Содержание к диссертации
Введение
2 Обзор литературы 14
2.1 Биологическая характеристика возбудителя рожи свиней 14
2.1.1 Открытие Erysipelothrix rhusiopathiae 14
2.1.2 Распространение рожи свиней 15
2.1.3 Систематическое положение 16
2.1.4 Строение микробной клетки Erysipelothrix rhusiopathiae 16
2.1.5 Морфологические и тинкториальные свойства 17
2.1.6 Культуральные свойства 18
2.1.7 Биохимические свойства 19
2.1.8 Антигенная структура 19
2.1.9 Устойчивость 20
2.1.10 Активность и специфичность штаммов возбудителя рожи свиней 21
2.1.11 Эпизоотологические данные 23
2.2 Клинические признаки 24
2.3 Иммунитет 27
2.4 Лечение рожи свиней 27
2.4. Средства и методы профилактики рожи свиней 31
2.4.1 Вакцины 31
2.4.2 Гипериммунная противорожистая сыворотка 33
2.5 Технологические аспекты производства гипериммунных сывороток крови животных 34
2.6 Системы обеспечения качества лечебных и иммунологических препаратов 40
Собственные исследования 48
3 Материалы и методы 48
3.1 Материалы 48
3.1.1 Штаммы микроорганизмов 48
3.1.2. Контроль штаммов бактерий рожи свиней. 49
3.1.3. Средства терапии 54
3.1.4. Реактивы. 54
3.1.5. Лабораторная посуда 55
3.1.6. Лабораторное оборудование. 55
3.1.7. Реакторы. 55
3.2 Методы 56
3.2.1 Приготовление перевара Хоттингера (ПХ). 56
3.2.2 Приготовление бульона Хоттингера. 56
3.2.3 Изготовление и контроль главного и рабочего банков бактерий рожи свиней. 57
3.2.4 Изготовление посевного материала (ПМ) 59
3.2.5 Культивирование микроорганизмов 59
3.2.6 Приготовление рожистого антигена 60
3.2.7 Отбор и подготовка животных–доноров к эксплуатации 62
3.2.8 Схема гипериммунизации волов-продуцентов 63
3.2.9 Схема обработки крови 64
3.2.10 Электрофорез гипериммунных сывороток крови в полиакриламидном геле 65
3.2.11 Контроль превентивной активности гипериммунной сыворотки против рожи свиней 68
3.2.12 Железосодержащий препарат (ЖСП) 68
3.2.13 Определение цитохромов 69
3.2.14 Иммуномодулирующее средство (ИМС) «Иммунофарм» 69
3.2.15 Статистика 70
Результаты исследований 71
4 Совершенствование технологии производства и обеспечения качества сыворотки против рожи свиней 71
4.1. Оптимизация и стандартизация технологии производства гидролизатных питательных сред 71
4.2 Совершенствование и стандартизация технологии производства и обеспечение качества антигена против рожи свиней 80
4.2.1 Характеристика и паспортизация штаммов для изготовления и контроля активности рожистого антигена 81
4.2.2 Совершенствование и оптимизация технологических процессов культивирования бактерий рожи свиней 84
4.2.3 Влияние железосодержащего препарата «Пептофер» на эффективность культивирования бактерий рожи свиней 91
4.2.4 Масштабирование производства и обеспечение качества антигена бактерий рожи свиней 95
4.3 Совершенствование технологии производства и обеспечение качества сыворотки против рожи свиней 102
4.4 Система обеспечения качества серийного производства сыворотки против рожи свиней 118
4.5 Технико-экономическое обоснование инноваций в технологии производства и обеспечения качества сыворотки против рожи свиней 128
4.6 Лечебная и профилактическая эффективность сыворотки против рожи свиней 134
5 Обсуждение результатов 140
6 Выводы 147
7 Практические предложения 149
8 Список литературы 150
9 Приложения 182
- Системы обеспечения качества лечебных и иммунологических препаратов
- Электрофорез гипериммунных сывороток крови в полиакриламидном геле
- Совершенствование и оптимизация технологических процессов культивирования бактерий рожи свиней
- Лечебная и профилактическая эффективность сыворотки против рожи свиней
Введение к работе
1.1 Актуальность темы. Рожа свиней – это септическое антропозоонозное
заболевание свиней, особенно молодняка, которое характеризуется лихорадкой,
септицемией и воспалительной эритемой кожи, а при хроническом течении -
эндокардитом и артритами. Рожу свиней считают наиболее распространенным
заболеванием особенно опасным для поросят, которое регистрируется практически во
всех европейских странах, а также в США, Канаде, Японии, Корее и многих других
государствах, причиняя значительный экономический ущерб свиноводству, который
слагается из убытков от гибели, вынужденного убоя и расходов, связанных с введением
ограничений, лечением и массовой иммунизацией животных.
Возбудитель рожи (Erysipelothrix insidiosa, E. rhusiopathiae) относится к убиквитарным микроорганизмам. Он обнаруживается в организме клинически здоровых свиней в миндалинах, кишечнике, желчном пузыре, у грызунов и насекомоядных, рыбах, клещах, а также выделен из различных органических субстратов (речного ила, городских сточных вод) и многих других источников).
Для профилактики и лечения рожи свиней предложен широкий спектр иммунобиологических и химиотерапевтических препаратов, а также лечебных сывороток крови, которые достаточно эффективны, не утратили своей значимости и востребованы практикой. Это обусловлено тем, что, несмотря на активную профилактику болезни с помощью живых и инактивированных вакцин, рожа свиней постоянно регистрируется в свиноводческих хозяйствах РФ и зарубежных стран. Отмечено также, что технология изготовления сыворотки крови является чрезвычайно трудоемкой, сложной и не соответствует требованиям международных стандартов, что послужило основанием для совершенствования и стандартизации средств и методов для получения более эффективного препарата. В последние годы рядом авторов предложена усовершенствованная технология получения гипериммунной сыворотки крови против рожи свиней на волах-продуцентах, которая запатентована, но не внедрена в производство. Поэтому исследования, направленные на разработку и совершенствование технологии серийного производства и обеспечения качества лечебного препарата для профилактики и лечения, являются весьма актуальными и востребованными практикой.
При разработке и внедрении в практику более эффективной технологии производства сыворотки против рожи свиней на волах продуцентах возник целый ряд научных и технологических проблем, которые решались в данной работе.
1.2 Степень разработанности проблемы. Проблеме производства и контроля
качества гипериммунных сывороток крови, предназначенных для профилактики и
лечения заболеваний сельскохозяйственных животных вирусной и бактериальной
этиологии посвящено большое количество работ [Бургасов П.М., 1978; Медведев А.П.,
Вербицкий А.А., 2001; Русанов В.М., Левин И.Н., 2004; Медведев А.П., 2007; Сусский
Е.В. и др., 2013].
На данном этапе биологическая промышленность изготавливает более 16 видов моно- и поливалентных сывороток крови, в том числе против рожи свиней, технология производства которых несовершенна и не отвечает современным требованиям. Для повышения качества и эффективности производства гипериммунных сывороток крови животных рекомендуется использовать современное оборудование и оптимальные технологические решения при получении антигенов, оптимизации процессов
подготовки, гипериммунизации и эксплуатации животных-доноров с учетом требований «Системы обеспечения качества», правил GMP и ГОСТ Р 52249-09.
Необходимо также учитывать требования практики в более активных сыворотках крови против рожи свиней и обязательно применять в производстве «Систему посевных материалов» - Seed Lot System [Производство лекарств по GMP, [Рубан Е.А. и др., 2006; Губин П.Н., 2011; Сусский Е.В. и др. 2013].
Системный подход при изготовлении гипериммунных сывороток, в том числе против рожи свиней, не получил широкого применения на практике, поэтому исследования, направленные на изучение потребностей, метаболизма и более эффективного размножения микроорганизма, а также поиска иммуномодулирующих средств, повышающих активность целевого продукта, являются актуальными и востребованными практикой. При реализации этих задач предусматривается решение широкого спектра научных и технологических проблем, в том числе повышение активности, эффективности и конкурентоспособности лечебных сывороток, как на отечественном, так и международном рынках. Поэтому разработка и внедрение в практику указанных инноваций является приоритетной задачей биопредприятия при серийном производстве сыворотки против рожи свиней.
1.3 Цель и задачи исследований. Цель работы - совершенствование технологии промышленного производства и обеспечение качества сыворотки крови против рожи свиней.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
- разработать технологические схемы серийного производства исходных
материалов и гипериммунной сыворотки против рожи свиней;
определить эффективные условия культивирования рожистых бактерий;
оценить влияние и эффективность железосодержащего препарата «Пептофер» на интенсивность размножения рожистых бактерий стационарным и периодическим способами;
- внедрить разработанные методы и процессы изготовления бактериального
антигена в технологию производства;
- обосновать возможность и перспективность применения иммуно-
модулирующего средства «Иммунофарм» для повышения активности сыворотки против
рожи свиней;
- разработать эффективную схему гипериммунизации и эксплуатации волов –
продуцентов;
- экономически обосновать замену свиней - на волов-продуцентов при
изготовлении сыворотки против рожи свиней;
- реализовать на практике систему обеспечения качества и эффективности
производства гипериммунной сыворотки против рожи свиней.
Практическое решение указанных проблем позволит реализовать на практике эффективную схему получения гипериммунной сыворотки против рожи свиней с максимальными титрами специфических антител в промышленном масштабе.
1.4 Научная новизна.
Научно обоснован единый подход к усовершенствованию технологических
процессов производства и обеспечения качества сыворотки против рожи свиней в соответствии с требованиями ИСО серии 9000, правил GMP и ГОСТ 52249-2009.
- Разработаны и стандартизированы технологические процессы изготовления и
контроля качества исходных штаммов и питательных сред со стимулирующими
добавками.
- Определены эффективные технологические параметры стационарного и
периодического способов культивирования, позволяющих существенно
интенсифицировать процессы размножения, сократить время, повысить уровень
накопления и жизнеспособность рожистых бактерий.
- Научно обосновано применение железосодержащего препарата «Пептофер» для
интенсификации процессов размножения и повышения уровня накопления рожистых
бактерий.
- Впервые для повышения эффективности процессов подготовки,
гипериммунизации и эксплуатации волов - продуцентов предложен препарат
«Иммунофарм», обеспечивающий стимуляцию процессов антителообразования и
повышения активности сыворотки против рожи свиней.
- Усовершенствованы технологические процессы производства и система
обеспечения качества сыворотки против рожи свиней.
1.5 Теоретическая и практическая значимость работы.
- Усовершенствована и экономически обоснована технология серийного
производства активной сыворотки для профилактики и лечения рожи свиней.
Разработаны эффективные условия периодического культивирования рожистых бактерий и требования к качеству антигена для гипериммунизации животных-продуцентов.
Доказано стимулирующее влияние железосодержащего препарата «Пептофер» на интенсивность размножения и уровень накопления бактерий рожи стационарным и периодическим способами.
Реализовано масштабирование процессов культивирования рожистых бактерий и определены требования к качеству антигена для гипериммунизации животных-продуцентов.
- Экспериментально и экономически обоснована замена свиней на волов-
продуцентов, предназначенных для получения сыворотки против рожи свиней.
Определена схема и эффективность применения иммуномодулирующего препарата «Иммунофарм» для повышения активности сыворотки против рожи свиней.
Внедрены в производство «Система обеспечения качества» лечебной сыворотки против рожи свиней и «Система посевных материалов» (Seed Lot System) в соответствии с требованиями стандартов ГОСТ ИСО 9001-2011, правил GLP, GMP и ГОСТ 52249-2009.
Отработана и внедрена в производство «Система менеджмента качества» гипериммунных сывороток крови животных с учетом требований стандарта ИСО серии 9000-2000.
Отработана и реализуется на практике «Система управления качеством» с использованием статистических методов контроля и соответствия активности лечебного препарата стандартным показателям технологических процессов производства сыворотки против рожи свиней.
- Для практического использования разработаны и внесены в НТД изменения в технологические процессы производства и методы контроля качества сыворотки против рожи свиней.
1.6 Методология и методы исследования
В экспериментальных исследованиях и производственной работе использовали
аттестованные в ВГНКИ штаммы бактерий рожи свиней № 1689 серотипа А, подтипа 1а,
№1329 серотипа А, подтипа 1в и № 1933 серотипа В, подтипа 2а и контрольный штамм
№ 149., питательные среды, реактивы, лабораторное и промышленное оборудование, а
также бактериологические, серологические и некоторые другие методы исследований,
необходимые для изготовления, контроля и применения на практике гипериммунной
сыворотки крови против рожи свиней. Разработке и совершенствованию были
подвергнуты биотехнологические процессы по производству гидролизатных
питательных сред, по масштабированию условий культивирования рожистых бактерий, а также оптимизации схемы гипериммунизации и эксплуатации доноров и контроля активности сывороток крови в соответствии с требованиями GMP. В работе представлены материалы по внедрению в практику системы менеджмента качества, оценки стабильности и коррекции технологических процессов производства и доставки целевого продукта потребителю в системе «Холодовой цепи».
Производственные штаммы бактерий рожи свиней в ампулах в
лиофилизированном состоянии с паспортами изготовлены на биопредприятии и контролировались комиссионно по культурально-морфологическим и биохимическим показателям, концентрации, жизнеспособности и вирулентности микроорганизмов, а также определяли их серотиповую принадлежность и иммуногенность.
Культивирование бактерий рожи свиней осуществляли стационарным методом в
стеклянных бутылях объемом 0,5, 5,0 и 20 л или периодическим способом в
биореакторе «Арт Лайф Техно» объемом 200 л и биореакторе «Торнадо» объемом 200 л.
Реакторы заполняли на 2/3 объема бульона Хоттингера, затем вносили посевной
материал микроорганизмов из расчета 10 % к объему питательной среды и выращивали
в течение 10 12 ч при постоянном перемешивании, температуре (36 ± 0,5) 0С и рабочем
давлении 0,1 МПа. Концентрацию микроорганизмов оценивали по стандарту
мутности ГИСК им. Тарасевича или турбидиметрически на фотоэлектроколориметре КФК-1-ХЛ-42, морфологию – микроскопией мазков, окрашенных по Граму.
Ростовой потенциал питательных сред и физиологическую активность бактерий оценивали графическим методом по продолжительности фаз приспособления (tлаг) и логарифмического роста (tлог), максимальной удельной скорости роста (max) бактерий и времени одной генерации (gмин) в процессе периодического культивирования и уровню накопления микроорганизмов (Исаева З.А. и др., 1980).
Для серийного изготовления гидролизатных питательных сред использовали фарш говядины или конины, а также отходы (форменные элементы крови, фибрин, отварной фарш) сывороточного производства. Ферментативный гидролиз белоксодержащих материалов осуществляли при температуре (40±2) 0С и рН 7,8-8,0 в течение 5-6 суток в зависимости от метаболизма микроорганизмов. Биохимические показатели перевара и бульона Хоттингера, рН, содержание общего, белкового и аминного азота, аминокислот, пептона, триптофана оценивали с использованием общепринятых методов (Караваев Б.Е. и др., 1989; Доссон Р. и др., 1991); суммарное содержание пептидов – по биуретовой
реакции (Телишевская Л.Я., 2000); пептидных фракций - методом гельфильтрации в геле сефадекса G-15 на колонках 60х2,6 см и ультрафильтрации на установке «Амикон», оснащенной ультрафильтрами с разрешением 5000 и 1000 D (Телишевская Л.Я., 1995).
Изготовление антигена из бактерий рожи свиней осуществлялось стационарным и периодическим способом. Контроль в обоих случаях проводился на отсутствие контаминации посторонней микрофлорой и накопление живых бактерий рожи свиней.
Превентивную активность сыворотки крови против рожи свиней оценивали на белых мышах массой 18-20 г и морских свинках массой 300-350 г. Сыворотки вводили подкожно в дозах 1,0; 0,5; 0,25; 0,125; 0,0625 см3 объемом 0,5 см3 на физиологическом растворе, используя не менее 20 мышей и 10 морских свинок на дозу. А также превентивную активность проверяли в остром опыте на поросятах, полученных от не вакцинированных животных. С этой целью клинически здоровым поросятам, изолированным от свиноматок непосредственно после рождения, вводили внутримышечно сыворотки, в дозах 2,0; 4,0; 8,0 см3, используя по 10 животных на дозу.
Для стимуляции роста бактерии рожи был использован комплексный препарат «Пептофер» производства ООО «БИО», содержащий в своем составе 3 % двухвалентного железа (Fe2+) с пептидами. Автоклавированный препарат вносили в состав бульона Хоттингера в концентрации 1% и оценивали стимулирующий эффект на процесс дыхания и накопление рожистых бактерий. Значимость ионов Fe2+ в интенсификации дыхательных процессов оценивали в бензидиновом тесте на цитохромы по ГОСТ 10444.11.
Для повышения эффективности гиппериммунизации валов-продуцентов
использовали иммуномодулирующее средство «Иммунофарм», отвечающий
требованиям патента РФ № 2146134.
Препарат представляет собой раствор формальдегида-муравьиного альдегида (по ГОСТ 1625-89, марки ФБМ ОКП 24 1731-0200) в 0,02% концентрации на физрастворе по ФС 42-2595-99. Препарат не токсичен, обладает выраженным иммуномодулирующим эффектом, не вызывает кумулятивного эффекта при длительном применении животным
в дозе 2~=~5 см3 и аттестован в ВГНКИ и для гипериммунизации животных-продуцентов.
Совершенствование технологии производства осуществлялось с учетом требований системы менеджмента качества (СМК) и правил GMP.
При решении этих задач были разработаны методы отбора волов-продуцентов с высокой иммунореактивностью, оптимизированы условия содержания, кормления и профилактики инфекционных заболеваний животных-доноров. Усовершенствованы методы изготовления, состав и активность антигенов, схемы подготовки, гипериммунизации и эксплуатации продуцентов сывороток крови. С использованием современного оборудования были определены технологические процессы изготовления, фасовки, укупорки, этикетировки и контроля активности поливалентных сывороток крови в соответствии с требованиями отечественных и международных стандартов.
«Сыворотка против рожи свиней» должна быть стерильной, безвредной, активной, не содержать контаминантов, обладать выраженным лечебным и профилактическим
эффектом. Контроль указанных показателей осуществляется в соответствии с требованиями СТО 00482849-0006-2006.
Стабильность технологических процессов производства сыворотки крови против рожи свиней оценивали с помощью контрольных карт Шухарта типа X для средних значений [ГОСТ Р 50779-42-99; Сакато Сиро, 1980; Михайлова Н.В., 1988]. Оценку точности и стабильности ТП производства СК осуществляли с использованием программ ЕХРО-32 (Beckman-Coulter, USA) и Multi Cycle (Phoenis Flow Systems, USA).
1.7 Положения диссертации, выносимые на защиту:
схема изготовления и контроля посевных материалов для серийного производства бактериальных антигенов;
параметры технологических процессов периодического культивирования рожистых бактерий;
- применение железосодержащего препарата «Пептофер» для повышения
эффективности производства рожистого антигена;
- усовершенствование схемы подготовки, гипериммунизации и эксплуатации животных
– продуцентов с использованием «Иммунофарма» при производстве сыворотки
против рожи свиней;
- система обеспечения качества с применением статистических методов контроля
исходного сырья, полуфабриката и готовой продукции и постоянный мониторинг
показателей технологических процессов и их коррекция при серийном производстве
сыворотки против рожи свиней;
- экономическая эффективность технологических инноваций при производстве
сыворотки против рожи свиней.
1.8 Степень достоверности и апробации результатов.
Результаты экспериментальной и производственной работы подвергали
статистической обработке с вычислением средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (m) и достоверность разницы (р) между средними величинами по методу Стьюдента-Фишера. Отличие сравниваемых показателей считали достоверными, если уровень вероятности не превышал р<0,05 [Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962; Лакин Г.Ф.,1990; Венедягин Г.В., 1973].
Усовершенствованные технологические решения реализованы на ФКП
«Армавирская биофабрика» при изготовлении и контроле исходных материалов, оптимизации условий периодического культивирования рожистых бактерий с использованием железосодержащего препарата «Пептофер», подготовке стандартного по активности антигена и совершенствования схемы подготовки, гипериммунизации и эксплуатации волов-продуцентов с применением препарата «Иммунофарм». Внедрение в практику указанных инноваций позволяет повысить активность и стандартность промышленных серий сыворотки против рожи свиней и их эффективность для профилактики и лечения заболевания животных. С учетом полученных результатов и требований GMP разработаны и подготовлены к утверждению изменения и дополнения в «Промышленный регламент на производство сыворотки против рожи свиней – ПР
00482849012-09» и Технические условия – «Сыворотка против рожи свиней – СТО
00484849-0006-2006».
Годовой экономический эффект от внедрения в практику указанных инноваций составил
3348233,18 рублей.
Расчеты и построение технологических графиков осуществляли с помощью пакета MICROSOFT OFFICE EXCEL 2010, построение технологических и аппаратурных схем – с помощью программы Microsoft Office VISIO 2010.
Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на Международной научно-практической конференции посвященной 95-летию ФКП «Армавирская биофабрика» - Россия, Армавир, 2016
1.9 Публикация материалов научных исследований По материалам диссертационной работы опубликованы 7 научных работ, в том числе 6 в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.
1.10. Соответствие диссертации паспорту научной специальности.
Результаты научных исследований соответствуют пунктам 2, 3 и 11 паспорта специальности 03.01.06 и пунктам 3, 9 и 14 паспорта специальности 06.02.02.
1.11 Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 191 страницах
машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных
исследований, включающих материалы и методы, результаты исследований, заключения,
выводов, практических предложений, списка литературы и приложения на 20 страницах.
Диссертация иллюстрирована 33 таблицами и 16 рисунками. Список литературы
включает 341 источник, из которых 233 отечественных и 108 зарубежных авторов. В
приложении представлены копии документов, подтверждающих достоверность
результатов работы, её научную и практическую значимость.
Системы обеспечения качества лечебных и иммунологических препаратов
Продукты строительства, техники, лечебных и иммунологических (ИБП) препаратов, предназначенных для реализации должны быть качественными и отвечать требованиям потребителя, это первостепенная задача производителей продукции. Фактически история ХIХ и ХХ веков – это путь к вершинам качества доступным древними мастерами, которая дала возможность построить систему и определить механизмы управлением качеством продукции при помощи экономических и административных решений, а также путем непрерывного улучшения качества, уменьшения вариаций ТП и исключения причин нарушающих стабильность процессов производства с обязательным использованием статистических методов контроля [71, 98, 111, 141, 167, 172].
Традиционные технологии изготовления и контроля активности лечебных и ИБП препаратов были несовершенными и не соответствовали современным требованиям, поэтому в течение последних десятилетий существенно возросли общие требования к активности, безопасности и конкурентоспособности конечного продукта.
Рыночная экономика и вступление Россиии во «Всемирную Торговую Организацию» (ВТО) требует не только модернизации, повышения эффективности и экономичности, оптимизации и стандартизации технологических процессов (ТП) производства, но и эффективных методов контроля качества СК, предназначенных для профилактики и лечения заболеваний животных вирусной и бактериальной этиологии [28, 40, 145, 152].
Технология производства гипериммунных СК животных достаточно сложный и многоступенчатый процесс, который представляет следующие этапы: подготовку воды очищенной (ВО) и воды для инъекций (ВИ) изготовление гидролизатных питательных сред (ГПС) отбор и селекцию штаммов микроорганизмов (М) и получение посевного материала (ПМ) культивирование микроорганизмов изготовление и стандартизацию живых и инактивированных антигенов заготовку, карантирование и гипериммунизацию животных – продуцентов последовательное получение цитратной крови, плазмы, сыворотки-сырца и её отстой стерилизацию, розлив, укупорку, маркировку и отгрузку готового продукта потребителю в “Системе холодовой цепи “. На каждом технологическом этапе производства гипериммунной СК предусмотрен обязательный контроль качества исходных материалов, полуфабрикатов и готового продукта по основным показателям качества [64, 73, 78, 99, 135, 154].
Научный и технический прогресс открывает широкие возможности для совершенствования и стандартизации ТП производства и повышения качества лечебных и иммунологических препаратов. Это стало возможно благодаря достижениям в биотехнологии, биохимии, вирусологии, бактериологии, генетики и генной инженерии, а также в результате развития и широкого использования в практике высокотехнологического оборудования, позволяющего стандартизовать стадии технологических процессов в соответствии с требованиями надлежащей производственной практики – GMP. Созданы и широко используются в практике биореакторы различного объема и назначения, оборудование для центрифугирования и различных видов фильтрации, установки для изготовления воды очищенной (ВЩ) и воды для инъекций (ВИ), а также стандартные по качеству питательные среды для выращивания бактерий и фасовочно-упаковочное оборудование [56, 135, 154, 206].
Особую значимость при разработке и совершенствовании технологических процессов изготовления высокоактивных СК животных приобретают вопросы отбора и паспортизации штаммов с наиболее выраженными антигенными свойствами, оптимизации условий периодического культивирования и оценки активности, а также поиска оптимальной схемы гипериммунизации и эксплуатации животных-доноров и технологического контроля критических этапов производства и качества конечного продукта с целью гармонизации их с международными стандартами [16].
Система обеспечения качества (СОК) – это комплекс мероприятий, способствующих повышению эффективности, безопасности и конкурентоспособности лечебных и ИБП, которые должы соответствовать требованиям или быть выше по качеству международных стандартов. Производство препаратов при этом должно осуществляться в соответствии с требованиями GMP, обеспечивающими гарантию качества целевого продукта на всех этапах технологического цикла при наличии законодательных актов, соблюдении порядка регистрации препаратов, лицензировании предприятий и изготовителей, оптовой и розничной торговли, наличии служб контроля, а также программ мониторинга неблагоприятных реакций при использовании ЛС [57, 21 193].
Обеспечение качества является соcтавной частью «Системы менеджмента качества» (СМК) предприятия, а стандарты ИСО серии 9000-2008 и правила GMP являются взаимодополняющими документами, определяющими построение и функционирование СМК производства с учетом международных требований по уровню безопасности и эффективности ЛС, основой которых являются высокий уровень исполнительной дисциплины персонала, документирование и валидация оборудования и ТП производства, контроль качества конечного продукта, работа с рекламациями, отзыв продукции и внутренний аудит [142, 163].
Управление качеством ЛС основывается на требованиях стандартов ИСО серии 9000-2008 и рекомендациях многочисленных исследователей [27, 36, 38, 97, 165, 189] и предусматривает:
- непрерывное обучение, профессионализм персонала и соблюдение гигиены в работе;
- использование специально спроектированных помещений различного класса чистоты, современного оборудования их валидация и ремонт;
- разработку НТД трех уровней, предусматривающих политику по обеспечению качества ЛС; спецификации, операционные инструкции и методы контроля исходных материалов, ТП и конечного продукта; оформление регулирующих документов (протоколы, отчеты), подтверждающих выполнение исследований и перспективы совершенствования производства;
- строгое соблюдение аттестованных методов производства и контроля качества исходных материалов, полупродуктов ПП и готовых форм ЛС на принципах GLP, GMP, GCP, а также в соответствии с требованиями ЕС и ВОЗ;
- анализ рисков и корректирующие действия по предотвращению использования некачественного сырья, материалов и нестандартных ТП;
- оптимизации условий изготовления, хранения и транспортировки готовых ЛС потребителю в «Системе холодовой цепи»;
- регистрацию результатов контроля качества и принятия решения по выпуску в практику тестируемых серий ЛС;
- проведение внутренних аудитов на предмет оценки соответствия деятельности предприятия требованиям внутренних и внешних НТД и оценки эффективности СОК, выявление несоответствий и проверка эффективности корректирующих действий.
Серийное производство ЛС надлежащего качества предполагает постоянный контроль и валидацию цикла. Их выявление чрезвычайно важно и рекомендуется осуществлять путем постоянного контроля и анализа рисков в критических контрольных точках (ККТ). Этот прием позволяет выявить наиболее характерные причины брака и принять экстренные меры по их предупреждению или устранению. В рамках производственного процесса наиболее часто риски выявляются при использовании исходного сырья и материалов, в производственных помещениях и при реализации ТП [21, 142].
Согласно ХАССП опасные факторы риска подразделяют на биологические, химические и физические. Для производства лечебных и ИБП наиболее значимыми являются биологические факторы риска, которые проще предотвратить, чем устранить. К ним относят вирусы – и микроорганизмы – контаминанты, а также персонал. Смежные участки с чистыми помещениями, технологические среды, вода, воздух, мойка и стерилизация посуды. Постоянный мониторинг результатов биологического контроля и документированная система обеспечения качества позволяют профилактировать контаминацию ЛС и эффективно управлять критическими параметрами производства, гарантируя выпуск безопасной и качественной продукции [21, 142, 146, 154].
Электрофорез гипериммунных сывороток крови в полиакриламидном геле
Структурный состав гипериммунной СК против рожи свиней (РС) анализировали методом электрофореза (ЭФ) в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГЭ), который традиционно используется в практике [83, 105]. Для этой цели использовали следующие растворы и буферные смеси:
- 30 % р-р акриламида – бисакриламида (29,2: 0,8);
- 9 % р-р персульфата аммония; - буферная смесь разделяющего геля для электрофореза белков: 10 мл 1,5 М
- трис (рН 8,8), 0,4 мл 10% р-ра додецилсульфата натрия (ДСН),
- дистиллированной воды12,4 мл
- буферная смесь концентрирующего геля для электрофореза белков: 8 мл 0,5 М Трис (рН 6,8), 0,3 мл 10% р-ра ДСН, 12 мл дистиллированной воды;
- раствор концентрирующего геля для электрофореза белков: 2,03 мл буферной смеси для концентрирующего геля, 0,6 мл 30% р-ра акриламида-бисакриламида (29,2: 0,8), 0,3 мл 0,9 % р-ра персульфата аммония; 0,004 мл ТЕМЕДа;
- раствор геля для электрофореза белков содержит: 5,7 мл буферной смеси для разделяющего геля, 3,3 мл 30% р-ра акриламида-бисакриламида (29,2:0,8), 1 мл 0,9 % р-ра персульфата аммония, 0,01 мл ТЕМЕДа;
- 5х ДСН-ПААГ буфер для белкового электрофореза (электрофореза: 15 г основного Триса, 72 г глицина, 5 г ДСН, дистиллированная вода – до 1 мл);
- 3х буфер для белковых проб (3 мл 0,5 М Трис (рН 6,8), 0,3 мл 0,2 М ЭДТА, 3 мл 10% ДСН, 0,3 мл бета-меркаптоэтанола, 2,4 мл глицерина, 0,1 г красителя ксиленцианола, 3 мл дистиллированной воды);
- окрашивающий раствор для белковых проб - 0,25 г Кумасси R-250, 0,5 г сульфата меди (пятиводного), 50 мл ледяной уксусной кислоты, 125 мл изопропанола, дистиллированная вода до 0,5 л);
- раствор для отмывки геля с белковыми пробами - 35 мл ледяной уксусной кислоты, 20 мл изопропанола, 20 г. ДЕАЕ-целлюлозы, дистиллированная вода до 0,5 л (таблица 7).
Специальное оборудование:
- аппарат для получения деионизированной воды высокой степени очистки Milli Q (Millipore);
- автоматические пипетки объемом на 0,5-20 мкл, 20-200 мкл, 100-1000 мкл (Gilson);
- комплект одноразовых наконечников к пипеткам (Gilson);
- одноразовые пробирки объемом 0,5 и 1,5 мл (Treff);
- вортекс для прибирок 1,5 мл (Eppendorf); - настольная микроцентрифуга (Eppendorf);
- настольный термостат (Eppendorf)
- источник питания Power Pac Basic Power Supply (Bio Rad, cat № 164-5050);
- аппарат для фореза в полиакриламидных гелях «Mini Protean Tetra Cell» (Bio Rad, cat, # 165-8025);
- видеосистема Molecular Imager GelDoc XR Systems (Bio Rad, cat. # 170-8171).
Документация геля проводилась с помощью прибора Molecular Imager Gel Doc XP Systems. Структурный состав белков гипериммунной СК против РС в полиакриломидном геле методом электрофореза оценивали по инструкции фирмы Bio Rad (cat. № 170-8171). Анализ и учет результатов контроля гипериммунных сывороток с помощью электрофореза по системе ДСН-ПАГЕ осуществляли по инструкции к прибору «Mini Protean Tetra Cell» (Bio Rad).
Совершенствование и оптимизация технологических процессов культивирования бактерий рожи свиней
Изучение и выбор оптимальных условий культивирования микроорганизмов представляет для практики несомненный интерес. Обоснование и выбор условий культивирования микроорганизмов, и в частности бактерий РС, основывается на анализе данных литературы [8, 193].
Определяющим фактором эффективного производства бактериальных антигенов являются: ростовой потенциал, доступность и себестоимость гидролизных ПС, которые, как правило, нестандартны по составу. В то же время питательные потребности и метаболизм различных видов микроорганизмов существенно различаются. Поэтому необходим индивидуальный подход к качеству исходного сырья, условиям гидролиза, составу ПС и условиям культивирования микроорганизмов [157].
Анализ производства ферментативных гидролизатов показал, что 49 производственных серий ПХ и БХ заметно отличились по физико-химическим показателям и ростовым свойствам, поэтому необходим индивидуальный подход к стандартизации условий гидролиза белоксодержащих материалов, составу ПС и режимам культивирования различных видов микроорганизмов. В частности, БР свиней гетеротрофны и для своего размножения требуют незаменимые аминокислоты, глюкозу, факторы роста, автолизат дрожжей, фибриновый триптон, аргининсодержащие пептиды с Мм более 1000 D. В результате сравнительных испытаний промышленных серий ПС, отличающихся по физико-химическим показателям, установлена прямая зависимость уровня накопления бактерий РС от концентрации АА. Максимальное накопление штамма 1933 при культивировании стационарным способом регистрировали в образцах БХ, содержащих не менее 150 мг % АА. Уменьшение АА ниже 150 мг% сопровождалось достоверным (р 0,05) снижением уровня накопления бактерий РС (табл. 15). Ростовой потенциал ПС на основе ПХ (контроль) и с добавлением гидролизатов белков крови-отходов сывороточного производства оценивали по физико-химическим показателям (табл. 16), пригодности и перспективности для глубинного культивирования бактерий рожи свиней.
Анализ экспериментальных данных свидетельствует о том, что гидролизаты из отходов сывороточного производства по основным физико-химическим показателям существенно не отличались от контроля – перевара Хоттингера. Однако гидролизаты форменных элементов крови отличаются по составу пептидных фракций и имеют более высокое содержание пептидов с Мм выше 1000 (55 %) и 350-500 D (17%). При производстве рожистых бактерий достоверно показано, что клетки микроорганизмов независимо от состава ПС имели типичную морфологию, культуральные и биохимические показатели и характеризовались высокой жизнеспособностью. Максимальное накопление бактерий РС регистрировали в комплексной ПС на основе БХ с добавлением гидролизата белков крови. Стимулирование роста бактерий РС в комплексной среде можно объяснить расширением спектра азотсодержащих фракций и количества пептидов с Мм более 1000 D (табл. 17).
Сравнительную оценку ростовых свойств экспериментальных и производственных (контроль) серий БХ осуществляли также при серийном производстве рожистого антигена. Экспериментально установлено, что накопление бактерий РС штаммов 1329,1689 и 1933 в 2,2-2,4 раза выше при использовании опытной серии сред на основе ПХ, изготовленных при средней степени гидролиза фарша говядины и содержащих более 150 мг% аминного азота (АА) и максимальное количество пептидных фракций с Мм более 1000 D. Более низкие показатели роста и уровня накопления БР регистрировались при использовании контрольных ПС, полученных на основе серий ПХ, изготовленных в результате полного гидролиза белоксодержащих материалов. Отмечено также, что производственные серии БХ существенно отличались по ростовым свойствам, содержанию аминного азота и пептидных фракций.
Установлено также, что максимальное накопление штаммов 1329 и 1689 серотипов А в стационарных условиях достигает на 2-4 ч раньше и в более высокой концентрации (соответственно 578+49 и 528+69 млн/см3), чем штамма 1933 сероварианта В (464+63 млн/см3). При использовании контрольной серии ПС с АА 186,6 мг% прирост всех трех испытанных штаммов БР был достоверно (р 0, 01) ниже (табл. 18).
Стабильность промышленного производства антигена из рожистых бактерий (n±55) стационарным методом оценивали при помощи контрольных карт Шухарта типа Х.
Анализ представленных данных (рис. 3) свидетельствует об устойчивости ТП производства и высоком ростовом потенциале гидролизатных ПС, так как уровень накопления БР был достаточно высоким, стабильным, не выходил за пределы контрольных границ и находился в пределах +3б. Наблюдались отдельные выбросы в накоплении БР стационарным способом, что было связано с качеством отдельных серий БХ. Следует, однако отметить, что указанные выбросы не превышали предельно допустимых границ, предусмотренных промышленным регламентом на производство сыворотки против рожи свиней – ПР-00482849-012 09. Культивирование бактерий РС различных штаммов в промышленных объемах на биопредприятии проводилось раздельно в реакторе «Торнадо», оснащенном термостатирующим устройством, мешалкой с магнитожидкостным уплотнением вала, сифонами, воздушными фильтрами, системами трубопроводов, осуществляющими в итоге стерильность и активность антигенов. В отдельных случаях изготовление антигенов осуществляли стационарным методом в стеклянных бутылях объемом 18-20 л и в модернизированном химическом реакторе.
При промышленном производстве антигена выявлена общая закономерность (табл. 19) в динамике размножения БР стационарным методом в бутылях и при глубинном культивировании в биореакторе «Торнадо» и модернизированном реакторе объемом 600 л.
В качестве ПС использовали 2 варианта БХ: по прописи технологического регламента ПР-00482849-012-09 (контроль) и оптимизированную среду с концентрацией глюкозы в пределах 0,4 %, дрожжевого экстракта 0,5% и показателями рН и аминного азота, соответственно, на уровне 7,5+0,1 и не менее 150 мг%. Доза заражения инокулята при выращивании БР в бутылях и реакторах составляла 0,3 млрд/мл, а длительность культивирования соответственно 24 и 10-12 ч.
Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что периодический метод культивирования микроорганизмов в биореакторе «Торнадо» является наиболее эффективным и через 10-12 ч обеспечивает при оптимальных технологических параметрах максимальное накопление штамма 1933 бактерий РС (8,4+0,8 млрд/см3). В модернизированном реакторе при регулировании лишь отдельных технологических параметров накопления БР было достоверно ниже (Р 0,001) и не превышало 4,1 + 0,5 млрд /см3. В стационарных условиях (в бутылях объемом 20 л) рост бактерий был еще менее интенсивным и более длительным (24) и накопление бактерий: РС достигало лишь 1,26+0,67 млрд/см3.
Замена в производстве стационарного на периодический способ культивирования с дробной подачей раствора глюкозы и применение БХ с оптимальным содержанием АА (выше 150 мг%) и пептидной фракции с Мм более 1000 D позволили оптимизировать ТП производства и метаболизм микроорганизмов.
Таким образом, в результате исследований определены ТП культивирования штаммов бактерий РС стационарным и периодическим способами. Доказано стимулирующее влияние аминного азота и полипептидной фракции с Мм более 1000 D питательных сред на уровень накопления бактерий РС без изменения ростовых свойств, морфологических и биологических показателей. Обоснована пригодность и эффективность гидролизатов из отходов сывороточного производства для максимального накопления бактерий рожи свиней. Доказано влияние состава ПС на рост бактерий РС. Оптимальной средой для получения противорожистого антигена микроорганизма в биореакторе позволила сократить сроки максимального накопления бактерий, повысить выход бакмассы и существенно уменьшить затраты на производство стандартного антигена.
Лечебная и профилактическая эффективность сыворотки против рожи свиней
Рожа свиней – это инфекционное заболевание, характеризующееся при острой форме септицемией и воспалительной эритемой кожи, при хроническом течении - эндокардитом и артритами. Заболевание регистрируется также у лошадей, крупного рогатого скота, овец, северных оленей, собак, диких млекопитающих, птиц, восприимчив и человек.
В настоящее время для профилактики и лечения острых вспышек рожи свиней предложен широкий спектр иммунобиологических и сывороточных препаратов. Несмотря на применение различных схем профилактики и терапии сохранность поросят недостаточно высока, так как специфические антитела в оптимальном количестве синтезируются у животных ин-виво лишь с 2-3-х недельного возраста. В тоже время для защиты новорожденных необходимо использовать более активные СК, которые способны обеспечить защиту животных от заражения в течение нескольких недель [20, 54, 83, 166, 180]. Поэтому проблема совершенствования ТП производства и повышения качества СК требует своего решения [23, 55].
Изготовленные на Армавирской биофабрике за 5-летний период 53 серии сыворотки против рожи свиней в объеме 59186 л по данным ОБТК были безвредными, стерильными и активными (145±13+212±23 ЕА/мл) и соответствовали требованиям СТО 00482849-0006-2006.
В эксперименте дополнительно оценивали активность и фракционный состав 2-х производственных серий (166 и 332) СК против рожи свиней, изготовленные на волах-продуцентах в соответствии с требованиями «Промышленного регламента ПР-00482849012-09». Используемые серии препарата были стерильными, безвредными и активными и соответствовали требованиям СТО 00482849-0006-2006 (табл. 35).
Контроль активности производственных серий СК против рожи свиней осуществлялся на белых мышах и оценивался по показателям Li (отношение количества выживших к числу животных, взятых в опыт), ЕА – активность 1 мл препарата и ЕД50 (мл сыворотки на кг живой массы). Между указанными показателями установлена определенная зависимость и показана возможность оценки активности (ЕА и ЕД50) 1 мл сыворотки против рожи свиней (табл. 36).
С учетом экспериментальных и производственных испытаний сыворотку против рожи свиней считают активной при содержании в 1 мл не менее 40 ЕА. Профилактическая доза сыворотки равна 80 ЕА/кг живой массы свиней. Для лечебных целей дозу сыворотки рекомендуется увеличивать в 2 раза.
Результаты контроля активности производственных серий (166 и 322) сыворотки против рожи свиней на белых мышах были подтверждены экспериментальными данными фракционного состава препаратов методом электрофореза в полиакриламидном геле (рис. 9).
Фракционный состав образцов сыворотки против серий 166 и 332 анализировали в сравнении с контрольными образцами, полученными от неиммунизированных волов-продуцентов методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ПААГЭ-ДСН).
Учет результатов электрофореза проводили с помощью прибора Molecular Imager Gel Doc XR Systems (Bio-Rad) согласно инструкции производителя [84, 85, 105].
На электрофореграмме четко видны лишь мажорные компоненты без сопутствующих минорных фракций, что указывает на высокую концентрацию в образцах гипериммунной СК фракций иммуноглобулинов в частности IgG и ВСА (фракция с Мм 64 кДа) и достаточно общей чистоте тестируемых серий препарата. Отмечено, однако, отсутствие на электрофореграмме фракции IgG с Мм 156 кДа. Это обусловлено тем, что в процессе подготовки пробы СК подвергаются обработке 2-меркаптоэтанолом при температуре 95±100 0С в результате чего иммуноглобулины класса IgG диссоциируют на легкие (24-25 кДа) и тяжелые цепи с Мм 48-50 кДа. Это явление регистрируется при аналогичной обработке как СК, так и моноклональных антител и иммуноглобулинов других классов. При этом фракции тяжелых цепей совпадали у всех классов иммуноглобулинов, а легкие цепи у других классов (А, М, D) были напротив незначительно (25-28 кДА) тяжелее [83, 113, 215].
Условные обозначения:
1.2 -контрольные СК; ИГ-иммуноглобулины;
3,4-гипериммунные СК (опытные);
М-маркер «Precision Plus Protein Standards (Dio Rad)$
БСА - бычий сывороточный альбумин (64 кДа);
ТЦ- фракция содержащая тяжелые цепи ИГ (49-51);
ЛЦ -фракция содержащая легкие цепи ИГ (25-28 кДА);
ЛЦ-ИГ фракция содержащая легкие цепи ИГ класса G 924-85 кДа).
Анализ полученных результатов позволяет констатировать, что на электрофореграмме промышленных серий СК против рожи свиней представлены фракции легких иммуноглобулинов IgG, которые отсутствуют в контрольных СК неиммунизированных животных, что подтверждает высокий уровень иммунной реакции доноров 2-го типа, а также гиперпродукцию активных иммуноглобулинов, лечебный и профилактический эффект.
Гипериммунная противорожистая сыворотка является основным средством для лечения рожи свиней. Препарат вводят подкожно, а в тяжелых случаях внутримышечно в дозе 1,0-1,5 мл/кг живой массы. При особо тяжелых состояниях и резком ослаблении сердечной деятельности лечебную дозу сыворотки вводят в 2-3 приема с промежутками в 30-40 минут. При отсутствии лечебного эффекта сыворотку следует дополнительно применять в регламентированной дозе через 8-12 часов.
Производственные испытания лечебной эффективности гипериммунных сывороток против рожи свиней, полученных на волах и свиньях – продуцентах были проведены в хозяйствах Краснодарского края. Лечение заболевших животных проводили в течение 3 дней, используя дозы, указанные выше. Результаты приведены в таблице 37.
Результаты производственных испытаний в хозяйствах Краснодарского края свидетельствуют о том, что сыворотка, полученная от ВП, безвредна и не уступает по активности и терапевтическому эффекту сыворотке, полученной от свиней-продуцентов. Таким образом, сыворотка против рожи, полученная от волов-продуцентов содержит необходимое количество специфических антител, способных нейтрализовать патогенетическое действие вирулентных штаммов эризипелотриксов.
Эффект от применения сыворотки существенно возрастает при одновременном введении антибиотиков: пенициллина, стрептомицина, гентамицина и левомицина. Сыворотка способствует формированию пассивного иммунитета у животных к возбудителю рожи свиней. Действие биопрепарата основано на связывании и нейтрализации возбудителя рожи специфическими антителами. Установлено, что при титре агглютининов 1:80 и выше поросята устойчивы к заражению. Эти данные не зависят от характера поствакцинального или колострального иммунитета.
Внедрение в практику разработанных технологических решений, правил GMP и «Системы обеспечения качества» оказались достаточно эффективными и экономически оправданными, что позволило не только внедрить, но и организовать серийное производство «Cыворотки против рожи свиней» и на волах-продуцентах, отвечающей требованиям отечественных и международных стандартов и потребителя и доказать пригодность и эффективность препарата для профилактики и лечения рожи свиней.