Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 9
1.1 Поверхностно-активные вещества, продуцируемые микроорганизмами 9
1.2. Трегалолипидные биосурфактанты бактерий-нефтедеструкторов рода Rhodococcus 13
1.2.1 Структурное разнообразие трегалолипидов, продуцируемых родококками 13
1.2.2 Физиологическая роль и биологическая активность трегалолипидов 16
1.2.3 Характеристика трегалолипидов как сурфактантов 24
1.2.4 Влияние субстратов на способность родококков продуцировать биосурфактанты 27
1.2.5 Адаптация бактерий рода Rhodococcus к пониженным температурам и продукция биосурфактантов в этих условиях 30
1.2.6 Биодеградация углеводродов нефти родококками при пониженых температурах 33
1.2.7 Применение трегалолипидных биосурфактантов, в том числе в биоремедиации загрязненных территорий 33
1.3 Методы изучения биосурфактантов 37
1.3.1 Скрининговые методы определения поверхностной и эмульгирующей активности 38
1.3.2 Выделение, характеристика и очистка трегалолипидных биосурфактантов 47
1.3.3 Определение структуры трегалолипидов 49
Заключение 52
2. Материалы и методы исследования 54
2.1. Объекты исследования и условия культивирования 54
2.2 Рост микроорганизмов и продуцирование биосурфактантов 55
2.3 Гидрофобность клеточной поверхности микроорганизмов 56
2.4 Трансмиссивная электронная микроскопия 57
2.5 Содержание общих липидов клеток бактерий 57
2.6. Клеточносвязанный гексадекан 58
2.7 Выделение внеклеточных биосурфактантов 58
2.8 Тонкослойная хроматография гликолипидов 58
2.9 Определение жирнокислотного состава липидов и биосурфактанта 59
2.10 Разделение трегалолипидов методом колоночной хроматографии 59
2.11 Определение структуры биосурфактантов методом масс-спектрометрии 60
2.12 Физико-химические свойства трегалолипидов 61
3. Результаты и их обсуждения 65
3.1 Рост бактерий R. erythropolis X5 и R. erythropolis S67 и их способность продуцировать биосурфактанты в зависимости от источника углерода 67
3.2. Влияние температуры на способность родококков продуцировать биосурфактанты 68
3.3 Адгезивная активность бактерий R.erythropolis X5 и R.erythropolis S67 74
3.4 Общее содержание и жирнокислотный состав липидов бактерий и внеклеточных липидов 77
3.4.1 Выделение и характеристика суммарных липидов бактерий 77
3.4.2 Содержание связанного гексадекана в биомассе бактерий и жирнокислотный состав клеточных липидов 81
3.4.3 Жирнокислотный состав внеклеточных липидов 85
3.5. Морфология и ультраструктурная организация клеток R. erythropolis X5 и R. erythropolis S67 при росте на гексадекане 88
3.5.1. Морфология R. erythropolis X5 и R. erythropolis S67 при росте на гексадекане 88
3.5.2. Ультраструктурная организация клеток R. erythropolis X5 и R. erythropolis S67 при росте на гексадекане 89
3.6 Выделение и характеристика гликолипидных биосурфактантов 93
3.6.1 Обнаружение гликолипидов в культуральной среде бактерий 93
3.6.2. Выделение и очистка гликолипидных биосурфактантов 94
3.5.2 Определение структуры трегалолипидов 97
3.7. Характеристика сукцинилтрегалолипидов как сурфактантов 104
3.7.1 Критическая концентрация мицеллообразования 104
3.7.2 Солюбилизация н-гексадекана под действием сукцинилтрегалолипидов 108
3.8 Биодеградация гексадекана бактериями R. erythropolis X5 и R. erythropolis S67 при участии биосурфактантов 109
Выводы 114
Список литературы 116
- Физиологическая роль и биологическая активность трегалолипидов
- Влияние температуры на способность родококков продуцировать биосурфактанты
- Определение структуры трегалолипидов
- Биодеградация гексадекана бактериями R. erythropolis X5 и R. erythropolis S67 при участии биосурфактантов
Введение к работе
Актуальность работы.
Загрязнение окружающей среды углеводородами нефти является глобальной
проблемой в современном мире. Способность микроорганизмов к потреблению и
утилизации гидрофобных субстратов хорошо известна и позволяет использовать их в
технологиях биоремедиации. Представители рода Rhodococcus являются эффективными
нефтедеструкторами, они легко адаптируются к экстремальным условиям окружающей
среды и часто входят в состав биопрепаратов для биодеградации нефтяных загрязнений.
В условиях холодного климата, где в последние годы интенсивно ведется нефтедобыча,
восстановление загрязненных территорий природными микроорганизмами происходит
крайне медленно. При низких температурах многие углеводороды нефти переходят в
твердое агрегатное состояние, что значительно влияет на их биодоступность и степень
биодеградации микроорганизмами. Известно, что родококки продуцируют
гликолипидные биосурфактанты (биоПАВ), повышающие биодоступность гидрофобных субстратов (Franzetti et al., 2010, Matvyeyeva et al., 2014). В ряде работ показано, что при пониженных температурах родококки могут продуцировать биосурфактанты как при росте на жидких (керосине) (Dang et al., 2016), так и при росте на твердых углеводородных субстратах (тетрадекане (Malavenda et al., 2015) и н-гексадекане (Whyte et al., 1998)). Однако, биосурфактанты, которые продуцируют родококки при пониженной температуре, не идентифицированы, и их роль в биодеградации гидрофобных субстратов при низких температурах пока мало изучена.
Бактерии Rhodococcus erythropolis X5 и Rhodococcus erythropolis S67 входят в состав биопрепарата «МикроБак», разработанного для очистки нефтезагрязненных почв в интервале температур 4–30С (Filonov et al., 2012). Ранее было показано, что эти бактерии продуцируют в культуральную среду трегалолипидные биосурфактанты при температуре около 25С (Petrikov et al., 2013). Однако, взаимосвязь между степенью биодеградации гидрофобных субстратов и продукцией биосурфактантов этими бактериями не выявлена, тем более при пониженной температуре.
Цель работы
Определить структуру и свойства биосурфактантов, продуцируемых бактериями R. erythropolis X5 и R. erythropolis S67 при 10оС, и обосновать потенциал применения биосурфактантов для утилизации углеводородов на примере н-гексадекана
Задачи исследования
1. На основе сравнительного анализа физико-химических показателей
культуральной среды при температурах культивирования 26оС и 10оС (поверхностное
натяжение, содержание сахаров), гидрофобности клеточной поверхности и роста клеток
на н-гексадекане выявить влияние температуры на продукцию биосурфактантов
родококками и адгезию клеток бактерий к гидрофобному субстрату.
2. Определить общее содержание и жирнокислотный состав внеклеточных и
клеточных липидов бактерий при росте на н-гексадекане при 26оС и 10оС.
3. Выяснить особенности ультраструктурной организации клеток родококков,
выращенных на н-гексадекане при пониженной температуре.
4. Определить химическую структуру и физико-химические свойства основного
компонента внеклеточных гликолипидных биосурфактантов, продуцируемых
родококками при 10оС.
5. Для выявления возможности увеличения эффективности биоремедиации
нефтезагрязненных территорий провести сравнительный анализ результатов
биодеградации н-гексадекана родококками при дополнительном внесении в систему
выделенного биосурфактанта.
Научная новизна работы
Впервые показано, что качественный состав продуцируемых родококками биосурфактантов при росте на гексадекане в условиях пониженной температуры 10С соответствует составу биосурфактантов, продуцируемых при 26С. Это означает, что важную роль в процессе потребления гидрофобных субстратов бактериями-нефтедеструкторами играют гликолипидные биосурфактанты, которые способствуют доступности для микроорганизмов н-гексадекана как в жидком, так и в твердом состоянии при пониженной температуре.
Выявлена общая тенденция снижения гидрофобности клеточной поверхности при увеличении содержания гликолипидов, продуцируемых бактериями в культуральную среду, и подтверждена научная гипотеза об адаптации родококков к росту на гидрофобных субстратах путем перераспределения биосурфактантов между средой и клеточной поверхностью.
Впервые выделены и идентифицированы главные компоненты гликолипидов,
которые продуцируют нефтеокисляющие бактерии рода Rhodococcus при пониженной
температуры (10оС). Эти соединения представляют собой смесь изомерных гомологов:
2,3,4-деканоил-октаноил-сукцинил-2'-деканоилтрегалозы; 2,3,4-диоктаноил-сукцинил-2'-
деканоилтрегалозы; 2,3,4-диоктаноил-сукцинил-2'-октаноилтрегалозы; 2,3,4-
дидеканоил-сукцинил-2'-деканоилтрегалозы.
Впервые установлено, что родококки при росте на гексадекане формируют
мультимембранные структуры (ММС), которые напоминают ламеллярные
внутримембранные структуры. Эти структуры связаны с накоплениями гидрофобных веществ в виде включений внутри клетки, что указывает на их роль в транспорте и первичной трансформации гексадекана до гексадекановой кислоты.
Теоретическая и практическая значимость
Данная работа расширяет представления о биосурфактантах грамположительных
бактерий рода Rhodococcus и их участии в утилизации гидрофобных субстратов.
Показано, что штамм R. erythropolis X5 выделяет в культуральную среду
сукцинилтрегалолипиды (2,3,4-деканоил-октаноил-сукцинил-2'-деканоилтрегалозы;
2,3,4-диоктаноил-сукцинил-2'-деканоилтрегалозы; 2,3,4-диоктаноил-сукцинил-2'-
октаноилтрегалозы; 2,3,4-дидеканоил-сукцинил-2'-деканоилтрегалозы) с высоким
выходом и может служить продуцентом трегалолипидных биосурфактантов. Физико-
химические характеристики сукцинилтрегалолипидов свидетельствуют об их
эффективности как биосурфактантов, что определяет дальнейшие широкие возможности
их применения. Обоснована целесообразность использования штаммов R. erythropolis
X5 и R. erythropolis S67 в биопрепаратах для ремедиации нефтезагрязненных
территорий в условиях холодного климата, в том числе за счет их способности
продуцировать сукцинилтрегалолипиды. Выявленные закономерности
функционирования микроорганизмов при участии биосурфактантов в процессе биодеградации гексадекана при пониженной температуре формируют теоретическую основу для разработки биопрепаратов и биотехнологий для очистки нефтезагрязненных регионов в условиях холодного климата.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Влияние температуры на динамику и уровень продукции биосурфактантов
родококками, входящими в биопрепарат «МикроБак», при росте на гексадекане на
основе сравнительного анализа физико-химических показателей культуральной среды
(поверхностное натяжение, содержание углеводов) и роста бактерий. Выявлена
тенденция снижения гидрофобности клеточной поверхности при увеличении
содержания гликолипидов, продуцируемых бактериями в культуральную среду.
-
Результаты анализа связанного гексадекана и жирнокислотного состава клеточных липидов, которые свидетельствуют о накоплении триацилглицеридов, а не гексадекана, в виде гидрофобных включений.
-
Особенности ультраструктурной организации клеток родококков, выращенных на гексадекане при пониженной температуре.
4. Химическая структура и физико-химические свойства гомологов
сукцинилтрегалолипида – основного компонента внеклеточных биосурфактантов,
продуцируемых родококками при пониженной температуре.
5. Биодеградация гексадекана родококками при участии в качестве дополнительного
компонента сукцинилтрегалолипида.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 19-21 февраля 2017 г.); IV международной конференции «Микробное разнообразие -ресурсный потенциал» (Москва, 23 ноября 2016); Научно-практической конференции «Биотехнология: наука и практика» (Крым, 2014, 2015, Ялта, 2016); II Пущинской школе-конференции "Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов" (Пущино, 07-11 декабря 2015); Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология» (Тула, 2014, 2015 и 2016г); IX региональной молодёжной научно-практической конференции ТулГУ (Тула, 14 октября 2015).
Результаты исследований по теме диссертации представлены в 4 статьях в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий ВАК, 5
статьях в журналах (РИНЦ), и 7 сообщениях в форме тезисов и материалов профильных конференций.
Личный вклад автора состоял в разработке некоторых теоретических и экспериментальных подходов по теме исследования на основе анализа литературных источников, проведении большей части экспериментов, обобщении полученных данных и анализе результатов. Автор подготовил материалы для публикации научных статей и принимал активное участие в их написании в соавторстве.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, анализа результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на _126_стр., содержит _39_ рисунков и _20_ таблиц. Список литературы включает _176_ источников, из них _12_ на русском и _164_ на английском языках.
Физиологическая роль и биологическая активность трегалолипидов
Функции трегалолипидов зависят от их строения и типа взаимодействия с клетками бактерий. Бактерии способны продуцировать внеклеточные трегалолипиды (экзотип) и трегалолипиды, связанные с клеточной стенкой бактерий (эндотип). Трегалозомиколаты, как правило, связаны с клеточной стенкой бактерий. Как уже отмечали выше, эти соединения играют важную роль в физиологии микобактерий Mycobacterium tuberculosis (туберкулезной палочки), определяя их патогенность и токсичность. Они представляют собой трегалозо-6,6 димиколаты (ТДМ), которые являются наиболее распространенными грануломатогенными и токсичными гликолипидами (корд-фактор) в мембране вирулентных Mycobacterium tuberculosis, что делает бактерии устойчивыми к противотуберкулезным препаратам [72]. Димиколаты трегалозы оказывают ряд иммуномодулирующих эффектов [52]. Они способны стимулировать как гуморальный, так и адаптивный иммунитет клеток. В работах [73,74] было выявлено, что мыши, которых инкубировали с ТДМ, приобрели высокую устойчивость к инфекции вирусом гриппа. Большинство функций ТДМ могут быть связаны с их способностью индуцировать широкий спектр хемокинов (MCP-1, MIP 1альфа, IL-8) и цитокинов (например, IL-12, IFN-гамма, TNF-альфа, IL-4, IL-6, IL-10). ТДМ вместе с арабиногалактаном миколатов и трегалозомономиколатом (ТММ) образуют неотъемлемую часть цитоскелета клеточной стенки микобактерий, что обеспечивает высокую гидрофобность и кислотоустойчивость клеточной поверхности. Трегалолипиды родококков не обладают патогенными свойствами.
