Введение к работе
Актуальность теин. Значительные успеха, достигнутое в области генетической трансформацій соматических клеток заводных /То— малин Н.В., 1S87; Глебов O.K., IS89/, ститлулир свали рост числа работ, в которых исследуется илл используется матод генетической трансформашг. За прозедшие 10 лет генетически трансформированные клетки с. али одним из самых оачяых инструментов в исследовании экспрессии генов шекопитаовдх, механизмов злокачественной трансформацій, процессов репликации и рекомбинации ДНК. Однако, многие вопросы, в особенности касагзэдеся экспрессии чужеродных генов в соматических клетках, остаются невнясненнъоа.
Актуальность работ по генетической трансформации, клеток тси-вотных связана так? с трудностям, которые выявились ври-ср о-ізводстве генно-щтекерных белков в прокариот них клетках и дроте-sax. Сни обусловлены неудовлетворительным выходом продуктов, їлотностью к дороговизной методик очистки белков и потерей или значительным синением биологической активности некоторых эукари-этических белков /особенно таких, для биологической активности, соторых существенны поеттрансляционнне модификации, в частности 'Лйкозилирование/. В последнее время предпринимаются попытки івести чужеродную информация в организмы с целью создания траяс-енных тевотных, содержащие и продувдруших чужеродные белки' дрнст л.к., 1S90/. Однако, методы генетической инженерии для шеаопатаюсах, и особенно для сельскохозяйственных животных пока ' едостагочяо разработаны. Для того, чтобы получать и использовать рансгеяных млекспитажиюс в биотехнологии, необходимо изучать актеры, от котсрыт зависит тканеспецифичность экспрессии чужзред-
ных генов .регуляция экспрессии введенных генов, чтобы контролировать уровень выработка нужного продукта. Необходимы дальне'йшие исследования, направленные на изучение проблем взаимодействия ге нема соматических клеток с чужеродной генетической информацией. Кроме того, изучение свойств ракомйинантной ДНК и способности, к экспрессии в культивируемых клетках, открывает возможность, для анализа чужеродных генов до введения их в животных.
Цель и задачи исследования. Цель исследования состояла в изучении экспрессия гена поверхностного антигена вируса гепатит. В, введенного в клетки сельскохозяйственных животных.
Для достижения намеченной цели необходимо было решить сле-дуювде задачи:
отработать технику введения чужеродной ДНК, провести генетиче кую трансформацию клеток сельскохозяйственных животных /СПЗВ и ТР ЮРТ"/, культивируемых 1л viifO ;
создать стабильные линии клеток, экспрессирукяДне ДНК плазмид продуцируювде чужеродный белек;
изучить экспрессию гена поверхностного антигена вируса гепаю та В э клетках СПЭВ ТК~;
изучить возможность регуляции трансгена в культуре генетичес трансформированных клеток;
сравнить экспрессию гена HBsAo в искусственно созданной эксп риментальней системе /генетически трансформированные клетки сельскохозяйственного животного/ с закономерностями естестве ней экспрессии гена HBjAQ в культуре клеток гепатокарцаномы ловека BJ.C/ERF-5; '
изучить влияние вдтодифференцировка клеток гепатокарцаномы г довока на экспрессию в них HBsAo.
Научная новизна. Впервые в нашей стране проведен анализ
петентности мутантних клеток сельскохозяйственных животных /СПЭВ ТК~ и ТР ІФРГ-/ к поглощению и экспрессии чужеродных генов. Выделены наиболее компетентные клоны клеток к аккумуляции и экспрессии трансфицкруемых ДНК длазкид pEF и р\/-2ор , содержащих ген ТК ВДГ-1 и ген КГіРТ Е. со& соответственно. Показано, что клетки свиньи СТИВ ТК- можно использовать для введения и экспрессии чужеродньх генов с достаточно высокой эффективностью трансформации /2-6-1Э-3/.
Получены генетически трансформированные клетки СПЭВ, содержащие ген поверхностного антигена вируса гепатита В, поставленного под контроль разных регуляторних последовательностей /промоторы &TR. вируса саркомы Рауса и гена МТ-1 кънш/. Установлено, что по эффективности трансформации, продукции HBsAo л стабильности экспрессии гена HBsAg более эффективным в клетках СПЭВ ТК- является промотор jffil вируса саркомы Рауса.
Впервые проведено сравнительное изучение экспрессии гена HBjAq в двух экспериментальных, системах: в искусственной /генетически трансформированные клетки почки эмбриона свиньи/ и естественной /клетки гелатокарвдномн человека РХС/РКР-5. Показано, что по числу, клеток, синтезируявд HBjAq, а также по активности секре-тируемрго HBsAq, клетки трансформированных клонов превосходят клетки гепатокарпиномн в 8-10 раз.
