Введение к работе
Актуальность проблемы. Несмотря на предпринимаемые исследователями усилия по разработке бессызоротэчкых питательных сред, сыворотка крови человека или животных все есе остается необходимым компонентом большинства питательных сред для культур клеток и вирусов.
В практике культивирования культур клеток и вирусов наиболее часто используется эффективная, но дорогостсязая сыворотка крови плодоз коровы, в основном производства зарубежных фирм.
Наиболее доступная сывсротка крови крупного рогатого скота (КРС) ' наела применение з составе питательных сред (ПС), предназначенных в оснозкен для репродукции менее чувствительная к ростовым и икгибируюшда Фактооан клеточных линии. Ряд исследователей (Астахсза, 197Е; Воробьев, 1972; Дроздова, 1930; Игу дин. и др., 1953: Хаертыкоз. 19S5) довольно аса сторонне изучили свойства сыворотки КРС, однако готовый коммерческий препарат этого вида сыворотки, выпускаемый в СССР, до сиз пор не стандартизовал, характеризуется пизь по двум показателям - внешний вид и стерильность (ТУ49-246-75), а существующая технология его производства не позволяет получать стабильный по биологическим свойствам препарат для культур клеток.
Постановлением Совета Министров СССР и ЦК КПСС N307 от 25 августа 1937 г. по биотехнологии определена, з частности, задача организации в стране производства сывороток, полученных из крови различных, видов животных.
Хак показал анализ литературных данных з ССС? отсутствуют современные крупномасатабные технологии получения сывороток для культур клеток, беден их ассортимент, мала изучены свойстза, а данные, хасаюеиеся различных стадий технологического процесса,очень ограничены, весьма противоречивы и выполнены на лабораторном уроєне. Кроме того следует отметить,- что многие вопросы, связанные с разработкой технологии производства сыворотки крови для культур клеток, остаются пока не изученными. 3 частности, не освеиекы /слози.?, влияющие на качестзо готозого препарата, не рассмотрены z?v,~ чины, обусловливайте ее токсичность, не показана возможность перехода от лабораторных исследований к оактно-сромыз-леннсму произзодстзу, не изучена возможность применен*;.? широкого спектра отечественных іильтруїкдих материалов и оборудования в производстве сыворотки.
КеоСхсіпность свогедекі:?. исслепогаЕПй в направлении к;>'і:с:~-:5 свойств culopctok kdosii различкігл видов ж.кьотнш:, a тік;:е- разогХоткн опюгно-прсігьдґ.єйной технологии их получения гк.тег.ала и.3 залач научгкг подразделеіпгй ЕПЭ "Ректор" по кр.-локасктаОЕС-ку культигл'.ровани» клеток-продуцентов к упругое.
Гелі- н задача кссл~лоз^к:н. Ці лью настоящей роботи Оігла рлпзїггкі ч сокерггз-чстзоганле сушествукеей технологии про-;:і;;,-с7Еа сывороток крози разлиты;: ви«оз >:.:idoteks, изучение :::-: -їпзико-гкп.'ческих, биолкничеекил и Сиологпчєскпї; сесйсть г стнолекэт: культур клеток клеколптакцил к насеконш:, ь также LT.pyCOE.
В залачи исследования Егсдддо:
Разработать сглітко-произтплгккугз телчолегн» получения с.чг-зрс-ток кроьи различных .«из огнен:, пркгоддьз: для крулво-касптг-Окого культивирования культур клеток и вирусов;
испытать отечественные фяльтрук;;цпе материалы к екореть кїиСОі.гє перспективные е-г.я осуществления сте-рилнзуг.-ізей фильтрации и кр/лкокаснтаСнок производстве ссЕороток і.ооеп раз-.тігї-огї зкцое Еизстних;
исслелоьать возможность улучшения качества сі-:во;отки и гг-лать рєкокєісліцип для опктно-прснызленнсй реализации;
изучить 203!!о*:-:ость получения лкн-Іи крупного рогатого скота л ее использования для культивирования клеточпш: культур;
изучить ікзико-гінкическпе, С>по:-:икические и Оиологичес-jis СЕсйзтлг сзсьороток различных видов животных к Быорать осьолчіке критерии сценки качества готоаш: препаратов;
изучить вознозсн&сть лрименешш сивороток крови различ-нкг гклов жлстгплс для культивирования широкого спектра клеточных линий, гисркгом и вирусов.
Еауч.чая ксьпзкз работа. Выявлено влияние различных іактосов 'условия заСсра крови, Еремя отстаивания, метод отселения кгеточнкг элементов, испэльзогание различных филь-тру>-.п-:ї материалов) на качество готовых препаратов сывороток
КР02Й.
Показана возможность отделения клеточш-rz з«т;г-:нтс-в кро-ьк с нзпользсйзкием eoultz еилсь оборуЕозаккя:' гглосг.'орзкггого Інлі-трац-.іСїщс-го нолулк Vi'K-1,5 к ч-пльтр-пресса "Ориоь'-.
Изучена еозиохзоїть ксдо-гг.зсйы-п'а широкого c.f:..игра c~t>-чест"_^гу;сх іп-і-'::.-;-—::с иатерпалоз и осор/дсьлчня лил стер:;-
лизации скзоротки кроен, выбраны наиболее перспективные из них.
Установлен ;.лд фильтру змости сыэороток кгсги различных зкдсз животных.
