Введение к работе
Актуальность темы. Производство ферментных препаратов является
одним из перспективных направлений современной биотехнологии.
Ферментные препараты широко используются во многих отраслях
промышленности: медицинской, микробиологической, парфюмерной,
сельскохозяйственной и других. Особое значение в настоящее время
приобретает получение лекарственных средств на основе ферментов из
животного сырья, которые могут успешно заменить препараты
аналогичного действия, производимые химическим и
микробиологическим синтезом.
Гидролитические ферменты из поджелудочной железы крупного рогатого скота - рибонуклеаза (РНК-аза), дезоксирибонуклеаза (ДНК-аза), трипсин и химотрипсин - обладают выраженным противовоспалительным действием и эффективны при лечении различных гнойно-воспалительных процессов. Кроме того, нуклеазы являются природными регуляторами механизма противовирусной зашиты, что позволяет рекомендовать их для лечения и профилактики вирусных инфекций. Использование гидролитических ферментов в медицинской практике в виде внутримышечных и, в особенности, внутривенных инъекций предполагает высокую степень очистки.
Ужесточение требований к качеству лекарственных препаратов требует создания новых подходов к технологии их выделения и очистки. В настоящее время на производстве медицинских препаратов ОАО «Самсон» для получения панкреатических ферментов используется сорбционный метод выделения ферментов из экстракта поджелудочной железы крупного рогатого скота на сульфокатионите КУ-23. Однако, дальнейшее разделение ферментов проводят путем дробного фракционирования сульфатом аммония, в результате которого происходит соосаждение белков, что является причиной гетерогенности получаемых препаратов. Помимо этого, последующая индивидуальная доочистка каждого из ферментов многостадийна и осуществляется такими малоэффективными методами, как высаливание, диализ, осаждение органическими растворителями с последующим обессоливанием. Использование этих методов не обеспечивает получения препаратов высокого качества. Поэтому, их замена на высокоэффективные, легко масштабируемые хроматографические методы является актуальной задачей при совершенствовании методов выделения и очистки ферментов. Цели и задачи исследования. Целью работы являлось изучение закономерностей сорбции панкреатических ферментов на молекулярных и ионогенных носителях различной структуры и разработка на их основе хроматографического способа очистки.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Изучение равновесных, термодинамических и кинетических закономерностей сорбции ферментов на различных хроматографических носителях и выбор оптимального сорбента для препаративной хроматографии.
-
Теоретическое обоснование условий разделения компонентов смеси; оптимизация хроматографического процесса по скорости подвижной фазы.
-
Выбор оптимальных физико-химических условий селективной элюции.
-
Масштабирование хроматографического процесса очистки для полупроизводственных условий.
Научная новизна. Впервые изучены равновесные и кинетические
параметры сорбции панкреатических ферментов модифицированными и
сверхсшитыми полистирольными сорбентами. Установлен
преобладающий вклад гидрофобных взаимодействий в изменение свободной энергии процесса при связывании сверхсшитых носителей Стиросорб с ферментами, что учтено при выборе физико-химических условий селективной элюции. Изучено влияние скорости подвижной фазы на процессы хроматографического разделения ферментов из многокомпонентных смесей. Проведен теоретический анализ условий оптимизации разделения в двухкомпонентной системе и предложена модель, позволяющая прогнозировать оптимальную скорость хроматографического процесса, при которой возможно максимальное разделение компонентов или изменение порядка их выхода из хроматографической колонки в зависимости от соотношений между равновесно-кинетическими параметрами. Впервые осуществлена хроматографическая очистка РНК-азы на сверхсшитом сорбенте Стиросорб.
Практическая значимость. На основании проведенных теоретических и экспериментальных исследований предложен эффективный масштабируемый способ очистки РНК-азы, исключающий недостатки известной схемы очистки фермента и позволяющий увеличить выход целевого продукта, сократить время технологического цикла процесса получения фермента и повысить удельную активность препарата. Предложенный способ апробирован в цехе ферментных препаратов ПМП ОАО «Самсон» (Акт апробации от 12.12.98). Получено положительное решение о выдаче патента РФ по заявке № 98122253/13 от 7.12.98 на "Способ очистки рибонуклеазы".
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на Международной конференции «Фармация в 21 веке: традиции и инновации» (Санкт-Петербург,1999), на Всероссийском симпозиуме по химии поверхности, адсорбции и хроматографии (Москва, 1999), на Республиканской научно-медицинской конференции молодых ученых (Самара, 1999).
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Высокая селективность сорбции панкреатических ферментов новыми сверхсшитыми сорбентами Стиросорб обусловлена преимущественно гидрофобными взаимодействиями.
-
Модель оптимизации хроматографического разделения в двухкомпонентной системе по скорости подвижной фазы. Экспериментальное доказательство модели при разделении РНК-азы и ДНК-азы.
-
Новый способ хроматографической очистки РНК-азы из производственного высола фермента с использованием сверхсшитого сорбента Стиросорб.
Публикации: По теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 1 патент.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, экспериментальных данных и их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 159 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 124 страницах, содержит 17 таблиц, 33 рисунка.