Проведено сравнительное иммуяопитохидаческое изучение экспрессии генов ЗГВ в клетках мутантних клонов гепатокарпиномн РЛС/РКР-5, проявляющих признаки ндтодяфференцировки в различной степени. Установлено, что в клетках части клшов, характеризующихся более высокой степенью цитодифференцзровки /по скорости и характеру роста, экспрессии альфа-фетопротеина и способности, к образованию опухолей у бестимусных мышей/ усиливается экспрессия
гена HBsAo и индуцируется экспрессия HBcAq.
Практическая значимость. Показана пригодность клеток мутантних штаммов с.-х. животных /СШВ ТК~ и ТР ШТ~/ для получения генетических трансЗормантов. Получены генетически гран сформированные перевиваемые клетки свиньи, продуцирующие ген поверхностного антигена вируса гепатита В человека, продукт экспрессии которого может иметь медицинское значение.
Показана возможность прогнозирования более элективной экспрессии гена HBsAg под контролем промотора j Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены: на конференции "Современные направления создания медицинских дда-гностикумов", г.Москва, декабрь 1990 г.; на 44-й научно-методической конференции аспирантов и молодых ученых ВИЗа, п.Дубровицы, июнь 1991 г.; на втором Всесоюзном симпозиуме "теоретические а прикладные аспекты молекулярной биологии" в г.Самарканде, сентябрь 1991 г.. Структура и сбъем работы. Диссертация излотена на 134 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результати, обсуждение, выводы и список литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 12-го таблицами и 15-ю рисунками» Список литературы содержит Є1 источник на русском и 191 на иностранных языках. 1. СОБСТВЕННЫЙ ИССЛЕДОВАНИЯ '.. ,1.1. Материалы и методы исследований. В настоящей работе были использованы независимо полученные мутантные клональные сублинии от двух перевиваемых культур с.-х.- животных: свиньи /клетки почки эмбриона свиньи СГОД}/и крупного рогатого скота /клетки трахеи эмбриона коровы ТР/. Полученные Тугизовым Ш.М. в 1985 г. клетки CTIdB несли одинарные по ?<>рменту тимиданкиназа /DC/ или двойные /по ТК~ -Уабаш?83'/ мутации. Клетки ТР несли одинарные по ферменту гипоксантингуанинфосфорибс— зилтрансфераза /1ФРТ~/ или двойные /по ГФРТ~-УабаиігезУ мутации. Использовали также перевиваемую линию культуры клеток гепатокар-цинсмы челове :а ftyj/PRF-5, имеющуп в своем геноме интегрированную полную генетическую информацию вируса гепатита В /ВГВ/ /<Леиал~ В работе были использованы питательные среды Игла ІЙИ, Игла Д"ЕЧ, сыворотка эмбриона коровы, различные растворы, необходимые для культивирования клеток и постановки экспериментов. Клеточные линии поддерживали путем периодического пассирования в культуральннх сосудах. Пересев клеток осупвствляли по мере формирования монослоя.с помощью 0,025? версена и 0,25 трип сана в соотношении 9:1 бесцентрифужным способом. Посевная доза составляла 5'1Сг-1'10 клеток в мл.. Концентрацию и жизнеспособность клеток контролировала путем окраска 0,1$ раствором трипакового синего с последующим шкроскошрованием. Краоконсервирование и хранений клеточных культур осуществляли по стандартным методикам. Для трансфекщи клеток использовали рекомбинантные ЩК плаз-мид: Плаздада pV-2gpi /фирма "ge/iva" ФРГ/. Сконструирована на основе векторной плазмидн рВК322, содержит маркерный ген ксантингуа-нан фосфорибозилтрансфераза /opi / Е. со& /АііЩоал R.. ti.at, 1980/. Плазмида pFP. Плазмида была предоставлена Филатовым Ф.П. /инсти-1 тут шрусологии. РШН/. В составе векторной плазмидн рВД322 BAM HI-Q. фрагмент ДОК ВПГ-1 размером 3,6 квр /2.2 Mo/, содержащий ТК ген этого вируса /Салатов СП., 1S91/. Плаз?.здда pSPAS-27. Плазмида была такчсе предоставлена Филатовым Ф.П.. Плазмида рКРAS-2 7 с рекомбннантнш геном PASi собранным из последовательностей preg/yPl HAV/HBsAq а поставленным noj контрой, промотора &ТЯ.