Это обусловлено различиями в структуре трегалолипидов микобактерий и актинобактерий, к которым относятся родококки. Актинобактерии, как правило, продуцируют тетраэфиры трегалозы, в состав которых входят остатки среднецепочечных жирных кислот и остаток янтарной кислоты – сукцинилтрегалолипиды. Тем не менее, трегалолипиды, продуцируемые родококками, могут проявлять биологическую активность. Так, трегалолипиды штамма R.erythropolis DSMZ 43215 не ингибировали рост грамотрицательных микроорганизмов и дрожжей, но подавляли рост конидий гриба Glomerella cingulata [75]. Изучение биологической активности трегалолипидов родококков, проводимые на моделях фосфолипидных мембран, позволили описать молекулярные механизмы взаимодействий между мембранами и этими соединениями [76]. Взаимодействия между трегалолипидом и фосфатидилхолином приводило к изменению стабильности бислоя, что указывает на способность трегалолипидов изменять проницаемость фосфолипидных мембран. В работе [77] изучали влияние очищенного трегалолипида, продуцируемого бактериями Rhodococcus sp., на термотропные и структурные свойства мембран на основе фосфатидилэтаноламинов, содержащих остатки жирных кислот различной длины и насыщенности. Было обнаружено, что трегалолипиды влияют на фазу перехода фосфатидилэтаноламиного биослоя от геля к прозрачной жидкости, что приводит мембрану в состояние геля при более низкой температуре. Подобные результаты были получены при изучении влияния трегалолипидов на фосфатидилсериновую мембрану [78]. Авторы работы [68] предложили механизм мембранной пермеабилизации, в которой трегалолипиды включаются в мембраны фосфатидилхолина и образуют латеральные домены, которые могут образовывать дефекты мембраны или «поры». В результате изучения гемолитической активности сукцинилтрегалолипидов, продуцируемых бактериями Rhodococcus sp., обнаружена способность этих соединений вызывать гемолиз эритроцитов человека путем коллоидно осмотического механизма, скорее всего, за счет образования областей усиленной проницаемости, или «пор», обогащенных сукцинилтрегалолипидами в мембране эритроцитов [68].
Однако, в некоторых исследованиях у родококков обнаружены трегалозомиколаты [24, 58, 64]. Так, в работе [23] авторы отмечают, что только около 10% трегалозодимикалатов выделялось в культуральную среду бактериями R.erythropolis, а остальные были связаны с клеточной стенкой бактерий, что и обуславливало высокую гидрофобность поверхности клеток.
Следует отметить, что, большинство исследователей все-таки считают сукцинилтрегалолипиды типичными трегалолипидами актинобактерий, в том числе родококков. Синтез трегалолипидов у актинобактерий часто связан с ассимиляцией гидрофобных субстратов. В ряде работ [79-81] представлены результаты изучения роли трегалолипидов, как биосурфактантов в биодеградации гидрофобных субстратов бактериями. Показано, что продукция трегалолипидных биосурфактантов тесно связана с поверхностными свойствами клеток бактерий-деструкторов. Биосурфактанты, связанные с клетками, способствуют увеличению гидрофобности клеточной поверхности, обеспечивая прямой контакт между клетками и каплями гидрофобных субстратов [82]. Это согласуется с данными Тулевой с соавт. о спонтанном присоединении на ранней экспоненциальной фазе роста высоко гидрофобной клеточной поверхности бактерий R. wratislaviensis и Micrococcus luteus к поверхности гидрофобного субстрата [63, 83]. Рост микроорганизмов ограничивался разделом фаз углеводород-вода, что подтверждало высокую аффинность клеток к гидрофобному субстрату. Микроорганизмы могут использовать продуцируемые ими биоПАВ для регулирования свойств клеточной поверхности, чтобы присоединяться или отделяться от гидрофобным субстратам или поверхностях при необходимости [14]. Показано, что клетки Gordonia обладали высокой гидрофобностью клеточной поверхности на ранней экспоненциальной фазе роста и оставались прикрепленными к крупным каплям гидрофобного субстрата, поэтому поглощения субстрата осуществлялось клетками за счет прямого контакта [84]. Во время поздней экспоненциальной фазы роста клетки становились гидрофильными, степень адгезии к углеводородам уменьшилась. Авторы предположили, что это привело к изменению механизма, посредством которого достигалась доступность гидрофобного субстрата для бактерий Gordonia во время роста. Оказалось, что бактерии выделяют биоэмульгаторы в культуральную среду, что позволяет гидрофильным клеткам присоединяться к гидрофильному наружному слою капель псевдосолюбилизированных углеводородов. Таким образом, трегалолипиды родококков могут выполнять важные функции в ходе адаптации бактерий к росту на гидрофобных субстратах, главным образом, за счет поверхностной и эмульгирующей активности.
Для микроорганизмов, способных утилизировать гидрофобные субстраты, характерны три основных способа поглощения углеводородов [86]:
- формирование в клеточной стенке липофильных каналов, заполненных гидрофобным веществом и обладающих высоким сродством к углеводородам;
- выделение в среду биоПАВ, которые могут эмульгировать и солюбилизируют углеводороды в водной фазе;
- образование гидрофобной клеточной стенки на основе липофильных соединений, что обеспечивает прямой контакт клеток с каплями углеводородов. Поглощение псевдосолюбилизированных углеводородов
Поглощение гидрофобных соединений в виде солюбилизированных капелей распространено среди микроорганизмов-деструкторов гидрофобных соединений. Продуцирование биосурфактантов приводит к увеличению псевдорастворимости гидрофобных веществ за счет образования эмульсии. Ли с соавторами [86] предложили, что поглощение алканов клетками происходит в виде мицелл. Согласно данной модели, молекулы биоПАВ образовали мицеллы с углеводородами (рис. 4).
Влияние температуры на способность родококков продуцировать биосурфактанты
Для выяснения взаимосвязи между образованием биосурфактантов и фазами роста бактерий определяли поверхностное натяжение и содержание сахаров в бесклеточной среде каждые 24 часа. В ходе культивирования родококков на н-гексадекане при 26оС наблюдали появление молочной эмульсии в среде бактерий R. erythropolis X5, эта эмульсия распределялась равномерно по всему объему среды, и ее мутность увеличивалась при дальнейшем культивировании в течении 6 суток, т.е. бактерии растут в виде планктонной культуры (рисунок 15а). В то время как, на поверхности культуральной среды бактерий R.erythropolis S67 формировалась пленка уже через 24 часа (рисунок 15в), суспензия в объеме среды была менее плотная, чем у R. erythropolis X5. Следует отметить, что у родококков S67 наблюдается уменьшение рН культуральной среды от 7 до 4 (в конце эксперимента), что не характерно для бактерий X5. Подобный эффект изменения рН в процессе биодеградации гексадекана бактериями R. erythropolis NTU-1 наблюдали другие исследователи [165]. Они предположили, что образование биопленки и микроколоний может защищать клетки от экстремальных условий среды, таких как низкое значение рН.
На рисунке 16 представлена зависимость между динамикой роста бактерий R. erythropolis X5 и R. erythropolis S67 на н-гексадекане и физико-химическими показателями среды. Численность бактерий в жидкой среде определяли турбидиметрическим методом по изменению мутности среды в процессе роста биомассы. Бактерии X5 адаптировались и переходили в экспоненциальную стадию роста через сутки культивирования, интенсивный рост продолжался в течение 3-х суток, максимальное значение оптической плотности бактериальной суспензии составило 3,0 (рисунок 16а, кривая.1). В то же время в культуральной среде бактерий S67 наблюдалось постепенное увеличение оптической плотности, максимальное значение достигалось на 5-е сутки и составило 0,5 (рисунок 16в, кривая 1). Следует отметить, что при этом не удается учитывать бактерии, образовавшие слой на поверхности культуральной среды, что и объясняет такой разный результат для двух штаммов и соответствует физиологическому поведению бактерий: образование молочной суспензии у R. erythropolis X5 и формирование биопленки на поверхности у R. erythropolis S67.
Вместе со снижением поверхностного натяжения увеличивалось содержание гликолипидов в бесклеточной среде. После 6 суток культивирования родококков содержание гликолипидов составило около 300 мг/л для обоих штаммов (рисунок 16а, в кривая 2). При определенном содержании гликолипидов в среде (около 120мг/л) поверхностное натяжение перестает снижаться, вероятно, из-за достижения критической константы мицеллообразования (ККМ). Следует отметить, что такое же содержание трегалолипидов (300мг/л) в бесклеточном супернатанте при поверхностном натяжении 29мН/м было получено Вайтом в ходе культивирования Rhodococcus sp. PLM026 на подсолнечном масле при 19оС [27]. Полученные нами результаты согласуются с данными других авторов по поверхностной активности культуральной среды бактерий родококков при росте на гидрофобных субстратах (таблица 11).
В ходе культивировании родококков при 10оС, когда н-гексадекан находится в твердом агрегатном состоянии, наблюдали постепенное образование суспензии по всему объему среды и тонкую пленку на границе с твердым гексадеканом (рисунок 15б, 1г). Значения оптической плотности культуральной среды бактерий X5 больше, чем у бактерий S67, как и при 26оС. Вместе с ростом бактерий на гексадекане увеличивается содержание сахаров в культуральной среде, максимальное значение которого достигало 100 мг/л для обоих штаммов после 6 суток. При этом поверхностное натяжение постепенно снижается до минимального значения только на 12 сутки: 32мН/м и 45мН/м для штаммов X5 и S67, соответственно (рисунок 16б, г-кривая 1). Это свидетельствует о способности бактерий R. erythropolis продуцировать внеклеточные биосурфактанты даже при пониженной температуре. В работе [4] продемонстрировано, что арктические бактерии Rhodococcus при росте на тетрадекане при 15оС продуцируют биосурфактанты, которые способны снижать поверхностное натяжение культуральной среды в интервале от 66 до 27мН/м. Другие авторы показали, что поверхностное натяжение среды при росте на керосине морских бактерий Rhodococcus sp. LF13 и LF22 в условиях пониженной температуры (13оС) снижалось до 37 и 30мН/м, соответственно [3]. Поверхностное натяжение культуральной среды бактерий Rhodococcus sp. Q15, выращенных на дизельном топливе при 5оС, снизилось до 40мН/м [110]. Таким образом, результаты, полученные нами, согласуются с данными других авторов о способности бактерий рода Rhodococcus продуцировать биосурфактанты при пониженных температурах.
Кроме поверхностной активности одним из главных физико-химических показателей культуральной среды является эмульгирующая активность, которую определяют по индексу эмульгирования через 1 час (Е1) или через 24 часа (E24). При температуре культивирования 26оС E24 бесклеточной среды бактерий штамма X5 к гексадекану составил 55%, а для штамма S67–36% (табл. 12). Эмульгирующая активность бесклеточной среды штамма X5 выше, чем у штамма S67, что коррелирует с поверхностной активностью среды. Более высокая поверхностная и эмульгирующая активность среды может способствовать росту биомассы на гидрофобном субстрате в виде планктонной культуры.
В ряде работ установлено, что индекс эмульгирования бесклеточной среды бактерий разных штаммов рода Rhodococcus при росте на гидрофобных субстратах к н-гексадекану, находится в диапазоне от 20 до 80% [7, 97, 166, 100] что характерно и для бактерий X5 и S67.
При низкой температуре культивирования значительно уменьшается способность бактерий S67 продуцировать биосурфактанты в культуральную среду (биосурфактанты экзотипа). Следует отметить, что при пониженной температуре гексадекан находится в твердом агрегатном состоянии, и большая часть твердого субстрата локализована на поверхности жидкости. Этим может быть обусловлено незначительное уменьшение поверхностной и низкое значение эмульгирующей активности среды при пониженной температуре. Существенную роль в утилизации гидрофобных субстратов при низких температурах может играть увеличение гидрофобности поверхности клеток [5]. Для выяснения роли гидрофобности клеточной поверхности бактерий в адаптации нефтеокисляюших бактерий R. erythropolis к низким температурам определяли этот показатель при 26оС и 10оС.
Определение структуры трегалолипидов
Гликолипидные компоненты с одинаковой хроматоргафической подвижностью (Rf 0,35), выделенные из среды бактерий Х5 и S67, анализировали методом масс-спектрометрии. В масс-спектрах этих компонентов из среды бактерий обоих штаммов, выращенных при 10С, в условиях регистрации положительных ионов присутствуют те же сигналы, что и для образцов, полученных при 26С: три сигнала натриевых аддуктов [M+Na]+ с m/z 871, m/z 899 и m/z 927, которые соответствуют молекулярным массам 848, 876 и 904Да (рис. 30а). Поскольку разница в массах между соседними сигналами составляет 28 Да, что соответствует молярной массе двух метиленовых групп (-СН2-), можно предположить, что эти три вещества являются гомологами. Интенсивность пика m/z 899 почти в 2,5 раза и 10 раз больше, чем интенсивность сигналов m/z 871 и m/z 927, соответственно. Молекулярные массы ионов в масс-спектрах, полученных в условиях регистрации отрицательных ионов, соответствуют тем же молекулярным массам соединений (848, 876 и 904Да) (рис. 30б).
Ранее в нашем научном коллективе выделили гликолипидный компонент из липидного экстракта среды бактерий R.erythropolys X5, выращенных на н-гексадекане при 26оС. Масс-спектр этого соединения [7] был аналогичен масс-спектру, полученному нами. На основе сравнения с литературными данными было сделано предположение, что этот компонент представляет собой смесь гомологов тетраэфира трегалозы, содержащих остатки янтарной, октановой и декановой кислот.
Анализ MC/MC спектров позволил нам рассмотреть структуру соединений более подробно. В MC/MC спектре натриевого аддукта [M+Na]+ с m/z 899 наблюдаются пики c m/z 799, m/z 781, m/z 755, m/z 727, которые соответствуют соединениям, образовавшимся путем отщепления фрагментов ангидрида янтарной кислоты (-100Да), янтарной (-118Да), октановой (-144Да) и декановой кислот (-172Да), соответственно (рис. 31).
Ион с m/z 583 соответствует соединению, образованному после разрыва гликозидной связи в трегалолипиде, в результате чего отщепляется фрагмент ангидрида глюкозы, ацилированной декановой кислотой (-316 Да). Это предполагает наличие у одного глюкопиранозного кольца единственного остатка декановой кислоты, а у второго - по одному остатку янтарной, октановой и декановой кислоты.
В результате фрагментации иона [M+Na]+ с m/z 871 в спектре МС/МС появились пики с m/z 771, m/z 753, m/z 727, m/z 699 (рис. 32), которые образовались путем отщепления тех же фрагментов, что и при распаде молекулярного иона с m/z 899. Однако вместо пика с m/z 583 появился пик с m/z 555, который соответствует глюкопиранозе, ацилированной янтарной и двумя октановыми кислотами. Это подтверждает предположение о том, что оба трегалолипида являются гомологами.
В работе [63] описано, что при культивировании на н-гексадекане бактерии R. wratislaviensis при 28С продуцировали два тетраэфира трегалозы, которые на хроматограмме проявлялись в виде одной полосы с Rf 0,39 в системе дихлорметан - метанол - вода (2.6:0.6:0.02). Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением в положительном режиме показала наличие двух соединений, которым соответствовали ионы [M+Na]+ с m/z 899 и 871. Как видно, эти значения m/z совпадают с полученными нами значениями. Фрагментация этих пиков, приведнная в работе [64], аналогична фрагментации наших соединений. Использование в той же работе ЯМР-анализа позволило более точно установить распределение остатков карбоновых кислот в молекулах гликолипида. У трегалолипида массой 876Да одно глюкопиранозное кольцо ацилировано остатком декановой кислоты в положении С-2 , а другое - остатком янтарной в положении С-2 или С-4, остатком декановой и остатком октановой кислот в положения С-2, С-3 или С-4. Трегалолипид массой 848 Да отличался тем, что положения С-2, С-3 или С-4 были ацилированы двумя остатками октановой кислоты. Соединения с аналогичной структурой были обнаружены при анализе гликолипидов, продуцируемых штаммом Rhodococcus sp. MS 11 при росте на гексадекане при 20С. Для этих соединений была продемонстрирована идентичная фрагментация ионов [M+Na]+ с m/z 899 и 871, а ЯМР-анализ подтвердил наличие заместителей в положениях С-2, С-3, С-4 и С-2 [23]. Сравнивая полученные нами результаты и результаты предшествующих работ, можно заключить, что основными биосурфактантами, продуцируемыми штаммами Х5 и S67 выращенных на н-гексадекане как при 26оС, так и при 10оС являются 2,3,4-сукцинил-октаноил-деканоил-2 -деканолитрегалозой и 2,3,4-сукцинил-диоктаноил-2 -деканолитрегалозой.
Два остальных сигналы с m/z 843, 927 обладают низкой интенсивностью, и их фрагментацию не проводили. Однако, по аналогии с предыдущим анализом можно заключить, что ионы [M+Na]+ с m/z 843 и m/z 927 соответствуют тетраэфиру трегалозы с тремя остатками октановой кислоты – 2,3,4-сукцинил-диоктаноил-2 -октаноилтрегалозе и с тремя остатками декановой кислоты – 2,3,4-сукцинил-дидеканоил-2 деканоилитрегалозе.
В МС/МС спектре депротонированного иона [M-Н]- с m/z 875 наблюдаются пики c m/z 775, m/z 631, m/z 603 (рис. 33), а в МС/МС спектре иона [M - Н]- с m/z 847 – пики с m/z 747, m/z 603, m/z 575 (рис. 34), которые соответствуют соединениям, образовавшимся путем отщепления тех же фрагментов, как в условиях регистрации положительных ионов.
Это подтверждает наше предположение о том, что оба трегалолипида являются гомологами: 2,3,4 сукцинил-диоктаноил-2 октаноилтрегалоза и 2,3,4-сукцинил-октаноил-деканоил-2 октаноилтрегалоза
Для подтверждения предложенной структуры сукцинилтрегалолипидов проводили анализ жирнокислотного состава выделенного соединения после метанолиза исследуемых трегалолипидов. В результате ГХ/МС анализа метиловых эфирных жирных кислот выявлено, что единственными жирными кислотами являются октановая и декановая кислоты. Таким образом, гликолипидный компонент с хроматографической подвижностью Rf 0,35 представляет собой гомологи тетраэфира трегалозы, содержащие один остаток янтарной кислоты и три остатка жирных кислот (октановой и декановой) (табл. 18).
Таким образом, нами впервые показано, что качественный состав выделяемых Rhodococcus биосурфактантов при росте на н-гексадекане в условиях пониженной температуры 10С, соответствует составу биосурфактантов, продуцируемых родококками при 26С. Это означает, что важную роль в потреблении гидрофобных субстратов бактериями нефтедеструкторами играют гликолипидные биосурфактанты независимо от агрегатного состояния субстрата. Биосурфактанты способствуют доступности н-гексадекана находящегося как в жидком, так и в твердом состоянии, для утилизации микроорганизмами. Это обусловлено поверхностно-активными и эмульгирующими свойствами сукцинилтрегалолипидов.
Биодеградация гексадекана бактериями R. erythropolis X5 и R. erythropolis S67 при участии биосурфактантов
Бактерии R. erythropolis X5 и R. erythropolis S67 входят в биопрепарат «МикроБак», который используют для очистки нефтезагрязненных территорий в условиях холодного климата.
Эффективность утилизации углеводородов существенно зависит от их агрегатного состояния, которое может изменяться от температуры. Так, н-гексадекан при 26С – жидкость, а при температуре 10С – твердое вещество (температура плавления гексадекана 18С). Для выявления влияния температуры на способность бактерий участвовать в утилизации таких углеводородов исследовали зависимость степени биодеградации н-гексадекана во времени при 26оС и 10оС.
Наиболее эффективно родококки деградируют гексадекан в экспоненциальной фазе роста при обеих температурах (более половины от утилизируемого вещества) (рис. 37).
При 26оС степень биодеградации гексадекана после 3-х суток культивирования составила 34 – 35%, при 10оС за 6 суток было утилизировано 27 – 28% гексадекана. Это может быть обусловлено как высокой скоростью роста бактерий в этой фазе (см. п.3.2), так и более высокой степенью адгезии клеток к гидрофобному субстрату (см. п.3.3), что способствует поступлению н-гексадекана (или его промежуточных метаболитов) в клетку. К концу эксперимента R.erythropolis X5 утилизировали 53% гексадекана за 8 суток культивирования при 26оС и 40% – за 18 суток при 10оС. Бактерии R.erythropolis S67 были менее эффективны и утилизировали 46% и 30% гексадекана при 26оС и 10оС. При этом содержание гликолипидных биосурфактантов увеличивается в значительной степени только в конце экспоненциальной фазы роста. В работе [5] показано, что бактерии Rhodococcus sp. Q15 способны утилизировать около 30% н-гексадекана через 30 суток при 5оС культивирования. Маргезин с соавт. [121] при изучении биодеградации гидрофобных субстратов в условии пониженной температуре выявлено, что бактерии R. cercidiphyllus BZ22 утилизировали 35% н-гексадекана при температуре 10С через 14 суток культивирования, а что сопоставимо с полученными нами результатами.
Следует отметить, что содержание гликолипидных биосурфактантов в культуральной среде бактерий R.erythropolis X5 и R.erythropolis S67 увеличивается в значительной степени только в конце экспоненциальной фазы роста. Мы предположили, что добавление биосурфактанта в культуральную среду на начальном этапе роста микроорганизмов позволит увеличить эффективность процесса биодеградации за счет увеличения доступности гидрофобного субстрата благодаря образованию эмульсии при комнатной температуре и облегчению контакта клеточной поверхности с твердым гексадеканом посредством биосурфактанта при пониженной температуре. Однако, добавление трегалолипидных биосурфактантов, выделенных ранее из культуральной среды бактерий R. erythropolis X5, привело к незначительному увеличению степени деградации гексадекана (рис. 38).
Так, при 26оС эффективность биодеградации н-гексадекана бактериями обоих штаммов увеличилась на 16 – 17%, а при 10оС – только на 6 – 7%. Как и следовало ожидать, влияние биосурфактанта на степень биодеградации более выражено в системе с жидким гидрофобным субстратом при 26оС за счет псевдорастворимости путем эмульгирования гексадекана на первых стадиях роста микроорганизмов, что приводит к увеличению контакта клеток с гидрофобным субстратом и его доступности для бактерий (рис. 39-1).
Маниккам с соавт. [129] проводили эксперименты по биодеградации другого гидрофобного субстрата (гексахлорана) бактериями Sphingomonas sp.MN05 c участием сукцинилтрегалолипида (40мкг/мл), продуцируемого бактериями R. erythropolis. Оказалось, что в присутствии биосурфактанта степень биодеградации увеличивалась на 35% после 10 суток культивирования бактерий. Ившина с соавт. [176] при изучении эффективности гликолипидных биосурфактантов родококков в отмывании модельных нефтяных загрязнителей in situ выявили, что при добавлении 4,2г/л (в 2 раза больше, чем ККМ) гликолипидных биосурфактантов удалось смыть с модельного объекта от 16% до 69% ароматических циклических углеводородов, около 50% н-гексадекана. Это было на 5% эффективнее, чем в присутствии синтетического ПАВ (Твин 60), и на 20% эффективнее, чем просто дистиллированной водой. Эти результаты подтверждают роль биосурфактанта как солюбилизатора в очистке территорий от гидрофобных загрязнений.
При пониженной температуре н-гексадекан в твердом агрегатном состоянии не образует эмульсии, поэтому важную роль играет повышенная гидрофобность клеточной поверхности бактерий на всех стадиях роста для увеличения степени адгезии клеток к твердой гидрофобной поверхности, т.е. прямой контакт с гидрофобным субстратом (рис. 39-2). Транспорт гексадекана в клетку при этом могут обеспечивать не мицеллы, а гидрофобные каналы (см. п.3.5.2, рис. 26), которые могут быть сформированы при участии гликолипидных биосурфактантов (рис. 39-3).
Однако, образование таких каналов ограничено и не требует большого количества биосурфактантов, поэтому в присутствии дополнительных количеств гликолипидных биосурфактантов при пониженной температуре степень утилизации н-гексадекана бактериями увеличивается только на 6 7%. Таким образом, дополнительное внесение гликолипидных биосурфактантов способствует увеличению степени деградации углеводородов нефти родококками в теплое время года, а при пониженной температуре такой биотехнологический прием менее эффективен. В то же время особенности физиологической адаптации бактерий R. erythropolis X5 и R. erythropolis S67 к низким температурам среды определяют их потенциал как важного компонента в биопрепаратах для очистки нефтезагрязненных территорий в условиях холодного климата.
Полученные результаты могут быть использованы для целенаправленной разработки эффективных биопрепаратов, в том числе для использования в условиях холодного климата.