Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 6
1.1 Использование L-триптофана в кормовых целях 6
1.1.1. L-триптофан как кормовая добавка 6
1.2. Актуальность проблемы сбалансированного питания 9
1.2.1. Химическая характеристика и функции триптофана в организме человека. Применение его в медицине и фармакологии
1.3. Пути биосинтеза ароматических соединений у 19 Bacillus subtilis
1.4. Цитоморфологические исследования Bacillus subtilis 34
1.5. Состояние исследований в области создания технологии производства триптофана
1.6. Цели и задачи исследования 51
2. Материалы и методы 53
2.1. Краткая характеристика штамма Bacillus subtilis ВНИИгенетика-15
2.2. Оптимизация питательной среды
2.2.1. Источники углерода 59
2.2.2. Ростовые вещества и источники азота
2.3. Цитоморфологические исследования 61
2.4. Изучение динамики роста и биосинтеза 62
2.5. Опытно-промышленная проверка 63
3. Определение оптимальных условий культивирования
3.1. Выбор источника углерода 64
3.2. Выбор источника азота 71
3.3. Изучение влияния различных ростовых факторов на рост продуцента и биосинтез триптофана
3.4. Влияние условий культивирования на морфологию клеток штамма-продуцента и связь ее с интенсивностью роста и продуктивностью
3.4.1. Исследование морфологии культуры Bacillus subtilis в регламентных условиях культивирования
3.4.2. Исследование морфологии культуры Bacillus subtilis в измененных условиях культивирования
4. Изучение динамики роста и биосинтеза 100
4.1. Модель роста 103
4.2. Выбор адекватной модели биосинтеза 108
4.3. Выбор адекватной модели потребления 110 источника углерода
4.4 Выбор адекватной модели потребления кислорода 111
5. Разработка технологии биосинтеза 114
5.1. Определение требований к культуральной жидкости и формулирование критерия оптимальности
5.2. Определение параметров полупериодического процесса
5.3. Определение параметров отъемно-доливного процесса
5.4. Опытно-промышленная проверка разработанной технологии
5.5. Расчет оптимального полупериодического процесса
6. Выводы 1
Библиографическое описание
- Актуальность проблемы сбалансированного питания
- Оптимизация питательной среды
- Изучение влияния различных ростовых факторов на рост продуцента и биосинтез триптофана
- Определение параметров полупериодического процесса
Введение к работе
Актуальность проблемы. L-тріпгтофан - незаменимая для человека и животных аминокислота, играет существенную роль в обмене веществ живых организмов. Недостаток его приводит к различным заболеваниям: рак, диабет, туберкулез, пеллагра, различные заболевания нервной системы, у животных снижаются привесы, развивается анемия.
L-триптофан применяется в медицинской практике в составе кровезаменителей, для лечения умственно отсталых детей, как транквилизатор; в качестве пищевых добавок (в составе аминокислотных смесей) для спортсменов в период тренировок; в сельском хозяйстве для балансировки кормов с целью повышения привесов.
Учитывая, что потребность нашей страны в медицинском L-триптофане около 50 т/год, а в кормовом- около 200 т/год создание технологии биосинтеза L-триптофана представляется актуальным.
Цель работы. Разработка и совершенствование технологии биосинтеза L-тршттофана, позволяющей наладить промышленное проюводст-во и максимально снизить себестоимость конечного продукта, включает в себя: изучение динамики, стехиометрии, путей биосинтеза, подбор оптимальных условий культивирования (оптимизация состава питательной среды), изучение влияния условий культивирования на морфологшо клеток штамма-продуцента L-триптофана Bacillus subtilis ВНИИгенетнка-15; подбор адекватной модели роста, биосинтеза, потребления редуцирующих веществ и кислорода; разработка технологии биосинтеза (определение параметров периодического, полупериодического, отьемно-доливного процессов биосинтеза); опытно-промышленное опробование разработанной технологии.
