Содержание к диссертации
Введение
II. Литературный обзор 9
1. Тирозинкиназы. 9
1.1. Нерецепторные тирозинкиназы. 11
1.2. Рецепторные тирозинкиназы. 12
1.2.1. Структура рецепторных тирозинкиназ. 12
1.2.2. Механизм активации рецепторных тирозинкиназ. 15
1.2.3. Внутриклеточная передача сигнала рецепторных тирозинкиназ. 18
1.2.4. Инсулиновое семейство рецепторных тирозинкиназ. 20
1.2.5. Рецептор, подобный инсулиновому рецептору 21
2. Гетерологическая экспрессия белков. 24
2.1. Системы экспрессии. 24
2.1.1. Прокариотические системы экспрессии. 25
2.1.2. Эукариотические системы экспрессии. 27
2.2. Векторы. 35
3. Выделение и очистка рекомбинантных белков 37
4. Моноклональные антитела. 41
4.1. Получение моноклональных антител 41
4.2. Применение моноклональных антител. 47
III. Экспериментальная часть 49
1. Материалы. 49
1.1. Реактивы 49
1.2. Сорбенты. 49
1.3. Антитела 50
1.4. Клеточные линии. 50
1.5. Растворы 50
1.6. Оборудование. 51
2. Методы. 51
2.1. Работа с нуклеиновыми кислотами. 51
2.1.1. Создание генетических конструкции для экспрессии. 51
2.1.2. Выделение геномной ДНК из CHO-K1. 52
2.1.3. Амплификация фрагментов ДНК методом полимеразной цепной реакции. 53
2.1.4. Электрофорез ДНК в агарозном геле. 53
2.1.5. Секвенирование ДНК 53
3. Работа с эукариотическими клетками. 53
3.1. Скрининг клеточной линии CHO-K1. 53
3.2. Культивирование CHO-K1. 54
3.3. Культивирование HEK293. 54
3.4. Трансфекция эукариотических клеток методом липофекции. 54
4. Работа с белками. 55
4.1. Очистка 55
4.1.1. Подготовка культуральной среды к очистке. 55
4.1.2. Анионообменная хроматография на DEAE-650. 55
4.1.3. Гель фильтрация на HW-55F 55
4.1.4. Анионообменная хроматография на Mono Q. 56
4.1.5. Гель-фильтрация на Superose 6. 56
4.1.6. Аффинная хроматография на CNBr сефарозе 4B. 56
4.1.7. Аналитическая гель фильтрация на Superose 6. 57
4.2. Активация IRR-GFP. 57
4.3. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле. 57
4.4. Вестерн-блот. 58
4.5. Спектрометрическое определение концентрации белка. 58
4.6. Круговой дихроизм. 58
4.7. Оценка гликозилирования. 58
4.8. Масс-спектрометрия MALDI. 59
4.9. Флуоресцентная микроскопия живых клеток. 59
5. Работа с моноклональными антителами. 59
5.1. Получение моноклональных антител 59
5.1.1. Иммунизация мышей. 59
5.1.2. Получение гибридом 60
5.1.3. Выделение моноклональных антител. 60
5.2. Непрямой твердофазный иммуноферментный анализ. 61
5.3. Определение изотипа моноклональных антител. 61
5.4. Иммуноцитохимия. 62
5.5. Активация и ингибирование моноклональными антителами 63
IV. Результаты и обсуждение 64
1. Объект исследования . 64
2. Система экспрессии. 69
3. Культивирование CHO-K1. 72
4. Очистка 73
5. Вестерн-блот. 82
6. Аналитическая гель-фильтрация и гель-электрофорез. 83
7. Масс-спектрометрический анализ выделенного препарата эктодомена IRR. 83
8. Оценка уровня гликозилирования IRR. 84
9. Анализ эктодомена IRR методом кругового дихроизма. 86
10. Получение и очистка моноклональных антител. 87
11. Определение изотипа моноклональных антител. 88
12. Непрямой твердофазный иммуноферментный анализ. 89
13. Иммуноцитохимия с моноклональными антителами 90
14. Доменное картирование участков связывания моноклональных антител. 93
15. Оценка влияния моноклональных антител на активацию IRR 94
16. Создание системы гетерологической экспрессии полноразмерного IRR. 95
V. Выводы 99
VI. Благодарности 100
VII. Список литературы 101
- Эукариотические системы экспрессии.
- Объект исследования
- Очистка
- Создание системы гетерологической экспрессии полноразмерного IRR.
Эукариотические системы экспрессии.
Теоретически, прокариоты могут экспрессировать любой ген, но на практике продуцируемые белки не всегда имеют желаемую биологическую активность или стабильность. Кроме этого, токсичные компоненты бактерий могут загрязнять конечный продукт. Это становится серьезной проблемой, когда рекомбинантный белок предназначен для терапевтического использования. Нужно быть уверенными, что полученный рекомбинантный белок воспроизводит свойства природного белка. Клетки эукариот имеют некоторые биохимические особенности.
Дрожжевая система.
Дрожжевая система представляют собой экспрессию с наивысшим коммерческим значением. Среди дрожжей наиболее широко используется Saccharomyces cerevisiae. Кроме того, штамм широко используется в качестве модельного организма для исследования функций клеток, поскольку его биохимия, генетика и клеточная биология очень хорошо охарактеризованы, чтобы экспрессировать ряд белков, включая белки, которые будут использоваться для вакцин, фармацевтических продуктов и для диагностики [62]. Штамм удовлетворяет требованиям экономической эффективности и биобезопасности для применения человеком. Эта система успешно используется для получения вакцины против гепатита В [63] и вакцины против хантавируса [64]. Saccharomyces cerevisiae используется при изготовлении 11 одобренных вакцин против вируса гепатита B и одной против вируса папилломы человека; в обоих случаях рекомбинантный белок образует высокоиммуногенные вирусоподобные частицы [65].
Среди эукариотических систем дрожжи уникальны тем, что сочетают в себе преимущества как прокариотических (высокие уровни экспрессии (в 10-100 раз выше), быстрый рост, простота в обслуживании, простое масштабирование, так и эукариотических (способность вносить в структуру белка большую часть посттрансляционных модификаций) систем экспрессии.
Дрожжи, такие как Saccharomyces cerevisiae, Hansenulla polymorpha и P. pastoris, относятся к числу простейших эукариотических организмов, которые растут относительно быстро и хорошо адаптируются к крупномасштабному производству.
В последнее время получили широкое распространение метилотрофные дрожжи, такие как Hansenulla polymorpha, Pichia pastoris и Candidia biodini, среди которых лидером является P. Pastoris, представляющая собой мощную и недорогую гетерологичную систему экспрессии для производства функционально активных рекомбинантных белков [66]. В качестве эукариот дрожжи могут продуцировать правильно сложенные растворимые рекомбинантные белки с необходимыми посттрансляционными модификациями, которые необходимы для сохранения функционала [61]. Система безопасна, так как отсутствуют эндотоксины и онкогены.
Более того, дрожжевыми клетками легче манипулировать генетически, чем клетками млекопитающих, и их можно выращивать до высокой клеточной плотности. Проблемой, в частности, является неспособность S. cerevisiae правильно гликозилировать животные белки, зачастую добавляя слишком много гликанов, что приводит к гипергликозилированию белков.
В последнее время, успехи в гликоинженерии дрожжей и экспрессия терапевтических гликопротеинов с гуманизированными структурами N гликозилирования показали значительную перспективу [67]. Дрожжевая система является неэффективной при секреции белков в среду роста, что приводит к внутриклеточному удержанию белка и сильно затрудняет их очистку.
Система на основе нитчатых грибов. Нитчатые грибы, такие как Aspergillus (Aspergillus niger и Aspergillus oryzae) и Trichoderma были разработаны в платформы экспрессии для скрининга и производства различных промышленных ферментов. Trichoderma reesei обладает способностью экспрессировать более 100 г / л белков и, следовательно, является превосходной системой для производства высоких уровней терапевтических белков по низкой цене [68]. Системы на основе грибов имеют ряд преимуществ, главным образом благодаря их высокому уровню секреции ферментов. Но сложность и относительная нехватка понимания физиологии нитчатых грибов по сравнению с бактериями препятствуют внедрению этих организмов как высокоэффективных производителей гетерологичных белков [69].
Система на основе клеток насекомых.
Системы культивирования клеток насекомых широко используются для производства рекомбинантных белков, вакцин, а также в фундаментальных исследованиях в области биологии. Создано большое количество клеточных линий от насекомых диптерией, гемиптерами и чешуекрылыми. Данные клеточные линии позволяют получать высокие уровни экспрессии гетерологичных генов, особенно для внутриклеточных белков [70].
