Введение к работе
Актуальность проблеми. В современной биотехнологии исполь-звание генно-инженерных штаммов-продуцентов биологически актив-. « соединений, в том числе аминокислот,- требует фундаментальных следований клонируемых генов - особенностей их структуры и рефляции.
Аминокислота аргинин широко используется в Фармакологии, пневой промышленности и сельском хозяйстве. Крупнотоннажное поучение L-аргинина преимущественно основано на микробиологиче-сом способе производства. В нашей стране и на территории СНГ ргинш в промышленных масштабах не производится ввиду отсут-гвия технологичных штаммов-продуцентов. Поэтому важное значение неег проведение исследований, направленных на создание высоко-зхнологичных штаммов, продуцирующих L-аргинин.
К началу работы гены биосинтеза аргинина Oorynebaoterlum lutamlcum-не были исследованы на молекулярно-гекетическом уров-з. Между тем интерес представляет орнитинацетилтрансфераза .glutamlcum, которая выполняет ключевую стадию биосинтеза арги-яна и, в отличие от аналогичных ферментов Escherichia coll, не {гибируется конечним продуктом пути биосинтеза (Шака. 1966). х предположили, что экспрессия гена ориитинацетилтрансферазы .glutamlcum в клетках E.coll может обеспечить в них сверхсинтез ргинина. Исследования в этой области способствовали бы лучшему эниманию организации и регуляции пути биосинтеза аргинина у ко-янеформных бактерий, молекулярная генетика которых, несмотря на ч интенсивное использование в промышленных производствах, изу-эна недостаточно.
Технологичность продуцентов определяется способностью син-гзировагь продукт на дешевых средах. Для придания штаммам .coll, продуцирующим биологически активные вещества, способио-ги синтезировать целевой продуїст на средах со сравнительно де-гвой сахарозой в качестве источника углерода возможно введение клетки продуцента гетерологичных генов, контролирущих утиди-1циы сахарозы. Известно, что леваназа Bacillus subtlUs являет-' я секреторным ферментом, гидролизирующем сахарозу до утилизиру-шх клетками К.coll моносахаридов iKuust et al., 1977). к нача-/ работы, однако, отсутствовали сведения о выделении гена лева-1зы на молекулярном уровне и о его экспрессии в клетках F.eoli.
В связи с этим представляется актуальным выделение генов
биосинтеза аргинина C.glutamlcani и леваназы B.subtllls к изучение их организации и гетерологичной экспрессии в клетках E.coll. а также, изучение возможности их использования для создания высокотехнологичных штаммов E.coll - продуцентов L-аргинина.
Цель и задачи исследования. Целью работы является изучение возможности использования генов орнитинацетилтрансферазы argJ Cglutamlcum и гена леЕаназы sacC B.suhtllls для конструирования рекомбинантных продуцентов L-аргинина и разработка подходов к созданию штаммов-продуцентов с улучшенными технологическими характеристиками. В соответствие с этим были поставлены следующие задачи:
молекулярное клонирование гена argJ Cglutamlcum:
структурный и функциональный анализ рекомбинантных плазмид, содержащих ген argJ:
изучение экспрессии выделенных генов биосинтеза аргинина Cglutamlciuii в клетках E.coll:
молекулярное клонирование гена sac0 B.subtllls;
структурный и функциональный анализ рекомбинантных плазмид несущих ген sacO:
изучение экспрессии гена леваназы в клетках E.coll:-
конструирование на основе генов sacC и argJ штаммов E.eoll-продуценгов L-аргинина.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые осуществлено молекулярное клонирование генов биосинтеза аргинина Cglutamlcum arge. argD и argJ. Определены полные нуклео.тидные последовательности этих генов и показано, что они образуют кластер с другими arg генами, располагаясь на хромосоме Cglutaml-ешіі в порядке argO-J-B-D-F. Установлено, что продуктом гена argJ является неингибируемая аргинином монофункциональная орни-тинацетилтрансфераза, не имеющая Н-ацетилглутаматсинтазной активности. Установлено наличие у гена argB функционального в клетках E.coll вторичного промотора. Осуществлено молекулярное клоьирование гена леваназы sacC B.subtllls. Показано, что экспрессия гена леваназн в клетках E.coll обеспечивает нормальный рост рекомбинантных штаммов на средах с сахарозой в качестве единственного источника углерода. Показана возможность существования у гена sacC промоторной последовательности, с которой осуществляется транскрипция гена в клетках E.coll. Предложен эффективный способ стабилизации поддержания рекомбинантных плазмид в
итаммах Е.соН. Показана возможность использования гена argJ ;.glutamicmn для конструирования продуцентов аргинина. Сконструированы рекомбинантные плазмиды, объединяшие в своем составе ген леваназы и ключевые гены биосинтеза аргинина из различных источников. С использованием этих плазмид получены стабильные высокоактивные штаммы Е.соН - продуценты аргинина. На основе гконструированного штамма-продуцента E.coll AVl92(pAPG2S) разра-5отан микробиологический способ получения L-аргинина.
На основе полученных данных в НИИБиотехнологии МП РА разра
ботаны лабораторный и опытно-промышленный регламенты на получе
ние высокоочишенного L-аргинина, ддиоие возмоаность развернуть
крупном.-.г-";:'" " выходом целевого продукта 35 г/л
на уровне развитых стран. Опытно-промышленный регламент используется для организации производства L-аргинина на Воронежском заводе кровезаменителей.
Основные положения, выносимые на защиту:
Выделены гены биосинтеза аргинина O.glutamicujn argJ, argB и argD, и определены их нуклеотидные последовательности;
ген argJ C.glutamlciun .кодирует синтез монофункциональной N -Ь-орн'лтин:Ь-глутамат-н-ацешлтрансферазы, не ингибируемой аргинином:
выделен ген леваназы sacC B.subtlLla;
транскрипция гетерологичных генов argB и аасС в клетках Ё.соИ осуществляется с собственных промоторов:
- экспрессия гена леваназы B.subtllls в клетках Е.соН
обеспечивает нормальный рост рекомбинантных штаммов и синтез
целевого продукта на средах с сахарозой в качестве единственного
источника углерода:
'- введение гена леваназы в состав плазмид стабилизирует их поддержание в клетках Е.соН при росте рекомбинантных штаммов на средах с сахарозой:
ген argJ c.glutamioum обеспечивает в рекомбинантных штаммах E.coll с дерепрессированной транскрипцией arg-генов повышенный синтез аргинина:
генно-инженерный штамм E.coll AV192(pAF:G2S) (LGE-28, ВКПМ В-4119) является высокотехнологичным продуцентом L-аргинина, обеспечивающим в оптимальных условиях выход целевого продукта на уровне 35 г/л.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения,