Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема биологической фиксации молекулярного азота является одной из актуальных в сельскохозяйственной биологии и напрямую связана с урожайностью важнейших кормовых культур - бобовых растений. Значительным резервом для повышения ее эффективности служит направленное конструирование штаммов тех микроорганизмов, которые непосредственно обеспечивают растений-хозяев фиксированным азотом. К числу таких микроорганизмов, в частности, относятся бактерия Rhizobium. aeliloti , вступающие в симбиоз с важнейшей кормовой культурой - люцерной. Однако, улучшение симбиотическях свойств этих микроорганизмов невозможно без тщательного генетического анализа всех факторен, обеспечивающих такой сложный молекулярный процесс, каким является симбяотичесяая азотфиксацяя. ..
В последнее время подобный генетический анализ стал проводится исключительно с использованием методов генной инженерии. Ключевой этап применения генно-инженерных методов в анализе,симбиотическях свойств клубеньковых бактерий - создание банка (библиотека) генов соответствующего штамма этих микроорганизмов. Наиболее популярными векторами для создания таких "библиотек" стали космиды, снонструированяне на основе плазмид, имеющих широкий спектр хозяев среди грамотряцательных бактерий. Использование космидных банков позволяет достаточно быстро провести клонирование индивидуальных генов, участвующих в контроле как культуральных, так я сим-биотических свойств клубеньковых бактерий. Такое клонирование, в свою очередь, может обеспечить возможность выяснения точной биохимической и физиологической роли соответствукщих^генов в развитии симбиоза с последующим их использовавшей для направленного конструирования итаммов с повышенным азотфихсирующим потенциалом.
Паль и задача исследования. Целью настоящей работы являлось создание банка генов Rhizobium aeliloti я использование ого в генетическом анализе азотфиксирувдего симбиоза с люцерной. В связи с этим в задачи работы входило:
-
Создать банк генов Rhizobium meliioti на основе космид-ного вектора рЬ№*5}
-
Клонировать фрагмент генома R. meliioti инсерция в кото-
\
рыЗ транспозона Та5 привела к утрате азотфяксирующей активности;
-
Клонировать фрагмент генома R. meliloti, содержащего ген биосинтеза лейцина, инсерщш в который транспозона їа5 привела к утрато способности формировать азотфиксирующий симбиоз с ящерной;
-
Выяснить связь между биосинтезом лейцина и симбиотичесяя-ми свойствами клубеньковых бактерий люцерны.
Научная новизна. Создав космидный банк генов штамма СИП Hbi-zobium meliloti. Провалено клонирование "кряптического" гена, участвующего в контроле азотфиксирущей активности, локализованного на мегаплазмиде шгаша GXMI Rbizobiun meliloti. Проведено клонирование гена, ответственного за биосинтез лейцина е показана его роль в развягиг азотфякоярующего симбиоза. Продемонстрирована сортовая и индивидуальная изменчивость растения-хозяина (лщерны) по способности вступать в симбиоз с использованным в работе аук-сотрофныы по лейцину мутантом R. meliloti. Показано, что эта изменчивость не обусловлена трофичесними потребностями в лейцине у аукоотрофного мутанта, что позволило выдвинуть предположение об участии генов биосинтеза лейцина или их молекулярных продуктов в экспрессии симбиотических свойств R. meliloti.
Практическая ценность. Полученный на основе космидного вектора рШК5 банк генов R.meliloti может быть успешно использован для молекулярно-генетического анализа симбиотических я культу-ральных свойств клубеньковых бактерий люцерны. Выявленная изменчивость растения-хозяина по способности вступать в симбиоз с ауксо-трофным по лейцину мутантом открывает перспективы для селекции люцерны о повышенной отзывчивостью на инокуляции клубеньковыми бактериями и, соответственно, обладающей более высоким азотфикоярую- ' щим потенциалом и.урожайностью.
Бее положения, изложенные в подразделах "Научная новизна" г "Практическая ценность", выносятся на официальную защиту.
Апробация работы. Материалы диссертапдЕ доложены на Всесоюзной конференции "Микроорганизмы - стимуляторы и ингибиторы роста растений и животных" (Ташкент, 1983), ва 1-ом Мэждународном конгресса "Симбиоз" (Иерусалим, 1991), на У1-ом Всесоюзном Биохимическом съезде (Санкт-Петербург, 1992), на УТ-ом съезде Узбекского республиканского общества генетиков и селекционеров (Ташкент,
1992). Диссертация обсуждена и одобрена на семинара лаборатории генетики и селекции Института сельскохозяйственной микробиологии (протокол № 65 от 29 апреля 1992 г.) и Ученым Советом Института микробиологии АН Узбекистана.
Публикации. По гзме диссертации опубликовано 8 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на /^.'1_ страницах машинописного текста и состоит из "Введения", "Обзора литературы", "Материалов и методов" исследования, одной глава содержащей "Результаты и обсуждение" проведенных исследований, "Заклга-чения" и "Выводов", содержит 16 рисунков я 8 таблиц. Список цитируемой литературы включает 9Э наименований, из которых 87 на английском языке.