Разработана крупнсмасзтасная технология получения улучшенного качества сывороток крози К"С и свиней путем счистки их с пенсов пояпэтиденглнксля (ПЭГ) с доследующей - сераппей " 2амораки;ачзя -оттаизания".
Проведен сравнительный анализ свойств сыэороток кос?:: различных еияоз жизотных (плодов корсгы, плодов osira, новорожденных телят, телят северных оленей, крупного рогатого скота, свиней, сезеркігх оленей, суягных озец, лошадей, морских свикок, К?С, обработанной ПЭГ, сзнней, обработанной ПЭГ) по Физико-хиническкм (рН, осмотическое давление, прозрачность, аннокиспотный и ионный состав) и биохимически» (гемоглобин, сбпплн белок, Фракционный состав бедкоз, зшрны' кислоты, а- и 0-липопротеияы) показателям для обоснозг.гля критериез, характеризующих готовые препараты.
Изучена возможность применения сывороток крсзи различных зидоз животных для культивирования широкого спектра клеточных линий (млекопитающих и насекомых), гибридом я еируссз выявлены наиболее эффективные из них.
Показана еозиожность получения и применения лим^ы гСР для культивирования перевиваемых клеточных линий.
Практическая- ценность заботы заключается 2 следуг-се.ч:
Полученные экспериментальные данные поло-'ч: з сы:оп/ ояктио-прсмниленкой технологи;! производства и контроля качества широкого ассортимента сызсс'оток крози различных з'.'-дсз животных.
Разработан опитно-промыплеяг.ый регламент на прсизеол;-тво сыворотки крови пледов корезн, определены оснезные показатели качества готозого препарата, разработаны изн-.:;-нйя к Фармакопейной статье (ОС 42-ГЕС-35}, которые ;<"Г2ерг;д;-ны з фармакопейном комитете, организовано спытнэ-промпглез-ное производство данной екзоэотки, а технология получение полуфабриката сиворотки крози ялсдоз корсЕЫ внедрена на Новосибирском, Омской, Челябинском, Курганское, Луип?.:-!нск:.ч, Сзердяозсксм, Абаканском я Тамэнскс.ч мясокомбинатам.
Разработан спытко-премьлпленный регламент и проекты s.p* -менкнз фармакопейных статей на сыззротку крони У.ТС л :дннел
- A -
организовано опьгтео-прокиелєкзоє производство,а технология получения полуфабриката сызоротки kposk KFC и свиней внедрена на Новосибирском мясокомбинате.
- Разработаны проекти нормативно-технической документации на производство к контроль качества сывороток крови различные видов животных (севернш оленей, плодов овец, суягных овец, посадей, свиней,обработанных ПЭГ, северных оленей, обработанных ПЭГ, суягных овец, обработанные ПЭГ, КРС, обработанных ПЭГ) и оргаш:зованс*опытйо-прскыЕленнс>е производство, ".. ~ .," :. что позволяет проводить поставки этих сывороток как подразделениям НПО "Вектор", так к сторонник орга-Еизапияк.
Готовые препарати сывороток крови различных видов животных, производимые з НПО "Вектор", широко используют в культивировании клеточных культур и supycob для выполнения KZ? и ОКР, предусматривающих разработку и получение вакцинных и диагкосткчеккх препаратов (тест-систекы ШЧ, гепатита А и В и др.), гибркдомнои технологии, а также производстве других биологически активных веществ как на собственной базе, так и другими учреждениями страны (более 90 потребителей) .
Отечественные биг.ьтрук-сие материалы, которые внедрены в собственную практику, могут быть рекомендованы для предварительной СЧИСТКИ И СТерИЛИЭУЮЧеЙ {ЖЛЬТрацИИ ЛЮбЫХ ВИДОВ сывороток крови человека и животных, а также химически определенных питательных сред, представляющих интерес для биотехнологии.
Апробация работы. Натериалы исследований по теме диссертации долоаеяы на отраслевом сетшаре "Питательные среды для культивирования культур клеток" (Новосибирск, ВНИИ КЗ, 8 -11 сентября 19В6 г.), на t-ой научной конференции НПО "Зек-тор" (Новосибирск,"-3 декабре 1986 г.), на рабочем совещании по пробдекак разработки и применения мембранного оборудования ъ биотехнологии (Ккриси, 16-18 іевраля 1S88 г.), на Всесоюзной конференции "Биологические и биотехнологические проблемы создания вирусных препаратов для защиты растений" (Новосибирск, сентябрь (2S9 г.), ка отрзелевок семинаре 'Технология получения биопрепаратов" (Новосибирск, декабрь 1939 г.), на 3 Зсесокзнон севе-алии "Культивирование клеток жиготных к человека" (Пувдно, 13-15 февраля 1990 г.), г.г-
Всесоюзной конференции "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии" (Махачкала, май (990 г.), на Всесоюзном совещании "Молекулярная биология ДНК-содержащих вирусов, имеющих практическое значение для сельского хозяйства и медицины", Киев, 9-11 октября 1990 г.
Публикации. По материалам диссертапиии опубликовано 12 работ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на /5 страницах машинописного текста и состоит из введения, одно* главы обзора литературы, главы "Материалы и методы", девяти глав собственных исследований, заключения и выводов.
Работа иллюстрирована 35 таблицами и 9 рисунками. Библиографический указатель содержит 304 источника советских и зарубежных авторов.