Введение к работе
1.1, Актуальность темы. Генная инженерия многоклеточных организмов является одной из областей современной биотехнологии.
Использование при создании трансгенных организмов генов маркерных (ре портерных) белков, таких как р-галактозидаза кишечной палочки Escherichia соІІ или зелёный флуоресцирующий белок (green fluorescent protein, GFP) медузы Aequorea victoria, позволяет изучить эффективность генетической трансформации животных, установить функциональную активность различных клонированных промоторов.
В течение многих лет эксперименты по трансгенезу насекомых проводились ь основном на дрозофилах Drosophila mclanogaster с помощью рекомбинаитных Р-элементов - подвижных генетических структур (мобильных элементов, м. э.), обнаруженных у этого вида (Rubin et at,, ] 982).
Успешная генетическая трансформация насекомых, не относящихся к семейству drosophilidae, в последние годы стала возможна в результате создания учёными генных конструкций на основе м. э., обнаруженных у насекомых разных видов (Handler A.M., 2001). Подвижный элемент комнатных мух Musca domestica L. - Hermes (Warren et al., 1994) - относится к группе транспозонов, которые наиболее часто используются в качестве вектора для генетической трансформации насекомых (Handler A.M., 2001).
При проведении экспериментов по созданию трансгенных насекомых наряду с выбором генной нжен ер ного вектора большое внимание уделяется таким генетическим маркерам, которые обеспечивают эффективный отбор трансгенных особей в потомстве микроинъецированных особей. В настоящее время наиболее эффективными прижизненными селективными маркерами являются гены флуоресцирующих белков, выделенные из медуз и кораллов, а также мутантные формы этих генов, в том числе улучшенный GFP (Enhanced GFP, EGFP) (Handler A.M., 2001).
Предварительным этапом получения трансгенных сельскохозяйственных млекопитающих (Брем и др., 1996; Эрнст Л.К., 2003, 2004) является анализ интеграции и тканеспецифической экспрессии чужеродных генов у модельных животных, в качестве которых, в основном, используют лабораторных мышей Mus Museums L. Короткий промежуток времени, необходимый для смены генераций (65-70 дней) и высокая плодовитость мышей облегчают проведение
ЦНБ МСХА фонд научной литературы
экспериментов по трансгснезу этих животных, обуславливая получение достоверных результатов.
1.2. Цель п задачи исследований. Цель настоящей работы заключалась в
создании новых моделей гснечически трансформированных жнвотньсх на
основе использования репортери ых генов.
Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:
— провести трансформацию клеток зародышевого пути Musca domestica
методом микроинъекции в ранние эмбрионы рекомбинантных Р и Hermes
мобильных генетических элементов, содержащих в качестве маркерного
гена ген бета-галактозндазы (LacZ) и ген зелёного флуоресцирующего
белка (EGFP);
— провести анализ генегической трансформации в первом и втором
поколении комнатных мух, подвергшихся микроинъекции, по наличию
экспрессии указанных релортёрных белков;
провести ПЦР-аиализ ДНК комнатных мух, микроинъецированных на эмбриональной стадии развития, и их потомков на наличие трансгена;
провести ІЩР-анализ ДНК лабораторных мышей, полученных в результате микроинъекции в про нуклеусы зигот генетической конструкции, содержащей ген EGFP под контролем промотора гена белка промежуточных филаментов кератина шерсти овец (К2.10), на содержание последовательностей трансгена;
провести молекулярно-генетический анализ наследования трансгена в первом и втором поколении трансгенных мышей;
исследовать экспрессию гена EGFP в клетках коркового вещества волос у полученных трансгенных мышей.
1.3. Научна» могшзнл работы. В ходе выполнения диссертационной
работы впервые при проведении экспериментов по генетической
трансформации комнатных мух с использованием гена улучшенного зелёного
флуоресцирующего белка медузы A. victoria под контролем промотора гена
hsp70 (гена белка тепловою шока) Drosophila melanogaster подтверждена
возможность селекции трансгенных особей на эмбриональной стадии развития.
При проведении исследований на мышах впервые получены трансгенные особи, экспрессируюшие зелёный флуоресцирующий белок под контролем последовательности промотора, контролирующего у овец ген белка промежуточных филаментов кератина шерсти второго типа (К2.10).