Научная новизна. Дня штамма Bacillus subdlis ВНИИгенетнка-15 впервые определены морфометрические характеристики и влияние на них условий культивирования,
показано, что даже кратковременное нахождение клеток продуцента в лимите по кислороду ведет к их значительному лизису,
установлено, что источником ростового фактора при биосинтезе триптофана является кукурузный экстракт,
подобрана и проверена на адекватность математическая модель биосинтеза триптофана, учитывающая рост, биосинтез и потреблешіе редуцирующих веществ и кислорода
Впервые разработана и опробована в опытно-промышленных условиях технология биосинтеза L-триптофана на штамме-продуценте Bacil-
lus subtilis ВНИИгенетика-15, подобрана адекватная математическая модель роста, биосинтеза и потребления субстрата, проведена работа по определению влияния условий культивирования на морфометрические характеристики клеток продуцента.
Практическая ценность. Разработанная технология позволяет организовать в нашей стране производство кристаллического кормового и медицинского L-триптофана микробиологическим способом на простых минеральных средах с конкурентоспособной себестоимостью по сравнению с зарубежными аналогами. Проведено успешное опьггно-промышлешюс опробовашіе разработанной технологии на различных заводах СССР.
Апробация. Результаты работы докладывались на четырех научных конференциях.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 статьи, получено 2 авторских свидетельства, результаты были опубликованы в материалах четырех научных конференций.
Структура и объем работы. Работа состоит из введения и 5-ти глав, библиографического описания (147 наименований) и изложена на 156 стр. машинописного текста.
В первой главе показана актуальность работы, сделан аналитический обзор публикаций на тему работы и представлены основные положения, выносимые на защиту.
Вторая глава и третья глава содержат экспериментальную часть работы, в которой подбираются оптимальные компоненты питательной среды, и проводится морфометрический анализ влияния условий культивирования на клетки продуцента.
Четвертая и пятая главы посвящены подбору адекватных моделей роста, биосшггеза, потребления редуцирующих веществ и кислорода; в ней изложены основные принципы разработки технологии биосинтеза L-триптофана, сравнительные характеристики полупериодического и отьем-но-доливного способов ведения процесса биосинтеза, осуществлен расчет оптимальных условий проведения технологического процесса, представлены результаты опытно-промышленного опробования разработанной технологии.
Актуальность проблемы сбалансированного питания
Исключение из пищи всех аминокислот приводит к обеднению организма белком, что сопровождается потерей веса, анемией, общей атрофией мышц. При этом организм становится более восприимчивым к инфекциям и хуже переносит травмы и заболевания. С появлением очищенных рационов из аминокислот стало возможным исследовать изменения, возникающие при исключении одной незаменимой аминокислоты из состава рациона, полноценного в других отношениях. В опытах на животных, лишенных какой-либо одной незаменимой аминокислоты, наиболее отчетливо проявляется потеря аппетита; потребление пищи резко снижается уже после первого дня, что сопровождается немедленным отрицательным балансом азота. (Считается, что субъект находится в азотистом равновесии, когда количество азота, принятого с пищей, равно количеству азота, выводящемуся из организма. Если количество принятого азота больше, то имеет место положительный азотистый баланс, в противном случае - отрицательный) [9].
Так, у животных недостаточность L-триптофана вызывает помутнение роговицы, катаракту, выпадение шерсти, анемию, поражение зубов. У цыплят при недостаточности L-триптофана возникает повышение потребности в никотиновой кислоте. К числу процессов обмена L-триптофана в организме человека относятся превращения L-триптофана в никотиновую кислоту через кинуренин и окисление и декарбоксилирование L-триптофана с образованием 5-окситриптамина (серотонина). В нормальных условиях на долю каждого из этих процессов приходится лишь несколько процентов всего подвергающегося превращению в организме L-триптофана.
У больных с далеко зашедшим злокачественным карциноидом обмен L-триптофана протекает преимущественно по пути превращения его в серотонин, что приводит к снижению синтеза никотиновой кислоты и развитию белковой недостаточности.
Лимитирующей в синтезе серотонина является стадия, катализируемая триптофангидроксилазой. Блокирование синтеза его или разрушение этой области приводит к нарушению сна или непрерывному бодрствованию.
Подобно тому, как L-метионин тесно связан в обмене с витамином Bi2, L-триптофан связан с никотиновой кислотой. Установлено, что никотиновая кислота образуется в организме из L-триптофана, но с весьма неблагоприятным коэффициентом - на образование одной части никотиновой кислоты затрачивается 50-60 частей L-триптофана. Введение никотиновой кислоты прекращает расходование L-триптофана на ее образование [14].
Отсутствие L-триптофана в пище человека и животных ведет к тяжелым нарушениям типа авитаминоза (пеллагра, характерные симптомы которой - дерматиты на открытых участках кожи лица, шеи, нарушения деятельности желудочно-кишечного тракта и нервной системы, дерматит, диарея, дименеция), что связано с пониженным обменом в направлении никотиновой кислоты[13].
Показано, что исключением L-триптофана из пищи можно вызвать пеллагру, а добавлением L-триптофана пеллагра излечивается. Недостаток белка в пище создает условия для быстрого образования витаминной недостаточности (белки - это якорь, удерживающий витамины).
Витамин В6 - пиридоксальфосфат - как кофермент принимает участие в синтезе всех аминокислот и также в обмене L-триптофана. В результате окислительного распада L-триптофана образуются аминокислоты - кинуренин и 3-оксикинуренин. Под влиянием фермента кинуреазы кинуренин гидролизуется на аланин и антраниловую кислоту. Подобным же образом 3-оксикинуренин превращается в 3-оксиантраниловую кислоту - предшественник никотиновой кислоты. Незначительная часть L-триптофана путем окисления, а затем и декарбоксилирования превращается в серото-нин (5-окситриптамин), концентрирующийся в значительных количествах в нервной системе.
Витамин Вб у человека и млекопитающих вступает в действие в стадии образования кинуренина, осуществляет его расщепление.
Существует и другой путь обмена L-триптофана, состоящий в том, что при содействии аминоферазы из кинуренина образуется кинуреновая и ксантуреновая кислоты.
В случае недостатка витамина Вб наблюдается повышенное образование как кинуренина, так и ксантуреновой кислоты с их выделением из организма в большом количестве. При определении содержания пиридоксина в моче после приема 1 г витамина Вб и ксантуреновой кислоты после приема 10 г L-триптофана выяснилось, что приблизительно половина из 144 больных диабетом страдают недостатком витамина Вб в организме. Установлено, что витамин Вб усиливает эффект при лечении диабета инсулином. Под влиянием Вб удалось уменьшить дозу инсулина.
Производные L-триптофана, образующиеся в процессе его деградации в организме, занимают одно из центральных мест среди причин возникновения диабета. К ним относится хинальдиновая и 8-оксихинальдиновая кислоты. Их образование происходит нефер-ментативно из соответственно кинуреновой и ксантуреновой кислот. Предполагается, что механизм их диабетогенного действия двоякий: ингибирование синтеза проинсулина рибосомами эндо-плазматической сети р-клеток и инактивация инсулина путем связывания и выведения цинка.
Полученные данные подтверждают значение витамина В6 для физиологического обмена L-триптофана как фактора, обеспечивающего завершение полного цикла превращений данной аминокислоты. Это, в свою очередь, обеспечивает образование никотиновой кислоты (витамин РР) и серотонина [15].
При исключении L-триптофана из пищи уменьшается его содержание в плазме крови и снижается накопление витамина А, интенсивность обмена L-триптофана. Наблюдается дегенерация гладких и поперечно-полосатых мышц и повреждения миокарда.
Регуляторные функции L-триптофана выявляются при изучении физиологических и фармакологических влияний на функциональное состояние организма. Так недостаточность L-триптофана или исключение его из пищи даже на непродолжительное время приводит к понижению содержания белков в сыворотке крови и органах [14].
Ряд исследователей изучал действие предшественника серотонина - 5-окситриптофана на мозг животного. Известно, что недостаток серотонина в мозгу вызывает шизофрению. Сам серотонин не обладает способностью проникать из крови в мозг, поэтому его введение неэффективно. Однако периодическое введение 5-окситриптофана в кровь животного заметно увеличивает содержание серотонина в мозгу. Появились патенты на использование 5-окси-L и 5-oкcи-DL-тpиптoфaнa для лечения нарушений мозга, регулирования кровяного давления и в качестве антидепрессантов. Созданы также композиции, полезные для лечения депрессий, содержащие L-триптофан и 5-окситриптофан, триптофан лития или
Оптимизация питательной среды
Микробиологический способ производства аминокислот дает возможность получения биологически активных L-изомеров на основе дешевого и доступного сырья.
Вас. subtilis является традиционно используемым в микробиологической и пищевой промышленности микроорганизмом, хорошо изучен с молекулярно-биологической, генетической, биохимической и физиологической точек зрения. В частности, тщательно исследован путь биосинтеза ароматических аминокислот и его основные регуляторные механизмы у этого микроорганизма.
Вас. subtilis безопасны с точки зрения экологических требований, имеют статус GRAS (generally regarded as safe), что является необходимым условием для применения бактерий в производстве продуктов, потребляемым человеком. Все это делает Вас. subtilis перспективным объектом.
Способность микроорганизмов к сверхсинтезу аминокислот вызывается главным образом нарушениями регуляции синтеза активности ферментов, катализирующих биосинтез данной аминокислоты, а также генетическим блокированием синтеза метаболита, являющегося в системе контроля этой аминокислоты ингибитором или корепрессором, или блокированием боковых ветвей биосинтеза для предотвращения расхода обоих предшественников. Амплификация генов, кодирующих ключевые ферменты биосинтеза аминокислоты, позволяет обнаруживать и устранять «узкие места» в пути биосинтеза, увеличивая тем самым уровень сверхсинтеза аминокислоты [18].
Штаммы-продуценты L-триптофана впервые были получены в Японии, где и было организовано первое крупное микробиологическое производство L-триптофана.
При создании штаммов-продуцентов L-триптофана большую роль сыграло изучение путей метаболизма, ведущих к биосинтезу триптофана, и их регуляция у различных групп микроорганизмов.
В результате этой работы было установлено, что пути биосинтеза ароматических аминокислот у разных таксономических групп микроорганизмов весьма схожи, хотя и различаются по регуляции, Оказалось, в частности, что в некоторых деталях регуляция процессов биосинтеза у Вас. subtilis проще.
Селекция активных штаммов-продуцентов L-триптофана проводилась в двух направлениях.
Первое направление базировалось на использовании в качестве источника углерода достаточно близких предшественников L-триптофана - антраниловой кислоты и индола. Оба эти соединения токсичны и поэтому требуется высокая степень очистки готового продукта, что повышает его стоимость и ограничивает широкое применение в качестве кормовой добавки.
Во второй группе исследований использовали в качестве источника углерода дешевые углеводы (сахарозу, глюкозу и т.д.). При этом оказалось, что наилучшие результаты дают мутанты, ведущие свое происхождение от различных штаммов Вас. subtilis. В результате проделанной во ВНИИгенетика работы Н.И. Ждановой и Г.А. Великжаниной; удалось получить группу штаммов, выделяющих в среду при периодическом культивировании 6-8 г/л От исходного штамма Вас. subtilis 168 с использованием методов генной инженерии был получен штамм 37, который продуцировал до 4,5 г/л L-триптофана на среде с 10% сахара [135].
От штамма 37 прямым отбором по признаку продуктивности был получен штамм Ген-3557 методом ступенчатой селекции, включающей обработку клеточной суспензии мутагенным фактором ІЧ-метил-М-нитрозо-ІЧ-гуанидином (концентрация 200 мг/мл, экспозиция 20 минут) и получение мутантов, резистентных к структурным аналогам аминокислот продуцирующий L-триптофан в количестве 6-7 г/л [129]. На первой ступени отбора, обработанные мутагеном клетки штамма Ген-3557 были высеяны на минимальную среду, содержащую аналог L-гистидина l-L-метилгистидин в концентрации 5 мг/мл.
Среди выросших резистентных колоний был отобран штамм 924, клетки которого после воздействия мутагеном были высеяны на среду, содержащую следующую смесь аналогов L-триптофана, L-фенилаланина, L-тирозина: 5-фтортриптофан (2мг/мл), фенилала-нингидроксамат (0,5 мг/мл) и тирозингидроксамат (2,5 мг/мл). Из числа колоний, резистентных к указанной смеси аминокислот, был отобран штамм 22-13. Клетки штамма 22-13 были снова обработаны мутагеном и высеяны на среду, содержащую смесь тех же аналогов аминокислот, но в концентрации 2,5 мг/мл, 0,5 мг/мл, 2,5 мг/мл соответственно. Из числа колоний, резистентных к указанной смеси аналогов, был выделен штамм ВНИИгенетика-15 [132].
Штамм ВНИИгенетика-15 хранится в Центральном музее промышленных микроорганизмов института «ВНИИгенетика», где он депонирован под номером ЦМП-В-2306. Штамм Вас. subtilis ВНИИгенетика-15 имеет следующую культурно-морфологическую характеристику.
Грамположительная спорообразующая палочка. Колонии на мясо-пептонном агаре после 24 часов инкубации при 37С достигают 4-5 мм в диаметре, сплошные, круглые, с изрезанным краем, по 5 6 верхность гладкая, со слабой, радиальной по краю и концентрической в центре исчерченностью, цвет - серовато-белый. Посев штрихом на мясо-пептонном агаре после 24 часов инкубации при 37С дает умеренный рост, штрих - широкий с мелкозубчатым краем, запах характерный, консистенция - маслянистая, цвет - серовато-белый. Рост на мясо-пептонном бульоне после 1 суток инкубации при 37С характеризуется умеренным помутнением среды без образования пленки, запах - характерный, осадок - скудный, тягучий при встряхивании.
На агаризованной минеральной среде Спицайзена с глюкозой после 3-х суток инкубации при 37С колонии достигают 1,5-2,0 мм в диаметре, сплошные, круглые, с гладкой, блестящей поверхностью, грязно-белого цвета, структура однородная [18].
Изучение влияния различных ростовых факторов на рост продуцента и биосинтез триптофана
Необходимость очистки кукурузного экстракта обусловлена разработанной в последнее время новой схемой выделения L-триптофана, которая отличается от выданной ранее в регламентах ВНИИгенетика. В ней стадия ионного обмена заменена на ультрафильтрацию с целью упрощения процесса получения кристаллических препаратов L-триптофана. В связи с этим повышаются требования к качеству исходного сырья для биосинтеза. В ГУП «Гос-НИИсинтезбелок» был опробован способ очистки кукурузного экстракта (гидролиз с 3% соляной кислотой в течение 1 часа при 100С). Выход L-триптофана при ферментации на очищенном кукурузном экстракте повысился на 15%. Проведенные опыты показали возможность использования в составе питательной среды для биосинтеза L-триптофана также и таких источников ростовых веществ как ферментолизат БВК (1% по твердым веществам), дрожжевой БВК (2-3%). Использование этих компонентов в составе посевной питательной среды приводит к сокращению времени роста, увеличению концентрации биомассы, стабилизации качества посевного материала.
Разработанная технология биосинтеза L-триптофана на гидро-лизате крахмала зерна (в качестве источника углерода) позволяет использовать воду после замачивания зерна (замочную воду) в количестве 30-35% по объёму в качестве источника ростовых факторов вместо кукурузного экстракта. При этом выход конечного продукта повышается на 10%. КЖ содержит меньше пигментов, что упрощает процесс очистки. Поскольку содержание сухих веществ в замочной воде не превышает 3%, её использование в неупаренном виде нерационально из-за невозможности хранения в течение более чем нескольких часов. Поэтому при включении в технологию необходимо предусматривать её упаривание.
Кукурузный экстракт безусловно содержит в себе некий не-идентифицированный лимитирующий рост продуцента фактор. С целью его выявления мы исследовали влияние аминокислот, входящих в состав кукурузного экстракта.
