Использование иммуноферментного анализа с применением моноклональных антител в исследовании иммуноглобулина Е и некоторых антигенов главного комплекса гистосовместимости человека Сердюк, Ольга Анатольевна

Введение к работе

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В связи с широкой распространенностью аллергических заболеваний особую актуальность приобретают методы их диагностики. В развитии аллергических процессов основную роль играют иммуноглобулины класса Е (IgE). Известно, что повыыанная концентрация IgE в крови является важным диагностическим признаком атонического характера заболевания," поэтому разработка пммуноферментных диагностякумов на основе моноклокальных антител (мкАт) для измерения концентрации обцего IgE в сыворотке крози детей и взрослых в настоящее время очень актуальна.

При разработке и внедрении в производство иммунодиагностикупов на обиий IgE возникает ряд проблем, касающихся общих принципов нк-муноферментного анализа - ИФА (стабильность компонентов, оптимизация параметроа иммукахимической и ферментативной реакции) и конкретных деталей (поиск надежных источников IgE для производства калибровочных стандартов, характеристика препаратов IgE из разных источников, стандартизация препаратов IgE, оценка влияния фрагментов IgE и анти-IgE аутоантител на определение уровня IgE ). Сочетание научного подхода с современными технологическими принципами позволяет разреиить зти проблемы и способствует дальнеяыему совершенствованию методов диагностики.

В последнее время появляется все больше подтверждений существования связи между регуляцией биосинтеза IgE в организме и системой главного комплекса гистосовместкмости (ГКГ) человека. Развитие биохимических методов анализа ахтигеиоа ГКГ с использованием мкАт и принципов ИФА, позволяющих получить- дополнительную информацию о структуре и свойствах антигенов ГКГ и способствуадсх более глубокому пониманию механизмов развития аллергических заболеваний тоже является актуальной задачей.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы является исследование иммуноглобулина Е и некоторых антигенов ГКГ человека с помощью иммуноформентных методов Я мкАт -я-разработка' на этой основе методов их анализа, пригодных для широкого клинического применения. При выполнении работы ставились следующие- задачи:

1. Разработка на основе мкАт серия IgE/IX педиатрического варианта иммунодиагностикума для измерения концентрации Іс,2 в газоротке крови а диапазоне 1-100 НЕ/мл.

- 2 -. 2. Разработка на основе мхАт' серии IgE/11 иммунодиагкостиху-мов, совместимых с технологией СП^иДИАплюс" для измерения концентра-ции IgE в разных диапазонах.

1. Получение калибровочных стандартов IgE с использованием препаратов IgE из разных источников.

2. Стабилизация компонентов разработанных диагностикумов и проверка их стабильности в разных режимах хранения.

5.Разработка методических подходов к анализу антигенов ГКГ человека с помощью электрофоретических методов с последующим иммуноб-лоттингом.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. В данной работа впервые в отечественной практике получека иммуноферментная тест-система на основе мо-ноклональных антител для измерения концентрации IgE в диапазоне 1-10Q МЕ/мл, предназначенная для педиатрии. Впервые разработан им-мунодиагкостикум на шариковых носителях, совместимый с технологией ^"ДНАплюс" вла измерения IgE в двух диапазонах - 1-100 и 25-1000 ИЕ/мл. Подобраны оптимальные условия иммунохимической реакции и изучено влияние различных факторов на результаты измерений концентрации IgE; изучена стабильность препаратов IgE н компонентов диаг-костихумов в разных режимах хранения с добавлением разных стабилизаторов и консервантов. Проведен анализ поликлонального IgE из разных источников. Показано присутствие анти-IgE аутоантител а препаратах поликлонального IgE и оценено их влияние на качество калибровочных стандартов. Разработаны подходы получения калибровочных стандартов IgE из препаратов миеломного, поликлонального и рекомби-накткога IgE к проведена их сравнительная оценка.

Разработан метод анализа некоторых антигенов ГКГ человека с помощь» иммунофермектных методов и мкАт после электрофоретического разделения белков в образце. Анализ ряда клеточных линии и лимфоцитов периферической крови человека с использованием мкАт ИС10 показал принципиальную возможность применения' даішого діодхода'для бистрого и точного выявления полиморфизма вкткгвков I класса HLA, а также для анализ» некоторых антигенов II класса. ''''

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ..Разработанная тест-система для измерения концентрации IgE а диапазоне 1-100 МЕ/мл проыла испытания'

в ГЙСЯ им.Тарасевича и в настоящее, время внедряется в производство для широкого клинического применения.

УтЕерждгны Технические условия на диагностикум "ИгЕ-ТЕСТ" н в настоящее время начинается его внедрение в производство на СП"ДИАя-люс".

Предложенные подходи получения калибровочных стандартов IgE используются- при производстве на СП^пДИАплюс^я тест-системы "ИгЕ-ИФА" на мнкротнтранионкых планшетах.

Разработанный метод анализа некоторых антигенов ГКГ человека используется в отделе иммуногенеткки Ин-та Иммунологии Минздрава СССР.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ КА ЗАЩИТУ: 1.Разработка на основе мкАт серии IgE/11 педиатрического варианта иммунодвагностикума для измерения концентрации- IgE в сыворотке крови в диапазоне 1-100 МЕ/мл. 2.Разработка на основе мкАт серии IgE/11 нммунодиагностикумай, сов*-меетимых с технологией СП"ДИАплюс^н для измерения концентрации IgE в разных диапазонах. 3.Получение калибровочных стандартов IgE с использованием препаратов IgE из разных источников. 4. Стабилизация компонентов разработанных диагностикумов. 5. Метод анализа полиморфизма антигенов ГКГ человека с помощью электрофоретических методов с последующий иммуноблоттингом.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Диссертация апробирована 20 ноября 1991 г. на коллоквиуме отдела медицинских диагностикумов і:ПО^яБиотехі:ологня^и Материалы диссертации были представлены иа Всесоюзное конференции "Генная н клеточная инженерия в реиении фундаментальных проблем биотехнологии" (Тарту, 1988), на II Всесоюзное конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов" (Москва, 1990), на Международном симпозиума по аллергик х клинической иммунологии "Regulation and Clinical Significance of IgE", (Москва, 1990), на XIV Международном конгрессе по аллергологии н клинической иммунологии. (Киото, 1991) .

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 15 работ.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа состоит яэ введения, обзора литературы, экспериментальной частя, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включавшего 238 работ. Работа изложена на 145 страницах, содержит 21 рисунок и 14 таблиц.