Введение к работе
Актуальность проблемы. Современная лекарственная терапия базируется на индивидуальном подборе дозы препарата для каждого пациента на основе данных лекарственного мониторинга. Лекарственный мониторинг необходим прежде всего для длительно применяемых препаратов с низким терапевтическим индексом и серьезными побочными эффектами. Одним из центральных объектов лекарственного мониторинга является противо/астматический препарат теофиллин (1,3-диметилксан-тин). Концентрация теофиллина в крови в настоящее время измеряется преимущественно с помощью иммуноаналитических методов. Для этих методов необходимы антитела, обладающие высокой специфичностью и аффинностью к теофиллину. К моменту начала этой работы антитела, полностью соответствующие этим требованиям, получены не были. Поэтому актуальной задачей являлось получение антител к теофиллину с необходимыми характеристиками. Эту. задачу можно было решить .;:jk традиционными методами так и методами гибридомной технологии.
Современная диагностика развивается в двух направлениях: разработка методов, пригодных для проведения массовых исследований в условиях крупных диагностических центров, и создание' методов для визуальной экспресс-диагностики в нелабораторных условиях, поэтому нам представлялось актуальным создание на основе полученных антител иммуноаналитических систем обоих типов.
Целью данной работы является получение высокоаффинных и высокоспецифичных антител к теофиллину и разработка на их основе коли-.чественных иммуноаналитических методов, применимых для лекарственного мониторинга теофиллина.
Научная новизна. Разработаны методы синтеза новых конъюгиро-.ванных антигенов теофиллина с белковыми носителями. Изучено влия-'ние структуры конъюгатов на специфичность и аффинность образующихся антител, обнаружена уникальная пара конъюгатов для иммунизации животных и тестирования антител в. твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА). Установлено, что данные антигены позволяют получать ^поликлоналыше антитела (пкАт) к теофиллину с улучшенной специфич-'ностью'и аффинностью. Структуры конъюгатов защищены авторским свидетельством на изобретение.
Впервые получены высокоаффинные и специфичные моноклональные антитела (мкАт) к теофиллину.
Разработан оригинальный иммунометрический метод анализа теофиллина в сыворотке крови на основе как поли-, так моноклональных антител, который защищен авторским свидетельством на изобретение.
- 2 -Предложен ряд методов, основанных на прямом конкурентном ИФА теофиллина. Исследованы способы синтеза коныогатов теофиллина с ферментами и установлена связь между их структурой и активностью.
На основе мкАт к теофиллину разработан новый метод анализа теофиллина, использующий принцип быстрой фильтрации иммунореагентов через мембрану с иммобилизованным антигеном.
Практическая значимость. Для измерения концентрации теофиллина в мире разрабатывается и производится большое количество диагностических систем, однако в нашей стране до настоящего времени подобные тест-системы не выпускались. В данной работе впервые в нашей стране поставлена задача разработки современных иммунофэрмент-ных методов анализа теофиллина. Работа проводилась в рамках исследований, предусмотренных Государственным планом N 1891-5562-02, теш N 8СЮ. 02.
Нами впервые создана высокоэффективная тест-система "Тео-тест" для изменения концентрации теофиллина, которая прошла испытания в клинике. В настоящее время идет подготовка к ее производству на СП"Диаплюс" для широкого клинического применения.
Впервые предложен удобный неинструментальный экспресс-метод анализе- концентрации теофиллина в крови пациентов.
Положения выносимые на защиту: I. Разработка методов получения поли- и моноклональных антител к теофиллину. 2. Разработка конкурентных твердофазных ИФА теофиллина. 3. Разработка метода иммуно-фильтрации для экспресс-диагностики теофиллина.
Апробация работы. Диссертация .апробирована 6 мая 1392г.'на Коллоквиуме отдела медицинских диагностикумов НПО "Биотехнологии". Материалы диссертации представлялись на: II Всесоюзной конференции по фармакокинетике "Фармакокинетические исследования при создании и применении . лекарственных средств" г. Каунас 1987г., конференции "Современные направления развития биотехнологии" г. Москва 1991г.
Публикация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано, 7 работ, получено 2 авторских свидетельства.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литература Диссертационная работа изложена на 166 страницах машинописного текста, включая 10 таблиц и 41 рисунок. Список литературы содержит 1.42 источника.