Кукурузный экстракт представляет собой упаренную жидкость, которая остается после вымачивания кукурузных зерен при производстве кукурузного крахмала. Для уменьшения процессов брожения и разрушения гликопротеидных комплексов зерна кукурузы в процессе замачивания водно-зерновую суспензию насыщают сернистым газом. В табл. 3.7. представлен состав аминокислот, содержащихся в кукурузном экстракте[141]. Таблица 3.7. Аминокислотный состав кукурузного экстракта
С учетом данных, приведенных в таблице 3.7. был поставлен методом случайного баланса [24] эксперимент по выявлению и ранжированию влиянию аминокислот. В качестве нулевого варианта использовали питательную среду с содержанием кукурузного экстракта 25 г/л. Опытные варианты на нижнем уровне содержат 15 г/л кукурузного экстракта. Таким образом, добавка аминокислот в количестве, содержащемся в 20 г/л кукурузного экстракта даст верхний уровень (таблица 3.8.). Таблица 3.8. Добавки аминокислот в кукурузный экстракт в эксперименте с применением метода случайного баланса.
Сравнение результатов, приведенных в таблице 3.10., с результатами, полученными в аналогичном исследовании штамміа Bac.subt. 3557 [27], показывает, что при совпадении влияния большинства аминокислот, имеется одно важное отличие - L-треонин оказывает не отрицательное, а сильное положительное влияние н!а биосинтез L-триптофана. Это указывает, прежде всего, на то, что в процессе селекции были произведены существенные изменения в процессах метаболизма по сравнению с типичными для Вас. subtilis процессами. Можно попытаться объяснить этот эффект тем, что повышенные концентрации L-треонина ингибируют аспартилкиназу и блокируют, таким образом синтез L-гомосерина и, следовательно, L-метионина, который ингибирует биосинтез L-триптофана. Здесь будет уместно отметить, что при биосинтезе лизина для ряда продуцентов в качестве источника дефицитной аминокислоты - L-треонина - используется кукурузный экстракт и гидролизаты природных белоксодержащих материалов. Присутствие L-аргинина среди положительно влияющих аминокислот подтверждает высказанную ранее гипотезу о роли мочевины в биосинтезе L-триптофана.
Итак, кукурузный экстракт - основной источник ростовых факторов (возможно, и L- треонина) в составе питательной среды для биосинтеза L-триптофана. Помимо этого штамм Вас. subtilis ВНИИгенетика-15 способен утилизировать широкий спектр источников аминного азота. Далее, с целью выявления возможного ингибирования биосинтеза продуктом мы изучали влияние различных концентраций L-триптофана, внесенного в исходную питательную среду на процесс биосинтеза. Полученные результаты приводятся в таблице 3.11.
Определение параметров полупериодического процесса
При разработке технологии биосинтеза L-триптофана необходимо учитывать способ выделения и очистки конечного продукта. Оба указанных этапа процесса получения L-триптофана при усовершенствовании технологии претерпели существенные изменения. Прежняя технология выделения L-триптофана, включающая стадию ионного обмена, позволяла использовать КЖ практически любого состава (содержащую пигменты, остаточные РВ, низкое содержание L-триптофана, лизированные клетки, инфицирование). В усовершенствованной технологии выделения и очистки ионный обмен заменен на ультрафильтрацию и переосаждение с изменением рН. Преимущества новой технологии (повышение выхода конечного продукта, более высокая очистка, упрощение схемы выделения, снижение объемов промышленных стоков, а также времени, затрачиваемого на выделение) оправдывают повышенные требования к качеству КЖ: содержание остаточных РВ не более 5г/л, максимальное содержание L-триптофана, минимальное содержание пигментов, лизированных клеток.
Серьезной проблемой данного процесса биосинтеза L-триптофана является высокое содержание остаточных РВ 2,5-1,5%. Опробованы различные технологические приемы, позволяющие снизить этот показатель до 0,8-0,5%. Наиболее эффективным из них является выращивание культуры полупериодическим способом (подпитка по Ро2), позволяющим продлить логарифмическую фазу роста.
При осуществлении оптимизации процесса биосинтеза важно договориться о критерии оптимальности. Очевидно, что он меняется в зависимости от решаемой задачи и, при проектировании нового предприятия заданной мощности, он будет отличаться от критерия оптимальности при работе на уже установленном оборудовании.
В данной работе мы будем считать, что реакционный объем нам задан и следует максимизировать прибыль от выпускаемой продукции при ее фиксированной цене, не зависящей от объема производства.