Системы на основе клеток насекомых, особенно бакуловирусные системы, революционизировали рекомбинантную продукцию белка. Бакуловирусы имеют ограничение конкретными беспозвоночными видами, в которых они способны размножаться. Будучи неинфекционными для позвоночных, эти вирусы безопаснее большинства вирусов млекопитающих. Вспомогательные клеточные линии или вспомогательные вирусы не нужны, так как бакуловирусный геном содержит всю генетическую информацию, необходимую для распространения в различных клеточных линиях или личинках у разных насекомых. Бакуловирусы обычно размножаются в линиях клеток насекомых, полученных от Spodoptera frugiperda или от Trichoplusia. Часто используемыми и коммерчески доступными линиями клеток насекомых являются Sf-9, Sf-21 и Trichoplusia). Данные клеточные линии хорошо растут в суспензионных культурах, что позволяет получать рекомбинантные белки в крупномасштабных биореакторах. Рекомбинантные белки могут быть получены в клеточных линиях насекомых, а также в самих насекомых. Уровень производства в этой системе очень высок, и если имеется рекомбинантный вирус для заражения насекомых, то производство белка получается экономически выгодным. Однако в этой системе существует один недостаток, заключающийся в том, что гликозилирование белка в клетках насекомых отличается от клеток млекопитающих, что приводит к ненадлежащему поддержанию эпитопов в целевом белке [70].
Бакуловирусы являются патогенами насекомых, которые регулируют популяции насекомых в природе и успешно используются для борьбы с насекомыми-вредителями. Типичное свойство поздней экспрессии генов делает их очень подходящими в качестве векторов для экспрессии чужеродных генов. Два бакуловируса широко применяются в биотехнологии в качестве векторов для получения рекомбинантных белков в клетках насекомых: Autographa californica множественного нуклеополиэдровируса (AcMNPV) и, в меньшей степени, Bombyx mori (Bm) NPV. Дополнительным преимуществом является то, что они имеют ограниченный диапазон насекомых, в которых способны размножаться и, следовательно, безопасны для позвоночных животных. Клетки насекомых могут расти в бессывороточной среде [71, 72]. Белки, продуцируемые в бакуловирус-экспрессионной системе, используются для функциональных исследований, вакцинных препаратов или диагностики.
Объект исследования
Рецепторные тирозинкиназы - важное звено в системе передачи сигналов в клетке. Они имеют ключевое значение в процессах развития и жизнедеятельности организма, участвуют в управлении межклеточными взаимодействиями, пролиферацией и клеточной дифференцировкой, клеточной миграцией и метаболизмом, контроле клеточного цикла [33]. Нарушения в работе данных рецепторов способны приводить к возникновению таких социально значимых заболеваний, как рак и диабет.
Для активации большинства рецепторных тирозинкиназ необходим лиганд белково-пептидной природы, способный взаимодействовать с внеклеточной частью (эктодоменом) рецептора одновременно в нескольких местах, приводя к его димеризации и активации, проявляющуюся в автофосфорилировании внутриклеточной части рецептора. Особенным является семейство рецептора инсулина, члены которого существуют изначально в виде димеров, связанных дисульфидными связями, а при взаимодействии внеклеточной части с лигандом меняют свою конформацию и активируются. В это семейство входит три рецептора: рецептор инсулина (IR, Insulin receptor), рецептор инсулиноподобного фактора роста (IGF-IR, Insulin-like growth factor 1 receptor) и рецептор, подобный рецептору инсулина (IRR, Insulin receptor-related receptor) [30, 31, 32]. Так как все три рецептора имеют высокую степень гомологии, логично предположить, что механизмы их активации схожи. Изучая механизм активации IRR, мы можем получить новые данные, позволяющие лучше понять механизмы активации IR и IGF-IR.
