Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние десятилетия получили широкое развитие методы создания рекомбинантных ДНК, доставки ДНК в клетки млекопитающих in vitro и in vivo, а также методы исследования экспрессии введенных генов. Применение этих достижений делает возможным производство белков, имеющих большое значение для медицины и других потребностей человека. Получение таких белков в достаточных количествах является одной из важных задач биотехнологии. Развитие методов генной инженерии привело к созданию бактериальных систем экспрессии для получения требуемых белков. Однако в бактериальных системах не всегда удается осуществить или точно воспроизвести посттрансляционные модификации эукариоти-ческих белков. Эта проблема решается при использовании эука-риотических систем экспрессии, например - масштабного культивирования клеток млекопитающих. Недостатком эукариотиче-ских систем экспрессии является их низкая рентабельность, т.к. для культивирования требуются относительно большие затраты, а выход и концентрация белков невелики. Другое направление основано на создании трансгенных животных-биореакторов, способных продуцировать целевые белки и транспортировать их во внеклеточные жидкости организма.
В этой связи молочная железа млекопитающих представляется естественным биореактором для продукции рекомбинантных белков и секреции их с молоком. Молочная железа обладает огромным синтетическим потенциалом, так как исходно предназначена для синтеза и извлечения большого количества белка. Концепция молочной железы как биореактора потенциально имеет ряд преимуществ с точки зрения биотехнологии: получение натив-ных белков, большой выход, отсутствие токсичных примесей.
В качестве одного из путей введения трансгена для создания животных-биореакторов,, предлагается использование методов трансфекции соматических клеток. Несмотря на то, что к настоящему времени разработано большое количество методов введения чужеродной ДНК, проблема эффективного транспорта ДНК in vivo остается нерешенной. В последнее время проводятся интен-
сивные исследования в области систем доставки ДНК в организм животных, в том числе - рецептор-опосредованной трансфекции. Рецептор-опосредованная доставка генетического материала сочетает использование естественного для клетки механизма рецептор-опосредованного транспорта и синтетических лигандирован-ных конструкций, что, в принципе, позволяет специфически трансфецировать любой выбранный тип клеток (Michael and Cu-riel, 1994; Guy et al. 1995). Данный метод обладает высоким потенциалом. Для внедрения метода в биотехнологию представляется важным дальнейшее исследование закономерностей и механизмов и оптимизация рецептор-опосредованной трансфекции для работы in vivo.
На основании имеющейся на сегодня совокупности данных нами была предложена идея создания животного-биореактора путем рецептор-опосредованной трансфекции молочной железы. В развитие этой идеи и выполнялась данная работа.
Цель и задачи исследования: Целью настоящей работы было изучение возможности использования рецептор-, опосредованной доставки генетического материала в клетки эпителия молочных желез для получения целевых белков с молоком сельскохозяйственных животных.
Для реализации указанной цели были поставлены следующие практические задачи:
-
Исследовать рецептор-опосредованный эндоцитоз и внутриклеточный транспорт конъюгата инсулин-полилизин и ДНК-переносящих конструкций, содержащих данный конъюгат, в клетках эпителия молочной железы в культуре.
-
Исследовать и оптимизировать состав и свойства ДНК-переносящих конструкций для получения наибольшего уровня трансфекции клеток в культуре.
-
Осуществить рецептор-опосредованную доставку репор-терного гена в клетки эпителия молочной железы in vivo.
-
Оценить возможность рецептор-опосредованной доставки гена, кодирующего секретируемый с молоком белок, в клетки эпителия молочной железы in vivo.
Научная новизна и практическая значимость работы. В
данной работе впервые осуществлена рецептор-опосредованная трансфекция молочной железы путем локального введения ДНК-переносящих конструкций, в результате чего получена секреция с молоком продукта экспрессии введенного гена. Предложенный нами способ создания животных-биореакторов в перспективе может быть использован для получения целевых белков с молоком сельскохозяйственных животных.
Впервые исследованы мембранолитические свойства ДНК-переносящих конструкций с эндосомолитическим компонентом. Установлена связь литических свойств аденовирусов в составе конструкций с эффективностью экспрессии репортерного гена в результате трансфекции данными конструкциями.
В результате экспериментов по оптимизации содержащих вирус конструкций получено увеличение экспрессии репортерного гена в культуре более чем в 10 раз, при понижении концентрации доставляемой ДНК также приблизительно на порядок.
Получены результаты по сравнительной эффективности метода при трансфекции клеток эпителия молочной железы in vitro и in vivo.
Представленные результаты могут быть использованы для разработки эффективных систем получения животных-биореакторов.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", выводов и списка литературы, включающего 202 библиографические ссылки. Работа изложена на 100 машинописных страницах, содержит 7 таблиц и 26 рисунков.