Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время в селекции сельскохозяйственных культур все большее значение приобретают методы генной инженерии. Они дают возможность переносить в растения и экспресснровать гены различных признаков практически из любых организмов. При этом не происходит нарушения генетической целостности сорта, что открывает перспективы для создания форм сельскохозяйственных растений с уникальными свойствами, которые невозможно получить методами традиционной селекции.
Груша является одной из важнейших плодовых культур умеренной климатической зоны. По производству плодов, 14.5 млн. т в 1998 году (FAO, 1999), она занимает второе место среди всех листопадных плодовых растений, уступая только яблоне. Несмотря на наличие сотен и сотен сортов груши, задача улучшения ее сортимента по-прежнему стоит перед селекционерами. В настоящее время наиболее актуальным является выведение сортов с повышенной устойчивостью к возбудителям грибных и бактериальных заболеваний. Перед селекционерами России стоит проблема улучшения вкусовых качеств существующих сортов, обладающих достаточной зимостойкостью, но относительно невысокими вкусовыми характеристиками. Перспективным является и получение гербицидоус-тойчивых подвоев, наиболее соответствующих современным способам содержания почвы в садах. Все эти проблемы с трудом поддаются решению методами традиционной селекции, что объясняется трудностями селекции груши как плодового растения - (высокая степень гетерозиготності!, сезонность работ, позднее вступление в плодоношение) и недостатком или отсутствием доноров соответствующих признаков. Поэтому задача разработки новых методов селекции этой культуры является весьма важной.
Достижения генной инженерии плодовых культур гораздо скромнее, чем для многих других видов сельскохозяйственных растений. Это связано как с ограниченным знанием их генетики и физиологии, так и с трудностями в регенерации из соматических тканей. Но даже и на этом фоне заметно отставание груши - только в последние годы появились отдельные работы по переносу в эту культуру маркерных генов (Mourgues et al., 1996; Меркулов и др., 1998).
Генная инженерия позволяет не только улучшать существующие сорта сельскохозяйственных культур, но и является мощным инструментом для
проведения фундаментальных исследований в области молекулярной генетики, физиологии и биохимии растений. Разработка методов генетической трансформации груши будет способствовать не только прикладным целям получения новых и усовершенствования существующих сортов этой культуры, но также лучшему пониманию фундаментальных процессов ее биологии.
Цели и задачи исследований. Целью работы являлось получение трансгенных растений груши обыкновенной (Pyrus communis L.) с экспрессией генов устойчивости к различным фитопатогенам, модификации вкуса плодов и устойчивости к гербицидам. Исходя из этого, решались следующие задачи:
1. Разработать методику регенерации растений груши из соматических
тканей для сортов отечественной селекции.
2. Разработать эффективную методику агробактериальной
трансформации груши с помощью маркерных генов, а также изучить: а)
влияние различных селективных агентов на эффективность трансформации;
б) влияние интрона в конструкции гетерологичного гена на уровень и
стабильность экспрессии.
3. Получить трансгенные растения груши с экспрессией гена
суперсладкого белка thaumatm Л, гена растительного дефензина R.S-AFP2 и
гена устойчивости к гербицидам bar.
Научная новизна. Изучен морфогенетический потенциал 9 сортов и 2 подвоев груши отечественной селекции. Разработана эффективная методика регенерации побегов из листовых эксплантов. Разработана эффективная методика агробактериальной трансформации груши. Определены оптимальные для трансформации груши селективный агент и тип экспланта. Показано положительное влияние присутствия растительного интрона в конструкции гетерологичного гена на уровень и стабильность его экспрессии. Впервые получены трансгенные растения груши с экспрессией генов хозяйственно-ценных признаков. Ген thaumatin Л впервые перенесен в древесное растение, а ген bar - в плодовую культуру. Показана возможность неоднократной трансформации груши и впервые получены "двойные" трансформанты древесной плодовой культуры.
Практическая ценность работы. Разработанная методика агробактериальной трансформации груши может быть использована для переноса генов хозяйственно-ценных признаков и для проведения фундаментальных исследований по биологии этой культуры. Полученные
трансгенные растения груши с экспрессией генов устойчивости к фитопатогенам, модификации вкуса плодов и устойчивости к гербицидам могут быть использованы как для непосредственного промышленного возделывания, так и в качестве исходного материала в селекционной работе.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на II, III и IV Пущинской конференции молодых ученых (Пушино, 1997-99), научных конференциях МСХА (Москва, 1997, 1998), отчетной конференции ФИБХ за 1996-1997 гг. (Пушино, 1997), VIII конференции "Новые направления биотехнологии" (Москва, 1998), IV чтениях, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова (Москва-Пушино, 1998); на международных конференциях: 5lh Intern. Congress of Plant Molecular Biology (Сингапур, 1997). Intern. Congress on Molecular Genetics (Каир, 1998), IX Intern. Congress on Plant Tissue and Cell Culture (Иерусалим, 1998), XXV Intern. Horticultural Congress (Брюссель, 1998), XV EUCARPIA 1998 General Congress "Genetic and Breeding for Crop Quality and Resistance" (Витербо, 1998), 9th Intern. Congress "Molecular Plant-Microbe Interactions" (Амстердам, 1999), EUCARPIA Simposium on Fruit Breeding and Genetics (Дрезден, 1999).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследований, заключения и выводов. Работа изложена на 192 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы и 41 рисунок. Библиография включает 363 источника, из них 353 на иностранных языках.
Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ.