Введение к работе
Актуальность исследования. Иммунохимические методы позволяют объективно и
адекватно судить о правильности терапевтических либо иных методов лечения. В
настоящее время существует более 200 различных диагностических методов и их
модификаций, основанных на реакции антиген-антитело (Орлова О.Ю., 2005). К наиболее
часто применяемым могут быть отнесены методы иммуноферментного анализа
(ИФА), радиоиммунного анализа (РИА). Для этих методов характерны высокая
чувствительность и точность результатов, возможность их автоматизации. Вместе с
тем, они отличаются значительной дороговизной, неэкспрессностью, использованием
специальных и дорогих приборов, специальными условиями хранения
иммунохимических диагностикумов.
Всё вышесказанное делает методы иммуноферментного анализа (ИФА) и метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), радиоиммунного анализа (РИА) пригодными, прежде всего как верифицирующие тесты, но не как скриннинговые. Для скриннинговых анализов необходимы препараты для экспресс - диагностики, которые должны иметь низкую себестоимость, стабильные и воспроизводимые иммунохимические свойства, время постановка реакции и считывания результатов не более 10 минут, не требовать использования дополнительных приборов. Кроме того, экспресс-диагностика должна давать возможность ставить реакции с малыми объемами препарата и биоматериала, взятого от пациента (10-20 мкл) (Мешандин А.Г.,1997).
В последнее время предложено решение данной задачи - использование в качестве диагностических препаратов гидрозолей. Гидрозольные препараты представляют собой водные коллоидные растворы ультрадисперсных частиц, на поверхности которых адсорбированы биоспецифические компоненты, в частности, антигены, либо комплементарные им антитела к различным нозологиям. Имеются данные о гидрозольных препаратах на основе неорганических объектов - это золь гексацианоферрата (II) железа (III), так называемая «берлинская лазурь» в качестве твёрдой фазы, предназначенного для определения туберкулёзных антител в сыворотке крови больных в постановке на стекле (Орлова О.Ю., 2005). Данные препараты могут служить основой для разработки большого количества бесприборных диагностических систем и могут использоваться там, где требуется выявить феномен взаимодействия антигена с антителом.
Однако ряд вопросов, связанных с оптимизацией свойств коллоидного раствора «берлинской лазури» таких, как содержание и тип модификатора, рН разводящего
раствора, величина ионной силы разводящего раствора, оптимальный способ постановки и визуализации реакции гидрозольной агглютинации, остаются до конца нерешенным. Так же возникают вопросы о возможности синтеза гидрозольных препаратов на основе других объектов: коллоидных растворов ультрадисперсных алмазов (УДА) детонационного синтеза (Долматов В.Ю., 2003), коллоидных растворов парафина, изучение их свойств.
Данная работа направлена на создание технологии получения устойчивых гидрозольных диагностических препаратов, основанных на реакции антиген-антитело, с последующей объективной визуализацией.
Техника постановки реакции гидрозольной агглютинации почти полностью совпадает с техникой постановки реакции пассивной гемагглютинации. В связи с этим стоимость анализов будет различаться лишь по стоимости применяемых диагностикумов. Так стоимость эритроцитарного диагностикума, необходимого для постановки одного анализа в реакциях пассивной гемагглютинации (РПГА), составляет 20 рублей, стоимость одного анализа методом иммуноферментного анализа (ИФА) - 30 рублей, тогда как стоимость гидрозольного диагностикума - 5 рублей. Время постановки реакции гидрозольной агглютинации составляет 5-10 минут, тогда как время проведения одного анализа от 3 часов (иммуноферментный анализ) до 1 суток (полимеразная цепная реакция)
Таким образом, основным предметом нашего исследования стали разработка и создание экспрессных иммунохимических коллоидных препаратов на основе ультрадисперсных частиц неорганической и органической природы.
Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре общей химии Кировской государственной медицинской академии Министерства Здравоохранения и Социального развития Российской Федерации.
Цель работы
Изучение особенностей синтеза и состава гидрозольных диагностикумов на основе ультрадисперсных частиц неорганической и органической природы, на поверхность которых сорбированы специфические белки - антигены - маркеры определенных заболеваний.
Получение и апробация диагностических препаратов на выявление маркеров таких заболеваний, как туберкулез, сифилис, птичий грипп.
Задачи исследования
1. Выбор типа твердофазного носителя для реакции гидрозольной агглютинации.
Установление типа и дозировки модификатора при хемосорбции биолиганда на коллоидные частицы гексацианоферрата (II) железа (III) («берлинской лазури»).
Выбор типа разводящего раствора с учетом рН и ионной силы при постановке реакции иммунохимической гидрозольной агглютинации.
Исследование объективного способа постановки и фиксации результатов иммуноанализа.
Получение и апробация диагностических препаратов на выявление маркеров таких заболеваний, как туберкулез, сифилис, птичий грипп.
Научная новизна работы
Впервые проведено комплексное исследование органического (парафин) и неорганического материала (ультрадисперсные алмазы) в качестве твердой фазы для последующего изготовления гидрозольных диагностических препаратов.
Установлено, что малодиссоциирующие соли d-переходных металлов являются лучшими модификаторами, обеспечивающими наиболее эффективное ковалентное связывание белка с неорганическим носителем - коллоидным раствором гексацианоферрата (II) железа (III) с целью создания стабильных конъюгатов с воспроизводимыми иммунохимическими свойствами.
Впервые оптимизирован состав разводящего раствора для реакции гидрозольной агглютинации для гидрозоля - гексацианоферрата (II) железа (III).
Впервые получены гидрозольные иммунохимические диагностикумы на выявление маркеров таких заболеваний, как сифилис и птичий грипп.
Научно-практическая значимость работы
Ранее на кафедре была разработана методика для получения гидрозольных препаратов на основе гексацианоферрата (II) железа (III), так называемой «берлинской лазури». Однако данные препараты имели недостаток: при попытках пассивной адсорбции биолиганда на гидрозоль гексацианоферрата (II) железа (III) не наблюдали адсорбции белка на поверхность твердой фазы. Это выражалось в том, что агглютинационный анализ не происходил во всем диапазоне разведений «+» и «-» сывороток с антителами, комплементарными определенным антигенам. Поэтому необходимо было осуществить комплекс работ по «пришивке» специфических антигенов - белков через определенный модификатор.
В ходе работы была установлена связь между дозировками химических модификаторов на поверхности ультрадисперсных частиц и свойствами получающихся
продуктов - иммунохимических гидрозолей, а также связь между рН и ионной силой разводящего раствора и агрегационной устойчивостью гидрозольных препаратов.
В данной работе были впервые исследованы другие носители (коллоидные растворы парафина и ультрадисперсных алмазов) в качестве твердой фазы для создания диагностических препаратов, производящих адсорбцию биолиганда без применения модификатора.
В ходе работы получены и в последующем апробированы в клинических условиях гидрозольные диагностикумы, предназначенные для выявления маркеров таких заболеваний, как туберкулез, сифилис, птичий грипп. Получены акты испытаний данных диагностикумов в организациях: НИИ гриппа РАМН (г. Санкт - Петербург), клинической лаборатории ФГУ ЛИУ- 12 УФСИН России по Кировской обл., ОАО НПП «АВИВАК» (г. Санкт - Петербург).
Основные положения, выносимые на защиту:
Гидрозольные препараты могут быть получены не только на основе неорганических коллоидных растворов, но и коллоидных растворов ультрадисперсных алмазов (УДА), а также на основе органических веществ - коллоидного раствора парафина.
Для адсорбции биолигандов на поверхность золя гексацианоферрата (II) железа (III) необходим химический модификатор, оптимальными следует признать катионы тяжелых металлов: Hg , Pb в виде малодиссоциирующих солей в водном растворе.
Разводящим раствором, обеспечивающим высокое значение константы аффинитета и авидности реагирующих между собой антигена и антитела следует признать 1% КС1; 0,9 - 1% КС1 в растворе фосфатного буфера.
Апробация работы
Результаты работы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на научно - практических конференциях: VI Московском международном салоне инноваций (Москва, 2006); II специализированной выставке «Наука. Инвестиции. Производство. Вятский левша» (Киров,2006); IV Всероссийской конференции «Бизнес - ангелов и инноваторов» (Саранск, 2006); IV Республиканской научно-практической конференции «Перспективные направления и новые технологии в здравоохранении» (Йошкар - Ола, 2006); Всероссийской научно - практической конференции с международным участием «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)» (Ростов-на-Дону, 2006) - Диплом V степени; VII Московском международном салоне инноваций и инвестиций (Москва, 2007) - Приз
Международной федерации изобретательских организаций и Золотая медаль Министерства образования и науки РФ; Международной конференции «Биотехнология как научно-практический приоритет развития Кировской области» (Киров, 2007); II Международной конференции «Международное сотрудничество и развитие биотехнологий в Кировской области» (Киров, 2008); VIII Московском международном салоне инноваций и инвестиций (Москва, 2008) - серебряная медаль Министерства образования и науки РФ; работа доложена на расширенном заседании кафедры общей химии Кировской ГМА.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из которых 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, трёх глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение исследований), выводов, списка литературы (102 источников) и списка работ, опубликованных по теме диссертации. Работа изложена на 109 страницах, содержит 13 рисунков, 14 таблиц, 13 диаграмм. Список литературы включает 102 источника.