Физиологическая роль IRR долго оставалась загадкой, так как с момента его открытия для него не было обнаружено ни одного эндогенного лиганда [34, 35], несмотря на многочисленные попытки, включая полный анализ генома [36]. В нашей лаборатории было впервые продемонстрированно, что рецептор IRR представляет собой сенсор внеклеточной щелочной среды и принимает участие в регулировании кислотно-щелочного баланса в организме. Данный рецептор активируется при защелачивании внеклеточной среды выше pH 7.9, имеет точку 50% эффекта примерно pH 8.5 и выходит на насыщение при рН свыше 9.0 [44]. Точеные мутации внеклеточной части IRR показали, что в механизме щелочной чувствительности IRR задействовано множество реакционных центров [175, 176, 177].
Основными местами локализации IRR являются почки, головной мозг и поджелудочная железа [37, 38, 178]. IGF-1R и IR также были обнаружены в островках Лангерганса, но с более низкой частотой по сравнению с уровнем экспрессии IRR. Наибольшее количество IRR транскриптов сконцентрировано в почках. В нервной ткани IRR экспрессируется в холинэргических нейронах, а также в симпатических и чувствительных нейронах, локализованных совместно тирозинкиназным рецептором TrkА в NGF-позитивных нейронах [39]. В желудке транскрипты IRR обнаружены в энтерохромаффинных клетках.
Были получены мыши, нокаутные по гену IRR [43]. Уровень глюкозной и инсулиновой толерантности у нокаутных мышей не отличался от обычного. На накаутных по IRR мышах показано развитие метаболического алкалоза и снижения уровня выделения бикарбоната в мочу при внешней щелочной нагрузке на почки [44]. Филогенетический анализ последовательностей, ортологичных IRR, показал, что этот рецептор как самостоятельная единица, отличная от IR и IGF-IR, впервые появилась в амфибиях и сохранилась в млекопитающих. Также этот анализ выявил сильное селективное давление, предполагающее, что еще какая-то важная функция IRR осталась неизвестной [45, 46].
Активация рецептора IRR посредством щелочи запускает внутриклеточную передачу сигнала, которая частично напоминает сигнал от инсулинового рецептора. При этом происходит фосфорилирование IRS-1 и AKT/PKB [44]. Таким образом, активация гена IRR (равно как и его химер с IR) может запускать инсулиновый сигнальный путь [37]. Кроме того, при активации средой с щелочным pH наблюдалась перегруппировка актинового цитоскелета [44, 179]. Химерные рецепторы, в которые был вставлен внутриклеточный сигнальный домен IRR вместе с эктодоменами других активируемых рецепторов, могут передавать сигнал по инсулиноподобным сигнальным путям, включающим субстраты инсулинового рецептора (IRS-I и II) [37], GAP-ассоциированный белок p60 и Shc. Кроме того, химеры рецептора IRR и рецептора BDNF могут активировать жизнеспособность нейронов и дифференциацию клеток PC12 [40, 41]. Показано, что сигнальные свойства киназного домена IRR значительно отличаются от тех, что принадлежат IR и IGF-IR [42].
Рецепторная тирозинкиназа IRR (рис. 5A, B) имеет сложную пространственную структуру, она представляет собой гомодимер молекулярной массой 290 кДа без учета вклада гликозилирования. IRR синтезируются в виде единой цепи прорецептора, гликозилируется, затем протеолизируется и транспортируется к клеточной поверхности. В результате получаются и субъединицы, соединенные дисульфидными связями. В -субъединице от N- к C- концу располагаются два лейцин-богатых домена, обозначаемых L1 и L2, между которыми находится цистеин-богатый домен СR. За этим блоком следуют три фибронектин-подобных домена: FnIII-1, FnIII-2 и FnIII-3, причем граница между субъединицами проходит по FnIII-2 домену, один конец которого расположен в -субъединице, а другой в -субъединице. Две части FnIII-2 разделены в предшественнике так называемым вставочным доменом (ID), который содержит сайт протеолиза. Внеклеточный домен FnIII-3, трансмембранный домен и тирозинкиназный домен находятся в -субъединице [29]. Как и остальные рецепторы семейства рецептора инсулина IRR гликозилирован.
Несмотря на более чем 30-летние исследования структуры и механизмов активации этих рецепторов, многое на сегодняшний день остается неясным. На данный момент известна структура внеклеточной части рецептора инсулина, а также закристаллизована часть внеклеточного домена рецептора инсулина вместе с инсулином [180, 181]. Структура внеклеточной части рецептора инсулина получена в комплексе с четырьмя Fab фрагментами моноклональных антител, что позволило стабилизировать его структуру и в итоге получить кристалл для рентгеноструктурных исследований. Тем не менее, до сих пор неясно, какие именно конформационные изменения происходят в этих рецепторах при их активации, и каков механизм автофосфорилирования их внутриклеточных частей. На сегодняшний день существует четыре различные модели активации этих рецепторов[182].
Очистка
Первым этапом шла подготовка культуральной среды к очистке, для этого бессывороточную культуральную среду центрифугировали при 3000 g в течение 15 мин., а затем фильтровали через мембрану 0,22 мкм. Это выполнялось для того, чтобы избавится от клеток и их фрагментов в среде.
По известной аминокислотной последовательности с помощью биоинформатического портала ExPASy была рассчитана изоэлектрическая точка белка, которая равнялась 6.11. В качестве второго этапа мы решили использовать очистку с помощью анионообменной хроматографии. Для подготовки к очистке исходную культуральную среду разбавляли в 2 раза 40 мМ Трис-HCl, рН 8.0, для того чтобы разбавить концентрацию солей и для того, чтобы целевой белок приобрел заряд и был способен связаться с анионообменной смолой на колонке. Далее в среду добавляли 0,02% NaN3 для консервации и 0,1 мМ ингибитора протеаз PMSF. Использовали колонку C 16/20 (GE, США) с TOYOPEARL DEAE-650 (Tosoh, Япония) объемом 25 мл. Смола TOYOPEARL DEAE-650M является слабым анионообменником состоящим из гидроксилированных гранул метакрилового полимера, к которым пришит диэтиламиноэтил (DEAE), имеет размер пор 100 нм и размер гранулы 65 мкм. Колонку уравновешивали в стартовом буфере 20 мМ Трис-HCl, pH 8.0. Культуральную жидкость объемом 5 литров, содержащую эктодомен ГОЛ, наносили на колонку и элюировали со скоростью потока 4 мл/мин. Данный этап очистки проводили при температуре +4оС. Перед элюцией колонку промывали 50 мл стартового буфера. Элюцию проводили линейным градиентом концентрации хлорида натрия от 0 до 1 М в 20 мМ Трис-HCl, pH 8.0 объемом 100 мл. Целевой белок элюируется с колонки в интервале концентраций от 200 до 300 мМ NaCl. Анализ собранных фракций проводили в денатурирующих условиях гель-электрофорезом в 8% ПААГ с добавлением -меркаптоэтанола (рис. 11).
Данный этап очистки позволил сконцентрировать культуральную жидкость приблизительно в 100 раз и выделить из среды положительно заряженный в данном буфере целевой белок. Фракции с максимальным количеством целевого белка объединяли.
. С целью идентификации эктодомена IRR, использовали вестерн-блот с ранее нами полученными и охарактеризованными поликлональными антителами кролика к фрагменту эктодомена IRR человека [44]. Данные антитела были получены на участок N –концевого фрагмента эктодомена IRR с 539 по 686 аминокислотный остаток. В качестве образцов для анализа, использовали образец культуральной жидкости и объединенную фракцию после очистки на DEAE-650. В качестве вторичных антител применяли конъюгаты с пероксидазой хрена (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Для иммуноокрашивания применялся хемилюминесцентный субстрат SuperSignal West Pico (Pierce). Для визуализации использовалась система Fusion Solo (Vilber Lourmat). В результате вестерн-блот анализ подтвердил идентичность выделенного эктодомена IRR (рис. 12).
Следующим этапом очистки элюционную фракцию с DEAE-650 переводили в стартовый буфер 100 mM NaCl, 20 мМ Трис-HCl, pH 8.0 при помощи «обессоливающей» гель-фильтрации на колонке C 26/40 (GE, США) с TOYOPEARL HW-55F (Tosoh, Япония) объемом 200 мл. Смола TOYOPEARL HW-55 представляет собой гидроксилированный метакриловый полимер с размером пор 50 нм и размером гранул 45 мкм, используется для гель-фильтрации биомолекул размером от 1000 до 700 000 Да. Образец наносили на колонку и элюировали со скоростью потока 1 мл/мин.
Далее применяли анионообменную хроматографию высокого разрешения с использованием колонки MonoQ 5/50 GL (GE, США) объемом 1 мл. Смола MonoQ представляет собой монодисперсный пористый полистирол/дивинилбензол с размером гранул 10 мкм, в качестве активной группы служит ион аммония. Колонку уравновешивали стартовым буфером 20 мМ Трис-HCl, pH 8,0. После нанесения образца, сорбент промывали 10 мл стартового буфера. Связавшийся белок элюировали линейным градиентом концентрации хлорида натрия от 0 до 1 М в 20 мМ Трис-HCl, pH 8.0 объемом 10 мл. Данный этап очистки позволил сконцентрировать раствор белка для следующего этапа очистки. Анализ собранных фракций проводили в денатурирующих условиях гель электрофорезом в 8% ПААГ с добавлением -меркаптоэтанола (рис. 13). Фракции с максимальным содержанием белка, использовали на следующем этапе очистки.
Следующим этапом очистки использовали гель-фильтрацию на колонке Superose 6 Increase 10/300 GL (GE, США) объемом 24 мл. Смола Superose 6 Increase представляет собой сшитую агарозу, используется для разделения молекул по размеру в диапазоне от 5 000 до 5 000 000 Да. Колонку уравновешивали буфером, содержащим 150 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl pH 7.0. Образец наносили на колонку и элюировали со скоростью потока 0,5 мл/мин. За один цикл хроматографии на колонку наносили не более 500 мкл фракции белка. Данный этап очистки позволил очистить целевой белок из смеси по его молекулярной массе. Анализ собранных фракции проводили в денатурирующих условиях гель-электрофорезом в 12% ПААГ с добавлением -меркаптоэтанола (рис. 14). Фракции с максимальным количеством целевого белка объединяли.
В процессе очистки нами было замечено, что раствор IRR имеет бурый оттенок. Методом энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (аналитический метод элементного анализа вещества, базирующийся на анализе энергии эмиссии его рентгеновского спектра) нами было показано, что в образцах фракций эктодомена IRR присутствуют следы железа и кальция (рис. 15, табл. 3).
Создание системы гетерологической экспрессии полноразмерного IRR.
С использованием методов генной инженерии в вектор pcDNA-IRR-HA, полученный нами ранее [44], вместо HA-тага (HA-Human influenza hemagglutinin, гемагглютинин гриппа человека) была клонирована последовательность ДНК, кодирующая зеленый флуоресцентный белок GFP. Для возможности дальнейшего отщепления, перед GFP вводили последовательность, включающую сайт расщепления энтерокиназой (DDDDK). В результате был получен плазмидный вектор pcDNA-IRR-GFP, содержащий все необходимые элементы для успешной экспрессии целевого мембранного белка IRR-GFP. Продуцируемый белок содержал последовательно следующие элементы: на N-конце сигнальный пептид, затем последовательность рецептора IRR, сайт расщепления энтерокиназой и GFP-таг.
Для гликопротеинов эукариотического происхождения, имеющих сложную структуру, необходимым условием эффективной экспрессии является использование клеток млекопитающих, что позволяет сохранять нативную третичную структуру и посттрансляционные модификации. Особенные свойства нашего объекта исследования определили выбор в качестве продуцента эукариотической клеточной линии HEK293, представляющей собой эпителиальные клетки почек эмбриона человека. Дальнейшим этапом работ стала транзиентная трансфекция клеточной линии HEK293 полученным вектором с помощью липофекции. Клетки выращивали на среде DMEM, для масштабирования экспрессии использовали матрасы T175 (Eppendorf). Уровень экспрессии и локализацию целевого рецептора, оценивали на конфокальном микроскопе (рис. 28).
Исходя из представленных изображений, можно заключить, что IRR эффективно экспрессируется и имеет ярко выраженную мембранную локализацию в отличие от GFP, представляющего собой цитоплазматический белок.
В результате удалось определить, что данный рецептор способен активироваться средой с щелочным значением pH без отщепления GFP-тага на C-конце (рис. 29).
Окрашивание IRR проводили антителами против фосфорилированной формы рецептора anti-pIRR и антителами к -субъединице рецептора anti-C-IRR, полученными нами ранее [44].
В результате, нами разработана система гетерологической экспрессии в клеточной линии HEK293 полноразмерного человеческого IRR, слитого по С-концу с GFP-белком. Показано, что экспрессируемый рецептор локализуется в цитоплазматической мембране и сохраняет свою функциональную активность. Полученный белок может быть использован для дальнейших исследований структуры и функции IRR.