Введение к работе
І. Актуальность темы.
Трансплантация ядер, как часть экспериментальной микрохирургии клеток, используется при исследовании основополагающих вопросов биологии развития. Среди них - репрограммирование генома, сохранение тотипотентности ядер, геномный импринтинг и др. Разработка условий для полноценного репрограммирования ядер поздней морулы в цитоплазме зрелых ооцитов позволяет решить такую насущную задачу как увеличение числа эмбрионов от элитных животных. Число таких эмбрионов можно еще увеличить методом реклонирования (Stice, 1989). В настоящее время в мире получено от 1000 до 2000 животных с использованием метода трансплантации ядер эмбриональных клеток (Wolf et al., 1998).
Использование клеточных культур для получения клеток-доноров ядер позволяет решить два основных вопроса - получение большого количества клеток с одинаковым генотипом и трансфецированных клеток с известным уровнем экспрессии. Разработка метода культивирования клеток внутренней клеточной массы бластоцисты (Doetschman et al., 1988; Notarianni et al., 1991; Saito et al., 1992; Graves, Moreadith, 1993) была первым шагом в использовании клеточных культур для получения клонированных животных. Однако практическое использование трансфецированных клеток стало возможно после того, как была доказана возможность полноценного репрограммирования ядер фетальных фибробластов. Использование культуры трансгенных фетальных фибробластов положило начало новому методу получения трансгенных животных (Schnieke et al., 1997; Robl, 1998; Cibelli et al., 1998), который по оценке специалистов (Schnieke et al., 1997) требует вдвое меньше животных для получения одного трансгенного животного по сравнению с рутинным методом инъекции генной конструкции в пронуклеус зиготы.
Доказательство тотипотентности ядер некоторых
дифференцированных клеток взрослого организма (Wilmut et al., 1997; Wakayama et al., 1998) позволило вплотную подойти к решению вопроса спасения вымирающих видов животных и получения клонов сельскохозяйственных животных с высокой продуктивностью.
Мы предположили, что по аналогии с другими животными ооциты кролика должны репрограммировать как ядра эмбрионов, так и ядра дифференцированных клеток. Оценке способности зрелых ооцитов кролика репрограммировать ядра бластомеров морулы, фетальных фибробластов и фибробластов взрослого животного и посвящена настоящая работа.
Цель работы.
Изучение способности зрелой энуклеированной яйцеклетки репрограммировать ядерный материал недифференцированных клеток (бластомеров морулы) и дифференцированных клеток (фетальных фибробластов, фибробластов молодого и взрослого животного), изучение полноценности репрограммирования ядерного материала.
Задачи исследования.
1. Исследование способности к развитию эмбрионов с
трансплантированными ядрами бластомеров морулы и фибробластов
различного происхождения
-
Изучение эффективности энуклеации ооцитов и способности к развитию неэнуклеированных ооцитов с трансплантированными ядрами фетальных фибробластов.
-
Изучение факторов, влияющих на способность оопластов к слиянию с клетками - донорами ядер.
4.Исследование зависимости активации ооцитов и реконструированных эмбрионов от возраста ооцита-реципиента.
5. Исследование влияния синхронизации клеточных циклов ооплазмы и донорского ядра на эффективность развития клонированных эмбрионов.
6. Исследование влияния возраста организма - донора клеток для трансплантации ядер на эффективность развития клонированных эмбрионов. '
Научная новизна и практическая значимость работы.
Показана способность ядер морулы, фетальных фибробластов и фибробластов животных разного возраста к репрограммированию в цитоплазме зрелых энуклеированных ооцитов и обеспечению развития клонированных эмбрионов вплоть до стадии бластоцисты. Обнаружена отрицательная корреляция между возрастом организма - донора клеток для трансплантации ядер и эффективностью развития клонированных эмбрионов до стадии бластоцисты. Подтверждена тотипотентностъ ядер морулы, их способность обеспечивать развитие клоїшроваиньїх эмбрионов вплоть до' рождения. Показана способность ядер фетальных фибробластов обеспечивать развитие клонированных эмбрионов вплоть до имплантации. Показано влияние синхронизации донорских ядер на GO и G1 стадиях клеточного цикла на эффективность развития клонированных эмбрионов. Разработан способ получения реконструированных эмбрионов с ядрами бластомеров морулы, синхронизированными на Gl-стадии клеточного цикла. Предложена "истощенная" среда для быстрой t (в течение 2 суток) синхронизации клеток на Go/Gl-стадии клеточного цикла. Обнаружено снижение эффективности слияния клеток-доноров ядер с ооцитами с увеличением возраста ооцитов и длительности сывороточного голодания фетальных фибробластов.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 25-ой ежегодной конференции Международного общества по трансплантации эмбрионов 10-12 января, ІСвебек, Канада и на 15-ой ежегодной конференции Европейского общества по трансплантации эмбрионов 10-11 сентября, Лион, Франция.
По материалам диссертации опубликовано 16 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка использованной литературы. Объем диссертации 146 страниц машинописи, включает 21 таблицу и 8 рисунков и 8 фотографий. Список литературы включает 191 источника, в том числе 177 на иностранных языках.