1.4. Практическая значимость. Показана принципиальная возможность
использования гена EGFP - мутантной формы гена GFP медузы Aequorea
victoria - в качестве селективного маркера для отбора трансгенных комнатных
мух на эмбриональной стадии развития.
Определена функциональная активность последовательности промотора гена белка промежуточных филаментов второго типа (IP II) кератина шерсти овен (К2.10) длиной 735 пар нуклеотидов,
1.5. Основные положения, выносимые на зашиту:
Возможность использования репортёрного гена EGFP пол контролем промотора Кег5 и промотора гена hsp70 для изучения эффективности генетической трансформации модельных животных Mus Musculus L. и Musca domestica L.
Локализация экспрессии гена EGFP в корковом веществе волос у мышей,трансгенных по Ker-EGFP.
Отклонение фактического расщепления по трансгену Ker-EGFP в первом поколении и подтверждение мекделевского расшеплення по тому же трансгену во втором поколении трансгенных мышей.
-
Апробация работы. Материалы диссертации были изложены на 49-й научной конференции аспирантов и молодых учёных Достижения молодых ученых в области животноводства», проходящей б июля 2000 года в В ГНИ И Же; на отчетных научных конференциях отдела биотехнологии ВГНИИЖа 2001,2002,2003 и 2004 года.
-
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.
-
Структура н объём работы. Диссертация написана на 140 машинописных листах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы, который включает 249 источников, в том числе 197 на иностранных языках. Работа содержит 8 таблиц и 29 рисунков.
2.1. Схемы исследований.
Эксперименты но диетической трансформации комнатных мух проводились в отделе биотехнологии Всероссийского государственного НИИ животноводства в 1995, 1996 гг. и в 2000-2003 гг. в соответствии с планом научно-исследовательской работы. Принципиальная схема этих исследований представлена на рисунке 1,
Рис. 1. Схема исследований генетической трансформации комнатных
мух.
Ми (фонтанна либластодевмнмк эмбрнодан генными констру киням и
J pwLacZ, t pn25wc
Культивиравапие на Личиночной среле
pHermNec-EGFP, pHlpUt
Получение взрослых насекомых (FOJ
а
Слирм&АНМ с контрольными особями
Получение нмаго F1
Оібор н культивирование трансформированные эмбрионов
Получение ішаго F\
Спаривание
имаго Fl между
собой
Выявление экзогенной р-галактотчаэы
Получение имаго F2
Получеи ВО и
кул ьти вирован ие
эмбрионов
Прогревание
чмбрнонов при 37
или 40 *С
Для исследований использовали комнатных мух лабораторной популяции Ш "ИИИЖа, в раніше эмбрионы которых (первые 60-90 мил развития) методом микроинъекпии вводили 100-200 пкл раствора ДНК, представляющего собой смесь вектора и штазмиды помощника в соотношении 5:1 и концентрации 0,2 мг/мл. Микрошгьекции проводились по методике, применяемой на дрозофилах Drosophila melanogaster (Santamaria P., 1986) и имеющей некоторые изменения.
Исследования трансгенеза у мышей были выполнены в 2004-2005 гг. в отделе биотехнологии Всероссийского государственного НИИ животноводства. Первичные животные, полученные в результате микроннъекиии генной конструкции Ker-EGFP в мужские пронуклеусы зигот мышей, были предоставлены Институтом биологии гена РАН. Этапы исследований схематично изображены на рис. 2.
Рис 2. Схема исследований генетической трансформации лабораторії ых мышей.
Получение первичны* (И)живопиих, микроингеикрованкых на Сталин зиготы
2.2. Молекулярная характеристика генных конструкций.
Генетическая конструкция Ker-EGFP - линейная форма плазмиды PKERSH-1.TXT, предоставленная Луниным ВГ. (Всероссийский НИИ сельскохозяйственной биотехнологии, РАСХН). Она содержит ген улучшенного зелйного флуоресцирующего белка медузы (Enhanced GFP, EGFP) под контролем промотора (Кег5) гена белка IF II кератина шерсти овец (К2.10) длиной 735 пар нуклеотидов (Rogers G.E., Powell B.C., 1993).
