Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
Агробактериальная трансформация растений в биотехнологии
Метод агробактериальной трансформации in vitro
Трансформация эксплантов
Трансформация листовых дисков
Трансформация корней Трансформация протопластов
Агробактериальная трансформация in planta
Факторы, влияющие на эффективность агробактериальной трансформации
Генетическая трансформация однодольных растений
Клетки-мишени генеративных тканей при агробактериальной трансформации in planta
Горизонтальный перенос ДНК с участием агробактерий
Экстраклеточные структуры агробактерий, участвующие в контакте с поверхностью клетки-реципиента
Полисахаридные структуры
Белковые структуры, принимающие участие в
агробактериальной трансформации Рикадгезин
Жгутики агробактерий Пили
Бактериальная система IV типа секреции (T4SS) Белки, участвующие в переносе субстрата T4SS Структура T4SS комплекса Перенос Т-ДНК через мембраны
Возможность переноса Т-ДНК через мембраны клетки-реципиента с помощью эндоцитоза Транспорт крупных молекул и частиц в клетку Эндоцитоз Типы эндоцитоза Участие в эндоцитозе малых ГТФ-связывающих белков 67
1.6 Перенос Т-комплекса в эукариотическую клетку 69
1.6.1 Взаимодействие VirD2 и VirЕ2 с эукариотическими белками-переносчиками 69
1.6.2 Роль белка VirE2 в процессе агробактериального переноса Т-ДНК 73
1.6.3 Трехмерная структура белка VirE2 80
1.7 Заключение по главе 83
Глава 2 Материалы и методы исследования 86
2.1 Реагенты 86
2.2 Бактерии
2.2.1 Штаммы, плазмиды E. coli 86
2.2.2 Штаммы, использованные для клонирования гена virE2 и выделения рекомбинантного белка VirE2 87
2.2.3 Штаммы A. tumefaciens 87
2.2.4 Схемы плазмид и области Т-ДНК используемых в работе бинарных векторов 88
2.2.5 Среды и условия для культивирования бактерий, буферные растворы 89
2.3 Молекулярно-генетические методы 90
2.3.1 Выделение плазмидной ДНК 90
2.3.2 Выделение тотальной ДНК растений 91
2.3.3 Клонирование гена virE2 92
2.3.4 Определение маркерных генов Т-ДНК методом ПЦР 92
2.3.5 Выявление присутствия агробактериальной ДНК в растительном материале 93
2.3.6 Рестрикция ДНК 94
2.3.7 Электрофорез ДНК 94
2.3.8 Электрофорез препаратов белка 95
2.3.9 Выделение и очистка рекомбинантного белка VirE2 95
2.3.10 Определение суммарного количества белка 2.4 Получение миниантител к белку VirE2 96
2.5 Метод иммунодота 96
2.6 Конъюгация фага М13 с ТРИТЦ 97
2.7 Определение способности белка VirE2 связываться с одноцепочечной ДНК 98
2.8 Получение оцДНК и формирование ДНК-белковых комплексов 98
2.8.1 Получение оцДНК для атомно-силовой микроскопии 98
2.8.2 Получение оцДНК для трансмиссионной электронной микроскопии 99
2.8.3 Получение оцДНК для метода динамического рассеяния света 99
2.8.4 Получение оцДНК для изучения переноса оцДНК в клетки HeLa и СПЭВ 100
2.8.5 Формирование ДНК-белковых комплексов для трансмиссионной электронной микроскопии
2.9 Определение размеров белков и комплекса оцДНК-VirE2 методом динамического рассеяния света 101
2.10 Растения
2.10.1 Обработка растений при проведении агробактериальной трансформации in planta 102
2.10.2 Выращивание растений, первичный отбор трансформантов 102
2.10.3 Количественное определение содержания свободного пролина в листьях кукурузы 103
2.10.4 Определение плоидности у проростков кукурузы 104
2.10.5 Гистохимический метод определения активности фермента -глюкуронидазы у проростков кукурузы и
сорго после проведения трансформации in planta 104
2.10.6 Агробактериальная трансформация пыльцы кукурузы 105
2.11 Клетки животных (СПЭВ) и человека (HeLa) 106
2.11.1 Выращивание клеток 106
2.11.2 Измерение флуоресценции 106
2.11.3 Обработка клеток ингибиторами 107
2.12 Микроскопия 107
2.12.1 Световая микроскопия 107
2.12.2 Трансмиссионная электронная микроскопия 108
2.12.3 Атомно-силовая микроскопия
2.13 Методы биоинформатики 109
2.14 Статистическая обработка данных 110
Глава 3 Результаты и их обсуждение 111
3.1 Изучение свойств и роли белка VirE2 в переносе
оцДНК 111
3.1.1 Клонирование гена, кодирующего белок VirE2 из
A. tumefaciens 112
3.1.2 Выделение рекомбинантного белка VirE2 113
3.1.3 Получение очищенного препарата белка VirE2 с помощью аффинной хроматографии 114
3.2 Изучение свойств рекомбинантного белка VirE2 116
3.2.1 Анализ способности белка VirE2 связываться с одноцепочечной ДНК и защищать ее от деградации нуклеазами 116
3.2.2 Анализ формирования Т-комплекса in vitro микроскопическими методами
3.2.2.1 Трансмиссионная электронная микроскопия Т-комплекса in vitro 119
3.2.2.2 Атомно-силовая микроскопия Т-комплекса in vitro
3.3 Измерение размеров комплексов, образованных оцДНК-VirE2, методом ДРС 125
3.4 Проверка активности белка VirE2 при заморозке-оттаивании 128
3.5 Получение миниантител к белку VirE2 131
3.5.1 Идентификация белка VirE2 с помощью антител 135
3.6 Исследование взаимодействия белка VirE2 с модельной липидной мембраной 137
3.7 Компьютерное моделирование комплексов, образованных двумя и четырьмя молекулами белка VirE2 в мембране 142
3.8 Эксперименты по переносу оцДНК с участием белка VirE2 и его комплексов через мембраны
3.8.1 Эксперименты по переносу олигонуклеотидов с участием белка VirE2 через мембраны животных клеток 152
3.8.2 Эксперименты по переносу оцДНК (200 н.о.) с участием белка VirE2 в клетки СПЭВ
3.9 Перенос Т-ДНК из A. tumefaciens в однодольные растения (кукуруза, сорго) при агробактериальной трансформации in planta 161
3.9.1 Перенос Т-ДНК из A. tumefaciens в кукурузу при агробактериальной трансформации in planta 163
3.9.1.1 Определение эффективности трансформации кукурузы через пестичные нити с использованием разных штаммов и линий кукурузы в поколениях T0 170
3.9.1.2 Определение эффективности трансформации кукурузы в поколении T1 175
3.9.1.3 Определение эффективности трансформации in planta с использованием конструкции с антисмысловой последовательностью фрагмента гена пролиндегидрогеназы 176
3.10 Агробактериальная трансформация сорго in planta 184
3.11 Анализ клеток-мишеней для встраивания агробактериальной Т-ДНК в женский и мужской гаметофиты кукурузы
3.11.1 Трансформация клеток женского гаметофита кукурузы в условиях in planta 194
3.11.2 Трансформация пыльцы кукурузы суспензией агробактерий in vitro 201
3.12 Перенос T-ДНК в неповрежденную растительную клетку 205
3.12.1 Перенос T-ДНК в неповрежденные проростки табака 205
3.12.2 Перенос T-ДНК в неповрежденные проростки риса и пшеницы 208
3.12.3 Агробактериальная трансформация неповрежденных проростков табака: возможное участие устьиц и цитоскелета 209
3.13 Изучение ядерно-локализованных
последовательностей белков VirE2 и VirD2 из
A. tumefaciens при переносе Т-ДНК через ядерные
поры эукариотических клеток 216
3.13.1 Поиск сайтов связывания с ДНК у белка VirE2 220
Заключение 222
Выводы 225
Список сокращений и условных
Обозначений 227
Список литературы
- Генетическая трансформация однодольных растений
- Штаммы, использованные для клонирования гена virE2 и выделения рекомбинантного белка VirE2
- Агробактериальная трансформация пыльцы кукурузы
- Определение эффективности трансформации in planta с использованием конструкции с антисмысловой последовательностью фрагмента гена пролиндегидрогеназы
Введение к работе
Актуальность исследований и состояние проблемы. Перенос Т-ДНК (transfer DNA) с помощью агробактерий в растительные клетки является востребованным на практике приемом биоинженерии, с помощью которого уже получены сельскохозяйственные растения, выращиваемые на сотнях миллионах гектаров. Почвенные бактерии рода Agrobacterium в условиях in vitro и in planta способны переносить фрагмент Ti (tumor inducing) и Ri (root hair inducing) плазмид – Т-ДНК в геном эукариотической клетки-хозяина (Christie, 1997). Знание о деталях переноса Т-ДНК агробактериями в эукариотические клетки является актуальным как с фундаментальной точки зрения, для понимания эволюции жизни и взаимоотношений про- и эукариотов, так и в практическом плане для создания растений, обладающих новыми хозяйственно-ценными признаками, и биомедицинских технологий (генотерапии).
Перенос Т-ДНК в растения относится к системам секреции IV типа. Многие детали молекулярно-генетического механизма переноса Т-ДНК из агробактерий в растительную клетку в настоящее время известны (Lessl, Lanka, 1996; Christie et al., 2005). Однако остается неясным: каким образом Т-ДНК попадает в растительную клетку после выхода из бактериальной клетки; как осуществляется перенос Т-ДНК через мембрану растительной клетки. Среди белков вирулентности, которые участвуют в транслокации Т-ДНК в растительную клетку, важную роль играет один из мажорных агробактериальных белков – VirE2, обладающий несколькими важными для этого процесса функциями, такими как: взаимодействие с одноцепочечной Т-ДНК, взаимодействие с искусственными мембранами, защита Т-ДНК от деградации растительными эндонуклеазами. В 2001 г. было предположено, что белок VirE2 может обеспечивать перенос коротких олигонуклеотидов через искусственную мембрану, формируя пору (Dumas et al., 2001). Однако прямых доказательств переноса Т-ДНК через VirE2-зависимую пору до сих пор не представлено. Неизвестно, как образуется пора и функционирует VirE2-зависимый канал. В данной работе была проверена гипотеза о возможности переноса Т-ДНК, на примере оцДНК (одноцепочечная ДНК), в животные клетки с участием белка VirE2, а также исследовались структура и функции рекомбинантного белка VirE2 и его комплексов в связи с возможностью переноса оцДНК через VirE2-зависимую пору.
Перенос Т-ДНК в вегетативные и генеративные растительные клетки in vitro и in planta используют для получения трансгенных растений. Традиционно для агробактериальной трансформации in vitro используют вегетативные ткани растений в прорастающих семенах, листьях молодых проростков, фрагментах корня и стебля, что имеет ряд неудобств: необходимость использовать стерильные условия для регенерации из каллуса взрослых растений, длительность процедур регенерации, наличие фитотрона, химерность образуемых трансгенных растений. Особенно эти проблемы актуальны для однодольных растений, у которых регенерация затруднена, а в некоторых случаях невозможна. В связи с этим актуальной задачей является разработка технологий трансформации растений, которые не требуют стадии культуры тканей растения.
Ранее для двудольных растений было показано, что генеративные клетки (женского и мужского гаметофитов) могут быть трансформированы методом агробактериальной трансформации in planta (Chumakov, 2007). Для ряда значимых однодольных сельскохозяйственных культур (кукуруза, сорго) к началу наших исследований не были получены трансформанты данным способом. В связи с этим было важно проверить возможность трансформации генеративных клеток (женского и мужского гаметофитов) однодольных растений методом агробактериальной трансформации in planta, что представляет практический интерес. В настоящее время также не ясны возможные пути доставки Т-ДНК из агробактерий в растительную клетку при агробактериальной трансформации in planta.
Таким образом, изучение детального механизма переноса комплекса белка VirE2 с оцДНК через мембрану в эукариотические клетки и его участия в порообразовании представляет как теоретический, так и практический интерес: система вирулентности агробактерий может служить адекватной моделью в изучении структуры и функций макромолекулярных комплексов, а также может быть использована для разработки новых технологий трансформации растений и доставки генов в клетки животных и человека.
Цель работы: выявление механизмов транспорта оцДНК-белковых комплексов агробактерий через мембраны и разработка технологий переноса оцДНК в растительные и животные клетки.
Задачи исследования:
1. Осуществить клонирование и экспрессию агробактериального гена virE2 в
клетках Еscherichia coli.
2. Наработать в препаративных количествах, идентифицировать
рекомбинантный белок VirE2 и оценить его функциональные свойства.
-
Охарактеризовать морфометрические показатели и поверхностный заряд белка VirE2 и его комплексов, оценить способность комплексов белка VirE2 к формированию пор для переноса оцДНК.
-
Исследовать механизм транспорта Т-ДНК в клетки женского гаметофита кукурузы при агробактериальной трансформации in planta.
-
Определить эффективность переноса генов в прямой и антисмысловой ориентации методом агробактериальной трансформации in planta и их экспрессии в геномах кукурузы и сорго.
-
Исследовать накопление оцДНК в животных клетках при участии белка VirE2.
Научная новизна полученных результатов. Методом агробактериальной трансформации in planta впервые осуществлен перенос генов в прямой и антисмысловой ориентации в геномы кукурузы и сорго. Данный метод снимает ограничения по получению трансгенных растений с использованием различных линий и сортов кукурузы и сорго. Нами впервые показано, что Т-ДНК попадает в яйцеклетку кукурузы при инокуляции пестичных нитей агробактериями с активированными vir-генами с прорастающей пыльцевой трубкой при агробактериальной трансформации in planta.
С помощью компьютерных и экспериментальных методов установлено, что белок VirE2 может образовывать комплексы, состоящие из двух и четырёх индивидуальных белков, внутри которых предсказаны и охарактеризованы поры (каналы). Методами компьютерного моделирования впервые были предсказаны трансмембранные участки у комплексов, состоящих из 2-х и 4-х молекул белка VirE2, способные интегрироваться в липидную мембрану, и рассчитан поверхностный заряд поровых комплексов.
Агробактериальный ген virE2 клонирован в векторе pQE31 и экспрессирован в клетках Е. coli. Наработан в препаративных количествах рекомбинантный белок VirE2, основные функции которого идентичны природному белку VirE2.
Впервые с помощью технологии фагового дисплея получены миниантитела на рекомбинантный белок VirE2, которые могут быть использованы для детекции как рекомбинантного белка VirE2, клонированного в Е. coli, так и VirE2 из A. tutumefaciens.
На защиту выносятся следующие положения:
-
Агробактериальный ген virE2 клонирован и экспрессирован в клетках Е. coli.
-
Хроматографическими методами наработан, очищен и идентифицирован иммунохимическими методами рекомбинантный белок VirE2, основные функции которого идентичны природному белку VirE2.
-
С помощью технологии фагового дисплея получены, очищены и использованы в иммунодетекции миниантитела на рекомбинантный белок VirE2.
4. Надмолекулярные комплексы, состоящие из четырех молекул белка VirE2,
способны к формированию в мембране поры, размер которой обеспечивает
перенос оцДНК.
-
После совместной инкубации флуоресцентно-меченных олигонуклеотидов и оцДНК с белком VirE2 флуоресценция животных клеток увеличивается.
-
Методом агробактериальной трансформации in planta осуществлен эффективный перенос маркерных и функциональных генов в геномы кукурузы и сорго.
-
Перенос в составе Т-ДНК и экспрессия в геноме кукурузы фрагмента гена пролиндегидрогеназы в антисмысловой ориентации изменяет устойчивость кукурузы к засолению.
-
При обработке пестичных нитей кукурузы суспензией агробактерий Т-ДНК попадает в яйцеклетку кукурузы с прорастающей пыльцевой трубкой.
Научно-практическая значимость работы. Разработаны методические приемы по получению трансгенных растений кукурузы и сорго методом агробактериальной трансформации in planta.
Показано, что методом агробактериальной трансформации в условиях in planta возможно эффективно перенести маркерные и функциональные гены и добиться их экспрессии в геномах кукурузы и сорго, что дает возможность изменять их агрономически важные свойства.
В частности показано, что экспрессия в геноме кукурузы фрагмента гена пролиндегидрогеназы в антисмысловой ориентации придает растениям устойчивость к засолению.
Установлено, что белок VirE2 способствует накоплению оцДНК в клетках HeLa (клетки карциномы шейки матки) и СПЭВ (клетки почек эмбрионов свиньи), что может быть использовано для разработки новых подходов по доставке генов в эукариотические клетки.
Материалы, полученные в диссертации, использовались при проведении лекций и практических занятий по спецкурсу по молекулярной биологии для студентов факультета нелинейных процессов, биологического факультета СГУ им. Н.Г. Чернышевского и для аспирантов в Учебно-научном центре при ИБФРМ РАН. Было подготовлено учебное пособие для студентов: Волохина И.В., Чумаков М.И. Практические занятия по курсу "Методы молекулярной биологии, генетики и биотехнологии" Учебное пособие для студентов. Саратов: Изд. центр "Наука" 2007. 60 с.
По результатам работы были получены 2 патента:
1. Эльконин Л.А., Лешко Е.В., Чумаков М.И., Волохина И.В., Равин Н.В.,
Скрябин К.Г. Способ получения трансгенных растений сорго. Патент на
изобретение № 2002129862/13 (031569), приоритет от 06.11.02, выдан 24.02.2004,
ФИПС, Россия;
2. Волохина И.В., Великов В.А., Тырнов В.С., Чумаков М.И. Способ
получения трансгенных растений кукурузы // Бюллетень изобретений. 10.04.2009.
№ 10. Патент на изобретение № 2351120.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа выполнена на базе лаборатории биоинженерии (до 2005 г. лаб. агробактериальной трансформации и биотехнологии) ИБФРМ РАН в 2001-2016 гг. в рамках НИР «Изучение контактных взаимодействий ризобий, агробактерий и ассоциативных форм бактерий с поверхностью растений», N гос. регистрации 01.960.0-01675 (2002-2005 гг.) и «Исследование переноса ДНК-белковых комплексов в эукариотические клетки», № 01200606182 (2006-2016), научный руководитель д.б.н. М.И. Чумаков.
Исследования, отраженные в диссертации, поддержаны грантами РФФИ № 02-04-49446 «Изучение переноса белка вирулентности VirE2 через мембрану растительной клетки при агробактериальной трансформации растений» (2002-2004 гг.) и 11-04-01331 «Изучение механизма переноса Т-ДНК агробактерий в генеративные клетки кукурузы» (2011-2013 гг.) (рук. И. В. Волохина ); грантом Министерства образования и науки по программе «Развитие научного потенциала высшей школы» за 2005 г., подпрограмма № 3, раздел № 3.5 (2005-2007 гг.) «Исследование переноса Т-ДНК через природные и искусственные мембраны»; грантом Федерального агентства по науке и инновациям в рамках Федеральной Программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» «Технологии биоинженерии» (мероприятие 1.2 Программы) шифр «2007-2-1.2-09-01-137» по теме: «Разработка технологии переноса Т-ДНК в генеративные клетки кукурузы» (рук. М.И. Чумаков); грантами по ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. № 8592 по теме «Получение стрессоустойчивых линий кукурузы методами биоинженерии» (рук.
Е.М. Моисеева) и № 8728 по теме «Разработка технологии доставки ДНК в животные клетки с помощью белка VirE2» (рук. С.И. Мазилов).
Личный вклад соискателя состоит в получении всех представленных данных по выделению и очистке белка VirE2. Сделан определяющий вклад в исследовании роли белка VirE2 в доставке олигонуклеотидов в животные клетки (совместно с Ю.С. Гусевым). Участие в качестве соавтора в изучении агробактериальной трансформации кукурузы (совместно с Е.М. Моисеевой, В.А. Великовым), сорго (совместно с Л.А. Элькониным, В.С. Тырновым, Н.В. Равиным, К.Г. Скрябиным), компьютерном моделировании комплексных структур белка VirE2 и его комплексов in silico, а также в описании и обработке полученных данных (совместно с Ю.С. Гусевым, С.И. Мазиловым). Лично проведены все эксперименты по исследованию роли белка VirE2 в переносе через искусственные и природные мембраны и с использованием метода трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ). Клонирование гена virE2 проведено при участии И.А. Сазоновой, работы по получению и очистке миниантител к белку VirE2 выполнены совместно с В.А. Великовым, сотрудниками лаборатории биоинженерии ИБФРМ РАН, что отражено в публикациях. Эксперименты по анализу размеров ДНК-белковых комплексов методом динамического рассеяния света проведены с участием Н.Г. Хлебцова. Интерпретация экспериментальных и компьютерных данных, подготовка результатов к публикации проводились при консультациях М.И. Чумакова.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 9 российских и 15 международных научных конференциях: XI-th Int. Cong. Mol. Plant-Microbe Interactions (Санкт-Петербург, 2003); II Российской школе-конф. “Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине” (Саратов, 2004); Межд. конф. «Фитопатогенные бактерии. Фитонцинология. Аллелопатия» (Киев, Украина, 2005); 4, 6 Int. Conf. Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (BGRS, Новосибирск, 2006, 2008); III Межрег. конф. молодых ученых “Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой” (Саратов, 2006); Moscow Conf. Comput. Mol. Biol. (MCCMB’07, Москва, 2007); Всерос. конф. с международным участием “Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем” (Саратов, 2007); Межд. конф. “S.P. Kostychev and Contemporary Agricultural Microbiology” (Ялта, Украина, 2007); III Саратовском салоне изобретений, инноваций и инвестиций (Саратов, 2007); XX Int. Cong. Genetics (Berlin, Germany, 2008); XXI Conf. Maize and sorghum breeding in the genomic era (Bergamo, Italy, 2009), Межд. научно-практ. конф. «Вавиловские чтения – 2009» (Саратов, 2009); Int. Conf. Plant Genetics, Genomics, and Biotechnology (Новосибирск, 2010); III Межд. форуме по нанотехнологиям “RUSNANOTECH 2010” (Москва, 2010); 2-ой ежегодной науч.-технич. конф. нанотехнологического общества России “Перспективы развития в России НБИК-технологий как основного научного направления прорыва к шестому технологическому укладу” (Москва, 2010); Межд. научной конф. «Биотехнология начала III тысячелетия» (Саранск, 2010); AB-RMS PhD courses and Symp. «Molecular Biotechnology Adaptation to Climate Change in the Baltic Sea Region: Contributions from Plant and Microbial Biotechnology» (Mikkeli, Finland,
2010); Int. Moscow Conf. on Comput. Molec. Biol. (MCCMB’11, Москва, 2011);
Межд. научно-практической конф. «Фармацевтические и медицинские
биотехнологии» (Москва, 2012); IV Всерос. Симп. «Трансгенные растения:
технологии создания, биологические свойства, применение, биобезопасность»
(Москва, 2012); III Межд. научно-практической конф. «Постгеномные методы
анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2012);
IV и V Съездах биофизиков России (Н. Новгород, 2012, Ростов-на-Дону, 2015);
6-ой Межд. научно-практ. конф. «The nanoparticles and nanostructured coatings
microcontainers: technology, properties and applications» (Саратов, 2015); V Съезде
биохимиков России, (Сочи–Дагомыс, 2016); VI Всерос. симпозиуме
«Трансгенные растения: технологии создания, биологические свойства, применение, биобезопасность» (Москва, 2016).
Публикации. Результаты исследований по теме диссертации изложены в 30 публикациях, в том числе в 27 статьях, 16 из которых – в журналах, рекомендованных перечнем ВАК, 11 – статьи в сборниках конференций, 1 учебном пособии и 2 патентах РФ.
Структура и объем работы. Диссертация, объемом 280 страниц, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов экспериментальных данных и их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы из 480 источников, из которых 418 – зарубежные. Диссертация содержит 44 рисунка и 21 таблицу.
Генетическая трансформация однодольных растений
Природный процесс агробактериальной инфекции растений используется в биотехнологии для создания трансгенных растений с 70-х годов ХХ века. Данный метод получил широкое распространение из-за того, что практически любые гены, помещенные вместо онкогенов между правой и левой границами Т-ДНК агробактерий, могут быть перенесены из агробактерий в растение.
С использованием данного метода были получены трансгенные растения, используемые в сельском хозяйстве: плодовые и ягодные (груша яблоня, вишня и др.), декоративные (хризантема, гвоздика), овощные (морковь, картофель, томаты) и злаковые (пшеница, рис) культуры (Кучук, 1997, Чумаков, 2001). Среди генов, введенных в растения, наиболее широко распространены ген, кодирующий беок Bt-токсина из Bacillus thuringiensis, придающий устойчивость к насекомым-вредителям, а также ген bar, кодирующий фермент фосфинотрицин ацетилтрансферазу из Streptoтyces hygroscopicus, который расщепляет гербицид фосфинотрицин. Кроме того, трансгенные растения используют для наработки каких-либо целевых молекул, например, «съедобных вакцин», а также для придания растениям новых свойств – повышенной сахаристости, устойчивости к засухе и к холоду и т.д.
Для получения трансгенных растений используют различные методы агробактериальной трансформации. Методы агробактериальной трансформации можно условно разделить на методы in vitro, предусматривающие культивирование растительных клеток и тканей и последующую регенерацию растений, и методы in planta, где эта стадия отсутствует. Агробактериальная трансформация in vitro является наиболее распространенным методом получения трансгенных растений. В данном методе проводится ко-культивирование клеток, тканей или целых органов растений (корней, листовых пластинок, черенков) с агробактериями. Затем переносят обработанный агробактериями растительный материал на твердые питательные среды, содержащие бактериостатические агенты для инактивации агробактерий. В состав Т-ДНК обычно входят гены, которые позволяют проводить первичный отбор трансформантов. Ранее, для отбора трансформантов чаще всего использовали гены устойчивости к антибиотикам (канамицин, гигромицин) или гербицидам (глифосат, фосфинотрицин) (Бурьянов с соавт., 1999; Мишуткина c соавт., 2010). Сейчас всё большее распространение получают альтернативные селективные маркеры (Рукавцова с соавт., 2013; Nahampun et al., 2016). Трансформированные клетки активно размножаются на среде, образуя каллус, из которого после индукции морфогенеза регенерируют взрослые растения. Рассмотрим более подробно некоторые методические приемы для получения трасгенных растений.
Одним из наиболее ранних и традиционно используемых методов трансформации вегетативных клеток является метод эксплантов. Эксплантами считаются многоклеточные части органов или тканей (кусочки стебля, корня, листовые диски, части проростка). 1.1.1.1.1 Трансформация листовых дисков Листовые диски растений особенно удобны для проведения агробактериальной трансформации двудольных растений. Листовые пластинки после предварительной стерилизации нарезают в стерильных условиях на небольшие фрагменты, а затем проводят совместную инкубацию с агробактериями на чашках Петри. Затем листовые пластинки переносят на среды для культивирования растений, где при добавлении соответствующих растительных гормонов, вблизи срезанных краев происходит формирование каллуса (Ammirato et al., 1984). Первоначально, данная методика была разработана для модельного объекта исследований – табака (Nicotiana tabacum), а затем стала применяться и на других пасленовых – петунье (Lamppa et al., 1985), томате (Park et al., 1984), картофеле, а также для трансформации арабидопсиса (An et al., 1986) и некоторых других видах растений (Chumakov, 2007).
Благодаря тому, что листовые пластинки не имеют покоящихся почек, образование большинства побегов происходит из дедифференцированных клеток, которые чувствительны к трансформации A. tumefaciens. Данный метод имеет ограничения, так как не все растения могут эффективно регенерировать побеги из дедифференцированных клеток.
Штаммы, использованные для клонирования гена virE2 и выделения рекомбинантного белка VirE2
В 1977 г. была впервые доказана встройка и экспрессия Т-ДНК в растительном геноме (Chilton et al., 1977). В дальнейших экспериментах было показано, что агробактериальной трансформации подвергаются также и животные клетки в условиях in vitro, если у агробактерий индуцировать гены вирулентности или искусственно ввести препарат Т-ДНК в комплексе с белками вирулентности (VirD2, VirE2) в клетки HeLa (Kunik, 2001; Tzfira, Citovsky, 2001). Агробактерии способны также к трансформации генома морского ежа (Bulgakov et al., 2006), грибов (Zhang et al., 2013; Li et al., 2013; Zhang et al., 2014), дрожжей (Schrammeijer et al., 2003).
Понимание механизма агробактериальной трансформации важно не только для решения биотехнологических задач, но и для понимания многих фундаментальных проблем, в частности, горизонтального переноса генов. Так как перенос Т-ДНК из агробактерий в растение является примером горизонтального переноса ДНК между про- и эукариотами в природных условиях.
Перенос Т-ДНК является уникальным примером обмена генетической информацией между организмами разных филогенетических царств между про- и эукариотами. Конъюгационный перенос плазмид между бактериями, а также перенос генов от агробактерий к эукариотам относят к IV типу секреции (Christie, 1997). Т-ДНК переносится из бактериальной в растительную клетку, встраиваясь в ее геном. Экспрессия перенесенных агробактериальных генов приводит к образованию различных типов опухолей у растений. Так, болезнь «корончатый галл» (crown gall) была впервые описана еще Аристотелем.
Агробактерии – почвенные аэробные грамотрицательные бактерии, представляющие собой короткие, подвижные палочки с перитрихиальными жгутиками, два из которых образуют полярный пучок. Агробактерии относятся к семейству Rhizobiaceae и включают 4 вида фитопатогенных бактерий (A. tumefaciens, A. rhizogenes, A. rubi, A. vinis) и один сапрофитный, к которому относиться A. radiobacter, обитающий в почве и в ризосфере растений. Так при инфицировании растений бактериями вида A. tumefaciens на растении образуются наросты на прикорневой шейке – корончатые галлы, тогда как A. rhizogenes вызывает эффект "бородатого корня" (hairy root), A. rubi способствует образованию стеблевых галлов (cane gall), A. vinis – галлов и некрозов на винограде (Пирузян, 1988).
Долгое время не удавалась определить возбудителя этой болезни, пока в 1897 г. Ф. Каварой не была выделена бактерия из опухоли винограда, названная впоследствии Agrobacterium tumefaciens, что означает "полевая бактерия, вызывающая рак" (Чернин, 1990). Раскрыть природу опухолеобразования удалось лишь в 1974 г. Группой исследователей из Гентского университета было установлено, что патогенные штаммы отличаются от непатогенных агробактерий наличием в их геноме крупной плазмиды с молекулярной массой 15-20 МДа. Причем у A. tumefaciens онкогенность связана с Ti-плазмидой, а у A. rhizogenes с Ri-плазмидой. Однако сами Ti-, Ri-плазмиды не переносятся в растение, а переносится лишь их фрагмент – Т-ДНК. В инфицированных клетках экспрессия генов Т-ДНК приводит к увеличению синтеза гормонов и, как следствие, к изменению дифференциации клеток и неуправляемой пролиферации, в результате чего развивается опухоль. Начавшийся опухолевый рост может продолжаться уже и в отсутствие агробактерий (Braun, 1942), а опухолевая ткань способна расти на искусственной среде без добавления экзогенных гормонов. Трансформированные клетки растений начинают синтезировать опины – низкомолекулярные соединения, являющиеся производными некоторых аминокислот, например, октопин и нопалин – производные аргинина, или, как агропин и агроцинопин, имеющие углеводное происхождение. Все они характеризуются одним общим свойством – могут использоваться только агробактериями в качестве источника углерода и азота (Lippincott B., Lippincott J., 1969). Так как на плазмиде агробактерии расположены гены, отвечающие за деградацию синтезируемых растением-хозяином опинов, создаются селективные преимущества для размножения агробактерий.
У агробактерий на поверхности клетки формируется полисахаридная капсула. Хотя агробактерии не образуют эндоспор, они могут сохранять жизнеспособность в условиях почвы в течение многих лет. Оптимальной температурой для роста агробактерий является диапазон температур 25-30 С, максимальная – 42 С. Однако уже при температуре 37 С агробактерии теряют Ti-плазмиду. Некоторые штаммы непатогенных агробактерий способны синтезировать агроцинопины. Так антибиотик агроцин-84, выделенный из штамма А. radiobacter К84, защищает растения от патогенного штамма A. tumefaciens, несущего Ti-плазмиду. На его основе выпущены биопреператы «Галеин» и «Gallrol» (фирма «Covagri», Франция).
Для идентификации агробактерии сначала были разделены на виды по патогенности: A. tumefacience, A. rubi, A. rhizogenes, а непатогенный штамм назван A. radiobacter. Но деление агробактерий по типу плазмид на данный момент является условным, так как патогенность определяется плазмидами, которые могут приобретаться и теряться, что приводит к нестабильности при определении видов, и в 2001 г. на основании генетического сходства было предложено называть Agrobacterium tumefaciens – Rhizobium radiobacter. Если ранние работы по систематике бактерий основывались в основном на морфологических и физиологических признаках, а также выделении чистых культур, то последние 20 лет в связи с развитием методов молекулярной биологии, таких как секвенирование и ПЦР, возможности для построения филогении значительно расширились.
Агробактериальная трансформация пыльцы кукурузы
Выделение плазмидной ДНК из клеток E. coli проводили методом щелочного лизиса, методом кипячения (Маниатис c соавтор., 1984), а также с использованием наборов фирмы Promega (США) или Евроген (Россия).
Ночную культуру E. coli разливали по пробиркам, центрифугировали в течение 2 мин при 10000 g (объем ночной культуры примерно 4,5 мл). Надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в 600 мкл лизирующего буфера. Инкубировали 5 мин при 80 oС для лизиса клеток, а затем охлаждали при комнатной температуре. Добавляли 3 мкл раствора РНКазы (10 мг/мл). После этого инкубировали 15-60 мин при 37 oС, затем охлаждали при комнатной температуре. Добавляли 200 мкл раствора для осаждения белков и тщательно перемешивали. Инкубировали на льду в течение 5 мин. Центрифугировали 3 мин при 10000 g, переносили надосадочную жидкость в новые пробирки, добавляли 600 мкл изопропанола и аккуратно перемешивали. Центрифугировали 2 мин при 10000 g Надосадочную жидкость удаляли, а осадок подсушивали на воздухе. Добавляли 600 мкл этилового спирта и аккуратно переворачивали закрытые пробирки несколько раз. Центрифугировали 2 мин при 10 тыс. g., спирт удаляли. Осадок подсушивали и растворяли в 100 мкл буфера для растворения ДНК.
Выделение тотальной ДНК из кукурузы и сорго проводили согласно методике (Дрейпер с соавт., 1991 с модификациями Н. Пухачевой (ИЦиГ СО РАН (личное сообщение)). Кратко, метод выделения заключался в следующем: 0,1 г растительного материала после замораживания при -20 С растирали с оксидом алюминия, добавляли 600 мкл экстрагирующего буфера (100 мМ трис-HCl, 50 мМ ЭДТА, 500 мМ NaCl, 1,25% ДСН, 8,3 мМ NaOH, 0,83% Na2S2O3), нагретого до 65 С, и инкубировали еще 15 мин при 65 С. Затем к смеси добавляли 200 мкл ацетата калия и инкубировали при 20 С 20 40 мин. После центрифугирования супернатант переносили в чистые пробирки и добавляли 0,7 объема изопропанола, снова центрифугировали. Осадок промывали 70% этанолом, подсушивали и растворяли в 200 мкл буфера ТЕ. Затем добавляли 0,5 объема ацетата натрия и проводили центрифугирование. К супернатанту добавляли 0,7 объема изопропанола, центрифугировали, осадок промывали 70% этанолом, подсушивали и растворяли в 100 мкл ТЕ-буфера. К раствору добавляли 0,5 объема фенола, центрифугировали, а к супернатанту добавляли 0,5 объема смеси хлороформ / изоамиловый спирт (24 : 1). После центрифугирования к супернатанту добавляли 0,1 объема ацетата натрия, 2 объема этилового спирта, инкубировали 4 часа при –20 С. После центрифугирования осадок промывали 70% этанолом и растворяли в 40 мкл воды.
Клонирование гена virE2 проводили с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в векторе pQE31. В качестве матрицы для проведения реакции ПЦР использовали тотальную ДНК A. tumefaciens С58. Для ПЦР использовали праймеры («Синтол», Россия), комплементарные правой и левой границам гена virE2: VirE2 (+): 5 -gacgatggatccgaaggccgaag-3 ; VirE2 (-): 5 -aaaactgcagctacagactgtttacggttgggccgc-3 . ПЦР-реакцию проводили в следующем температурном режиме: 95 С – 5 мин; 35 циклов (94 С – 45 с, 62 С – 45 с, 72 С – 1 мин); 72 С – 10 мин. Реакционная смесь и условия ПЦР были следующие: H2O – 12.8 мкл, dNTP – 2 мкл (конц.), буфер для ПЦР – 2 мкл; Tag-полимераза – 0.2 мкл, ДНК из штамма A. tumefaciens С58 – 1 мкл (1 мг/мл), праймер VirE2(+) – 1 мкл (20 пкмоль), праймер VirE2(-) – 1 мкл (20 пкмоль). Полученный ПЦР-продукт выделяли из агарозного геля и клонировали в вектор pQE31 по сайтам BamHI и PstI. Приготовление компетентных клеток, лигирование плазмидной ДНК, элюирование ДНК из геля и трансформацию E. coli проводили согласно (Маниатис с соавт., 1984).
Амплификацию ДНК, выделенной из растений, проводили на амплификаторе Mastercycler personal (Эппендорф, Германия) Для кукурузы ПЦР на фрагмент гена nptII (500 п.н.) проводили со специфическими прямым (gaggctattcggctatgactg) и обратным (cgagatcatcgccgtcgggc) праймерами при следующих условиях: 5 мин – 94 С; 35 циклов (1 мин – 94 С, 1 мин – 60 С, 1 мин – 72 С); 2 мин – 72 С. Для ПЦР на АПП (550 п.н.) использовали праймеры: (+) 5 -aacaaactggatccggcgatcttac-3 и (-) 5 -gagatgttggtctagatttggcagc-3 при следующих условиях: 5 мин – 94 С; 35 циклов (1 мин – 94 С, 1 мин – 58 С, 1 мин – 72 С); 2 мин – 72 С. ПЦР на участок гена gus-intron (500 п.н.) проводили со специфическими праймерами: P1 (+): 5 -gtgggaaagcgcgttacaag-3 , P2 (-): 5 -acgcgtggttacagtcttgc-3 . При этом использовали следующие условия для проведения ПЦР: 4 мин – 94 С; 35 циклов (1 мин – 94 С, 1 мин – 59 С, 1 мин – 72 С); 2 мин – 72 С. Для получения ПЦР-фрагмента гена gfp (700 п.н.) использовали праймеры: GFP(+) 5 gtcagtggagagggtgaagg-3 ; GFP(-) 5 acagggccatcgccaattgga-3 при следующих условиях: 5 мин – 94 С; 35 циклов (1 мин – 94 С, 1 мин – 60 С, 1 мин – 72 С); 2 мин – 72 С. Для сорго Реакцию ПЦР проводили с праймерами, специфичными к фрагменту гена nptII (5 -acagacaatcggctgctctgatg-3 - и 5 -ggcaggagcaaggtgagatgaca-3 ) размером 253 п.н. при следующих условиях: 5 мин – 94 С; 35 циклов (1 мин – 94 С, 30 с – 50 С, 1 мин – 72 С); 2 мин – 72 С. Специфичность амплификации в дальнейшем подтверждали путем рестрикции ПЦР-фрагмента рестриктазой PstI, расщепляющей данный фрагмент на две части – 100 и 150 п.н. Все праймеры были синтезированы фирмой Синтол (Россия).
