффективность регенерации, % Сорт Пеннироял Сорт Соня Листовые экспланты Стеблевые экспланты Листовые экспланты Стеблевые экспланты 2 10,0 ± 0,3 3,0 ± 0,2 6,0 ± 0,3 6,0 ± 0,3 4 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 3,0 ± 0,2 3,0 ± 0,2 6 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 3,0 ± 0,2 0,0 ± 0,0 Так как при концентрации фосфинотрицина в питательной среде 6 мг/л регенерация отсутствовала практически во всех вариантах опыта, то именно это концентрация была выбрана для селективного отбора растений после генетической трансформации. На рис. 3.12 показано растение мяты болотной на среде, содержащей 6 мг/л фосфинотрицина.
Получение растений-регенерантов после генетической трансформации По результатам экспериментов регенеранты после генетической трансформации были получены только из узловых эксплантов, из листовых и стеблевых эксплантов получить регенерацию не удалось (табл. 3.10, рис. 3.13).
Наибольшая эффективность регенерации была отмечена после трансформации конструкцией с геном Nt-4/1 на двух исследованных сортах: 100 % регенерации в варианте с прекультивацией, 100 % и 90 % соответственно в варианте без прекультивации. Также высокая эффективность регенерации была при использовании конструкции с геном ссII с прекультивацией (90 и 80 % соответственно). При использовании конструкции с геном NDR не было получено ни одного регенеранта. Эффективность регенерации после трансформации конструкцией с геном At-4/1 составила около 50 %. Подтверждение трансгенной природы полученных регенерантов После проведения предварительного селективного отбора на питательных средах, содержащих 6 мг/л фосфинотрицина, с выжившими растениями была проведена полимеразная цепная реакция. Продукты ПЦР разделяли в 1,0 %-ном агарозном геле путем электрофореза. Положительные результаты были получены только у двух растений сорта Соня с геном Nt-4/1 в варианте с прекультивацией. Таким образом, в результате проведенной агробактериальной трансформации получено 2 растения-регенеранта мяты болотной (Mentha pulegium L.) сорта Соня, несущих по результатам ПЦР ген bar устойчивости к фосфинотрицину, а также предположительно ген Nt-4/1 – транспортного белка из Nicotiana tabacum. Низкий выход трансформантов свидетельствует о необходимости продолжения разработки методики генетической трансформации растений мяты болотной.
Анализ железистого аппарата нижнего эпидермиса листьев Mentha pulegium L. различных ярусов, полученных при различных условиях
По данным таблицы 4.4, длина трихом у сорта Пеннироял колеблется от 25,8 мкм до 32,5 мкм, а у сорта Соня – от 21,8 мкм до 30,0 мкм. За редкими исключениями не наблюдается существенных различий между длиной трихом на разных ярусах листьев. У обоих сортов растения-регенеранты после трансформации обладали наибольшей длиной трихом на листьях верхнего яруса, однако на среднем и нижнем ярусе такого преобладания не наблюдалось. Отсутствие существенных различий по длине трихом между растениями, выращенными в почве (in vivo) и на искусственных питательных средах (in vitro) может косвенно свидетельствовать об отсутствии нарушений развития эпидермальных выростов при культивировании растений мяты болотной на искусственных питательных средах. В целом, можно отметить, что растения сорта Соня обладают более короткими трихомами, чем растения сорта Пеннироял, а также более четкой тенденцией к росту длины трихом от верхнего яруса листьев к нижнему.
В эксперименте необходимо было выявить концентрацию, вызывающую 50 %-ную гибель клеток эпителиоидной карциномы шейки матки (клон M HeLa), то есть IC50 для каждого сорта M. pulegium L. Результаты для различных концентраций эстрактов обоих сортов представлены на рис. 5.1 (Балакина и др., 2015)
Как видно на рис. 5.1, концентрация 50 мкг/мл не приводит к достоверному снижению жизнеспособности опухолевых клеток. Повышение концентрации до 500 мкг/мл обнаруживает различия в реакции клеток на экстракты из двух сортов: достоверно большая цитотоксичность сорта Пеннироял не приводит, однако, к принятому в фрамакологической практике стандартному уровню 50 %-ной гибели клеток, при котором исследуемый образец может считаться перспективным для практического использования. При концентрации 2500 мкг/мл оба экстракта приводят почти к 100 %-ной гибели опухолевых клеток. Различия в уровне цитотоксичности между сортами M. pulegium L. могут быть связаны с различным биохимическим составом, то есть различным соотношением между основными компонентами вторичного метаболизма (Балакина и др., 2015).
Одной из характерных особенностей высших растений является их способность к синтезу разнообразных вторичных метаболитов, в том числе фенольных соединений. Фенольные соединения являются структурными элементами клеток (лигнин), в определенных ситуациях жизни клеток могут являться энергетическим материалом (катаболические процессы), а также защищают клетки от разнообразных стрессовых воздействий (патогенез, УФ, тяжелые металлы и др.).
В настоящее время определена роль фенольных соединений в защите клеток от действия патогенов. Показано, что полифенолы, наряду с целлюлозой, образуют барьер на пути проникновения патогенных микроорганизмов (прежде всего, грибов) (Запрометов, 1993). Накапливаясь в растительном организме, они могут ингибировать рост и развитие патогенных микроорганизмов, продуцирование и активность их метаболитов (Беляев, Войтович, Чернышева, 1989). Многочисленными исследователями продемонстрирована также взаимосвязь метаболизма фенолов и процесса некротизации у тканей сверхчувствительных растений (Bruemmer, White, 1987, Coxon et al., 1980, Harborre, 1994, Kurusaki et al., 1986, Srivastava, Van Huystee, 1997). Это обусловлено конденсацией производных коричной кислоты, приводящей к образованию лигнина. Откладываясь в клеточных стенках растений, он повышает их механическую прочность и затрудняет проникновение инфекции через неповрежденные стенки мертвых клеток покровных тканей (Запрометов, 1996, Калинин и др., 1980, Lynn, Chang, 1990).
Следует также подчеркнуть, что существует зависимость биосинтеза фенольных соединений в тканях растений от их генетических характеристик, то есть способность к синтезу фенольных соединений видо- и сортоспецифична (Загоскина и др., 1994). Так, было показано, что различные генотипы картофеля отличаются по содержанию фенольных соединений (Калашникова, 2003). В то же время до сих пор неясны механизмы, определяющие способность растительных клеток и тканей к накоплению тех или иных форм фенольных соединений. И в этом отношении подходы с использованием трансгенных растений, несущих определенные генетические конструкции, является интересным и перспективным методом.
В экспериментах нами было изучено суммарное содержание растворимых фенольных соединений (РФС) в растениях Mentha pulegium L. двух сортов (Пеннироял и Соня), полученных в различных условиях. Результаты анализа представлены в табл. 5.1.