При проведении экспериментов по генетической трансформации комнатных мух были использованы следующие генетические конструкции; pwLacZ, pjt25wc, предоставленные Корочкиным Л.И. (Институт биологии гена РАН), и pHcrmNeo-EGFP, pHjpHt, предоставленные Косоруковым B.C. (1 Іаучно-пронзводственньїіі биотехнологический центр по животноводству РАСХН).
Вектор pwLacZ. сконструированный на основе Р элемента дрозофилы, содержит репортерный i-eii р-галактозидазы Е. coli (LacZ) пол контролем промотора гена S-эстеразы (Est-S) Drosophila virilis и укороченный ген white D, melanogaster с его собственной реіуляторной областью длиной 300 пи.
Пяазмида помощник pn2Swc. В е состав входит Р элемент D. melanogasier, содержащий ген Р транспозазы (гс25), и имеющий делению 3'-концевого инвертированного повтора (Karess R.E., Rubin G.M., 1984; Ииррота В., 1991).
Генетическая конструкция pIlermNeo-EGFP создана на основе м. э. Hermes, обнаруженного у комнатных мух (Warren et al., 1994). Она содержит бактериальный ген устойчивости к генетицину (Neo1) и ген улучшенного зеленого флуоресцирующего белка (EGFP) Aequorca victoria под контролем промотора белка теплового шока hsp70 D. melanogoster.
ІІШїчпда помощник pfllpfft содержит ген транспозазы мобильного элемента Hermes под кошролом промотора hsp70 t>. melanogoster.
2.3. Исследовании интеграции it экспрессии чужеродных генов.
Анализ интеграции ДНК, м и кро инъецирован ной в зародышевые клетки экспериметгальных животных, проводили методом нолимеразноа ценной реакции (НЦР) (Saiki et al„ 1985; 1988; Сайки и др., 1990; Зиновьева и др., )998), Для проведения ПЦР-анапнза высокомолекулярная ДНК выделялась методами, применяемыми в лаборатории молекулярной генетики и цитогенетики животных ВГНИИЖа (Зиновьева и др., 1998; Гладырь и др., 2001). Выделение ДНК из взрослых комнатных мух осуществляли методом перхлоратной экстракции (Гладырь и др., 2001) с последующей преципитацией раствором полиэтиленгликоля: 24 % ПЭГ-6000, ЗМ NaCl (Ausubel et al., 1987). Для выделения ДНК из проб кожи мышей (около 1 мм3), полученных из отсеченных кончиков хвостои, использовали метод Кавасаки (Kawasaki E.S., 1990; Зиновьева и др., 1998).
Для выявления экспрессии гена LacZ в семявыносящих луковицах у самцов Musca domestica L, с помощью субстрата, содержащего 0,2 % X-gal, использовали методику, применяемую у дрозофил (Bellen et зі., 1989),
' Анализ экспрессии трансгена EGFP у экспериментальных животных (комнатных мух и мышей) проводили с помощью люминесцентного микроскопа OPTON с использованием соответствующего набора световых фильтров, имеющего «возбуждающий» фильтр - ВР 450-490, «запирающий» фильтр * FT 510, LP 520.
' У мух исследовали кладки яиц микроинъецированных особей. Препараты готовили на поздней эмбриональной стадии развития. Материал, предварительно прогретый при 37 или 40 'С, заключали под вазелиновое масло.
У мышей исследование экспрессии трансгена проводили на гистосрезах кожи и в образцах волос. Препараты готовили по обычной методике (Ромейс Б., 1953). Для выявления тканеспецифической экспрессии гена зеленого флуоресцирующего белка в волосяных фолликулах трансгенных мышей дополнительно применяли имму но гистохимический метод окрашивания с использованием авидин - биотинового комплекса (Волкова НА., 2003; Хериет Э.Р.; ГаттерК.С, 1999; Полак Д., Ван Норден С, 1987).
Измерение интенсивности флуоресценции исследованных объектов, анализ гистологических препаратов проводили с помощью компьютерной программы ImageScope Color (ООО «Системы для микроскопии и анализа», Россия).