Определение эффективности трансформации in planta с использованием конструкции с антисмысловой последовательностью фрагмента гена пролиндегидрогеназы
Очищенный белок VirE2, хранящийся в замороженном состоянии, подвергается процедуре заморозки-разморозки для проведения экспериментов. Поэтому было важно выяснить, сохраняются ли функциональные свойства белка после процедур заморозки-оттаивания.
Из рисунка 3.9 видно, что интенсивность полосы, соответствующей оцДНК для варианта, где в смесь добавляли первоначальный экстракт VirE2-белка и нуклеазу S1, практически совпадает с интенсивностью полосы, соответствующей оцДНК без добавления нуклеазы. В то время как интенсивность полосы, соответствующей оцДНК для варианта, где в смесь добавляли экстракт белка VirE2, подвергавшийся трехкратной процедуре заморозки-оттаивания, практически не отличается от фона.
Таким образом, установлено, что белок VirE2 теряет свою активность после нескольких процедур заморозки-оттаивания (начиная с трех) (рис. 3.9). При выделении белков из клеток E. сoli, содержащих экспрессионные векторы, клонированный продукт может образовывать тельца включения (Bharat et al., 2013). В виду этого можно предположить, что процедура замораживания-оттаивания может вызывать более сложные конформационные изменения, приводящие к необратимой агрегации белка. Известно также, что белок VirE2 без белка-шаперона VirE1 или оцДНК может образовывать растворимые агрегаты даже в отсутствии оцДНК (Frenkiel-Krispin et al., 2007). Для проверки этого предположения были проведены измерения гидродинамического диаметра белка VirE2 после очистки на Ni-НТА-агарозе, а также после трехкратной процедуры заморозки-оттаивания и после 16-часовой инкубации при 4 C (таблица 3.2). При измерении методом ДРС был использован прибор Zetasizer Nano ZEN 3500, который позволяет определять размеры белка в диапазоне 1-20000 кДа. Запатентованная технология NIBS (неинвазивного обратного рассеяния) обладает высокой чувствительностью, позволяет проводить измерения размеров частиц и молекул в широком размерном и концентрационном диапазонах. Разработчики позиционируют использование прибора для определения молекулярной массы белков, присутствия агрегатов, исследования олигомеризации в сверхмалых объёмах. 2 3 4 Обозначения дорожек: 1. оцДНК фага I без добавления нуклеазы S1; 2. оцДНК фага X с добавлением нуклеазы S1 и экстракта, содержащего VirE2; 3. оцДНК фага I с добавлением нуклеазы S1; 4. оцДНК фага X с добавлением нуклеазы S1 и VirE2, после трехкратной процедуры замораживания-оттаивания экстракта. Рисунок 3.9 - Проверка активности белка VirE2 при заморозке-оттаивании Белок VirE2 в растворе после его хроматографической очистки более чем наполовину состоял из частиц с гидродинамическим диаметром 12 нм (59%), 39% всех частиц были представлены агрегатами со средним диаметром 100 нм и около 2% составляли частицы с размером 2600 нм (табл. 3.2).
После трехкратного замораживания-оттаивания количество частиц с размером 12 нм уменьшалось на 31% при одновременном увеличении процента более крупных частиц размером 110 нм до 70%. Схожая тенденция наблюдалась при длительном инкубировании (16 ч) белка VirE2 при 4С: частицы с диаметром 18 нм составили 37%, 151 нм – 60%, 3000 нм – 30% соответственно. Тогда как при измерении сходного по размеру глобулярного белка – бычьего сыворочного альбумина (БСА) с молекулярной массой 66 кДа, основная часть частиц имела размер 8 нм (90%), 4% частиц имели размер 20 нм, что может соответствовать димерной форме белка (Сердюк с соавт., 2006), и 6% приходилось на частицы с диаметром 68 нм (табл. 3.2).
Полученные данные свидетельствуют о том, что, возможно, белок VirE2 в растворе может существовать не только в виде мономера, но и образовывать олигомерные комплексы. Известно, что даже в отсутствии оцДНК белок VirE2 может формировать нитевидные структуры (Frenkiel-Krispin et al., 2007), а в бактериальной клетке он прочно связан со своим белком-шапероном VirE1, который препятствует связыванию VirE2 с оцДНК (Deng et al., 1999; Dym et al., 2008). Еще одним возможным доказательством образования комплексов из молекул белка VirE2 могут служить данные о неизвестном ранее свойстве этого белка формировать канал для переноса оцДНК в липидной мембране (Dumas et al., 2001). Однако до сих пор не ясно, где VirE2 освобождается от VirE1 в растительной клетке, и как происходит связывание VirE2 с оцТ-ДНК. Нами были построены компьютерные модели комплексов из молекул VirE2, а также оценены их размеры (смотри разделы 3.10 и 3.14).
Таким образом, с помощью метода ДРС установлено, что рекомбинантный белок VirE2 при сверхэкспрессии в клетках E. coli, после его очистки с использованием метода жидкостной хроматографии, образует мультимерные комплексы 12 и 100 нм. Агрегация белка VirE2 в буферном растворе усиливается после трехкратной процедуры заморозки-оттаивания, а также при длительной инкубации при 4 С.