Здесь необходимо упомянуть об одном ограничении: содержание сухих веществ в исходной питательной среде не может быть безграничным. Для большинства известных культур это не более 22-25%. Кроме того, при высоких концентрациях РВ наступает ин-гибирование. Поэтому, в частности, для биосинтеза триптофана So 150 г/л.
Уравнения (4.2), (4.7), (4.15) и (4.18) не предусматривают лимитирование процесса при исчерпывании источника углерода. Введение соответствующего сомножителя в эти уравнения резко усложнило бы обработку, потребовав использование громоздких вычислительных процедур.
Поэтому мы ограничились лишь фиксацией SK на уровне, при котором лимитирование не так уж и велико, а остаточная концентрация углеводов не создает затруднений при выделении целевого продукта. Такой уровень для процесса биосинтеза триптофана(5к) был принят равным 5г/л - это является основным требованием, предъявляемым к культуральной жидкости со стороны последующих стадий технологического процесса.
Существует ещё одно важное ограничение для процесса биосинтеза L-триптофана с использованием в качестве продуцента штамма Bac.subtilis. ВНИИгенетика-15. Как показали цитоморфологические исследования, даже кратковременное нахождение клеток продуцента при очень низких кон 117 центрациях растворенного кислорода приводит к их значительному лизису и, вызванному этим, снижению скорости биосинтеза. Нижней границей безопасного ведения процесса является концентрация як=0,15. Следует отметить, что, при выполнении указанных выше ограничений, к и S на динамику процесса биосинтеза практически не влияют.
Как было показано выше, среднестатистический периодический процесс биосинтеза L-триптофана включает в себя следующие три фазы роста (табл. З.1., рис. З.1.). 1. Лаг-фаза (6-8 час. роста) характеризуется закисле-нием рН до 6,4-6,2, слабым ростом ОП до 0,1-0,112 ед., снижением РВ (до 8,0-7,0%), снижением Рог (до 50-30% от насыщения). 2. Фаза логарифмического роста (8-20 час. роста) включает в себя постепенное повышение рН (до 7,4-7,6), увеличение ОП (до 0,3-0,33), потребление РВ (до 3,5-3,0%), при этом Ро2 проходит через 0% от насыщения (12-18 час. роста) и резко ( в течение 15 мин.) увеличивается до 40-50% (на 18-20 час. роста). 3. Фаза замедленного роста (26-36 час. роста) - продолжается защелачивание рН (до 8,0-8,5), возрастание ОП (до 0,37-0,35) и далее падение (до 0,3-0,32). Снижение РВ (до 2,5-2,0), возрастает Ро2 (до 70-90%).
С целью продления фазы логарифмического роста, что позволит повысить концентрацию конечного продукта, использовали дробную подачу свежей питательной!среды (подпитки). 18 Исследования были проведены в следующих направлениях: - определение оптимального состава подпитки. Оптимизацию проводили по плану полного факторного эксперимента [147]по основным компонентам питательной среды: сахар, кукурузный экстракт, мочевина. Изучали эффективность их совместного использования в различных соотношениях, а также эффективность их раздельной подачи в ферментер в процессе культивирования. - выбор параметра, позволяющего определить момент подачи подпитки. Рассматривали такие показатели как РВ, рН, Ро2, ЕН, а также С02 и 02 на выходе. Растворенный кислород (Ро2 - парциальное давление растворенного кислорода в- среде) - наиболее четкий и оперативный показатель, позволяющий с помощью датчика определить не только момент подачи подпитки (в течение 10-15 мин. после 0% от насыщения Ро2 увеличивается до 30-40%), но и объем (на подачу подпитки Ро2 откликается мгновенно - снижается до 0%). .
Процесс биосинтеза L-триптофана с подпиткой по датчику Ро2 позволил увеличить выход конечного продукта в среднем на 30% [132].
Далее во избежание лимитирования по кислороду в логарифмической фазе роста был разработан процесс с подпиткой и регулированием аэрации. Для этого перемешивание и расход воздуха увеличивали так, чтобы показатель датчика Ро2 не опускался ниже 5%. С помощью этого технологического приема удалось повысить концентрацию триптофана в конце ферментации на 20%, съем с единицы объема за счет увеличения количества подпитки, скорость и продуктивность биосинтеза [134].