Введение к работе
Актуальность работы. Для нормального функционирования человеческого организма необходимо введение в состав питания углеводных компонентов. В нашей стране традиционно основным элементом углеводного питания является сахар. Потребность в данном продукте ежегодно возрастает. Сырьевая база и мощности сахарной промышленности нуждаются в постоянном расширении в связи с необходимостью покрытия потребностей в сахаристом продукте. В настоящее время ведутся поиски как более дешевых источников сырья, необходимого для производства подсластителей, так и различных заменителей сахара. Уже получены подстластители, имеющие белковую (аспартам) и углеводную (глюкозо-фруктозный сироп (ГФС), инвертный сахар, кристаллическая глюкоза) природу. ГФС по своим медико-биологическим и технологическим свойствам значительно превосходит традиционно используемый сахар: он менее калориен, в меньшей степени способствует образованию кариеса, при производстве кондитерских изделий не требует предварительного растворения, при хранении джемы и повидла, содержащие ГФС, долго не засахариваются.
За рубежом, в странах с высокоразвитой экономикой, предложены технологии получения ГФС. Сырьем для получения ГФС служит крахмал, подвергаемый обработке с помощью ферментов ос-амилазы, глюкоамилазы, изоамилазы и глюкозоизомеразы (ГлИ). В нашей стране существуют отлаженные производства первых трех ферментов. Для получения ГлИ промышленных аналогов нет.
ГлИ - фермент, катализирующий реакцию изомеризации глюкозы во фруктозу. Данная стадия лимитирует процесс получения ГФС в целом. ГлИ - фермент продуцируемый микроорганизмами. Это в подавляющем большинстве случаев эндофермент. За рубежом предлагаются технологии, включающие как использование фермента различной степени очистки, так и использование интакт-ных клеток микроорганизмов. В основном исследования направлены на оптимизацию питательных сред, разработку щадящих методов выделения и очистки фермента, создание генетически сконструированных высокопродуктивных штаммов. Последние два перечисленных пункта дорогостоящи, к тому же мутантные штаммы не устойчивы и через несколько пассажей происходит реверсия, при иммобилизации может значительно теряться активность фермента. Однако известны другие методы воздействия на культуры-продуценты с целью повышения их продуктивности, включающие использование различных физических факторов и химических агентов.
В связи с отсутствием в стране производства ГлИ представляет интерес поиск новых микроорганизмов, обладающих достаточ-
ной ГлИ активностью, использование различных добавок для повышения продуктивности штаммов-продуцентов ГлИ, разработка принципиальной технологии получения ферментного препарата ГлИ
Работа выполнена в соответствии с межвузовской научно-технической программой «Биотехнология», направление «Промышленный биосинтез и биотрансформация», а также в соответствии с научно-технической программой «Конверсия». Целью работы является выбор штамма микроорганизмов, обладающего достаточной ГлИ активностью, соизмеримой с уже используемыми промышленными штаммами-продуцентами ГлИ, а также последующая интенсификация продуктивности штамма в отноше-' нии ГлИ активности воздействием неионогенных поверхностно-активных веществ (нПАВ) и хелатирующих агентов, исследование влияния хелатирующих агентов на транспорт;Са2+, Na\ К* в клетках Streptomyces rubiginosus Ac 836, разработка принципиальной технологической схемы получения ферментного препарата ГлИ. Научная новизна. Исследовано воздействие твинов и хелатирующих агентов на рост, и ГлИ активность стрептрмицетов. ''-"' Обнаружено,-что/использованные добавки, несмотря на их различную химическую природу,.оказывают воздействие на клеточные оболочки стрептомицетоа,;что проявляется в изменении ГлИ активности; концентрации биомассы и транспорта Qa2\ Na+, К*. Это, в свою очередь, приводит к изменению метаболизма в целом. Поэтому данные химические соединения могут рассматриваться в качестве косвенных регуляторов клеточного метаболизма.
Впервые показано изменение трансмембранного транспорта ионов металлов: Са2*, Na*. К* в присутствии хелатирующих агентов в клетках стрептомицетов.
Практическая значимость работы. В результате исследований
был выбран штрамм Streptomyces rubiginosus Ac 836, обладающий
ГлИ активностью, сравнимой с описанными в литературе продуцен
тами фермента. Показано, что при использовании добавок (твина-
40, твина-80, этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), гидро-
ксиэтилидендифосфоновой кислоты (ГОЭДФК), этиленгликоль-бис-
(Р-аминоэтиловый эфир)Ы,М^',Ы'тетрауксусной кислоты (ЭГТА)) в
оптимальных концентрациях ГлИ активность исследуемых стрепто
мицетов значительно повышается и находится на уровне известных
промышленных зарубежных штаммов.
'; Продемонстрирована возможность использования добавок:
: - твина-40, ГОЭДФК, в оптимальных концентрациях для получения высокоактивных ферментных препаратов ГлИ.
Предложена принципиальная технологическая схема получения ферментного препарата ГлИ с использованием добавок.
Апробация работы. Основные положения диссертационной ! работы доложены на ежегодных отчетных конференциях КГТУ
(1991-1997), на IV, VII, VIII Межреспубликанских конференциях «Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений» (Казань, 1991,1994,1996), на Международной конференции «Прогрессивные технологии и техника в пищевой промышленности» (Краснодар, 1994), на IX Международной конференции «МКХТ-1995» (Москва, 1995), на Межрегиональной конференции «Пищевая промышленность-2000» (Казань, 1996). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ. Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания методик исследования, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на W страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц, 36 рисунков. Список литературы включает 185 источников.
Объектом исследований служили дрожжевые и бактериальные штаммы микроорганизмов. Среди них 3 штамма, относящихся к роду Candida, 8 - к роду Saccharomyces, а также бактериальные штаммы: Arthrobacter sp., Lactobacillus plantarum В 578, Streptomyces fradiae Ac 778, Streptomyces rubiginosus Ac 836. Культивирование микроорганизмов осуществлялось периодическим способом в соответствии с технологическим регламентом.
В качестве добавок использовали нПАВ: твин-40 и твин-80, хе-латирующие агенты ЭГТА, ЭДТА, ГОЭДФК. Все используемые добавки вносили в виде водных растворов. Контролем служили клетки, выращенные в аналогичных опытным условиях без добавок.
Концентрацию биомассы определяли весовым методом, концентрацию белка - по методу Лоури, а ГлИ активность оценивали по количеству фруктозы, определяемой спиртово-резорциновым методом. При изучении транспорта Са2+ в клетки стрептомицетов использовали изотоп 45Са2+ концентрацию вышедших Na+, К* из клеток стрептомицетов определяли на пламенном фотометре ПФМ-4 А (ГДР).
При статистической оценке экспериментальных данных использовали параметрический критерий Стьюдента.