-вируса саркомы Рауса. В состав плазмидк входят последовательности вирусов: g\/40, саркомы Рауса /?5V /, гриппа А человека /1аУ, гены белков НА и л/р/, гепатита А чело века /HAV, участок гена V'Pl/, гепатита В человека /ВВІ/, гены белков НВбАо/ /$ / с участками зон рге-1 и рге-2 и X, часть ге на HBCAQ /С/ и энхансер /е/ /Силатов 4.П., 1S91/. Плазмида pt/C-19, содержащая ген поверхностного антигена вируса гепатігга В дед контролем промотора гена МТ-1 мыши, и плазмида pAQO, содержащая ген ТК ВПГ-1, были предоставлены Ениколопо-вым Г.Н. /лаб. нуклеиновых кислот института молекулярной биолс гии РАН/ Рекомбинантная конструкпия pUQ-19 помимо клонирование! комплементарной ДНК генаНВїАо, содержала прсмоторную область, включающую«акхансер /промотор и часть 5-кснцевсй нетранслируе-мой области .м?НК/ гена МГ-1 мыши, донорной и акцепторный участ ки сплайсинга из ранней области, вируса 3/40 и участок полиаде: дарования из этой же области. ДНК-носитель. В качестве ДНК-носителя в экспериментах использо вали ДНК спермы лосося' /Зирма "0." 4РГ/. Перед транс?ектей плазмадные ДНК двукратно пере осаждали эт налоіл к растворяли в стерильном буфере /0,1 Ш ЭДТА, 1 Ш трас-' рН 8,0/. Конечная концентрация ДНК составляла 20 мкг/мл. Трансфекцяю проводили кальщё-(Тосфатным методом /Глебов 0. и др., 1985/. Через 24 ч. после трансфзквди клетки раосевали по 1«10^ на чашки Петра "Cojiar" диаметром 10 см. в. селективную cj ГУ ГАТ, содержащую гипоксанткн /13,6 мкг/мл /, аминоптерин '0,176 мкг/мл /, тжгядя! /3.78 мкг/мл/ /cUUfceM ei.&L t LS64; 1965/. Выросшие на 12-15 сут. колония либо выделяли с по-лощья титановых сшшдров по методике /Абрамян Д.С. и др. 1981/, шбо фиксировали метанолом 15 мин.- и окрашивали 10? красителем Гам-за /водный раствор/ в течение 15 ман.. Выделенные колонии трансформированных клеток разкнотали. на среде ГАТ и заморатавати. Ана-аз клонов пр шодили спустя 5-10 сут. культивирования на среде ГАТ 10еле размораживания клеток. Экспрессию гена НЗзАо определяли с помощью мояоклональнгос штател к HBjAp, полученных и проверенных на специфичность в лаб. слеточной инженерии института вирусологии им. Д.И. Ивановского >А'Я Лущ А.А. и др., 1986; 1SP7/. Натачие HBsAo в культуральной тддкоста и в клеточном 'лизате зпределялп с помогаю двух методов: в реакции пассивной гемагглюти-іашл /использовачи эритросахарный. диагностикум Горьксвского НИИ ?Л/ и твердофазного иммуноферментного анализа, разработанного в інституте вирусологии им. д.и. Ивановского РА'.И /Кущ А.А. и др., .987/. Очистку МКА к HBsAo проводили на протеине А, иммобилизованном іа С(6г-се$арозе 4В/рАддаас1^а "Швевдя"/. DqG, к HBjAq специфически связавшлеся с иммуносорбентсм, снимали 0,1 М глициновым буфером >Н 3,0 с моментальной нейтрачизашей 1 М ТРІЗ рН 8,9. JoCj к HBsAo :сньюгпровачи с пероксидазой хрена /ГК/ їирмьг "tymu." с Р&-3.0. Я связквзли с 3qQ к ПЗ?Ад в белковом соотношении 1:1 по пераодат- ому методу /t/a.lca.nt it а., 19Р4/. Для выявления экспрессии гена НЗ?Ао в клетках культуры исполь-ювала кммуногЕтохлмнческие методы: меїод непрямой иммунофлюорес-іенпли /ИФ/ и клеточный вариант иммуноферментного анализа /кИФА/ / Cftrk** d, at , 1981/. Клетки выращвалв в пекицилиновых флаконах с покровными стеклами. Концентрація клеток в суолензии составляла 1,5-2,0>10 клвт/ы объем суспензии 1,5-2,0 мл,. Клетки фиксировали, яра комнатной температуре 105? забуференным формалином /20 мин./, а затем дофикси-ровали 70$ этанолом /20 мин./. При проведения КФ использовали антивидовой, против 3gQ мши, коньюгат меченный ШТЦ /фирма "$Ша Клетки микроскопировали под водной иммерсией на микроскопе ."лю-ман", используя фильтры /с длиной волны 470-4S0 нм./. Цри постановке кИФА применяли козлиные антитела против tfgCj мной меченный ПХ /фирма "Buo-Ract'/ и диаминбензидин' тетрахлорид фирмы "Sigma." з качестве субстрата. Внутренний белок вируса гепатита В человека /НВсАо/ определяли с помощью иммуноглобулинов антя-HBcAq человека. Наличие альфа-фетопротеина в культуре кле.ток гепатокарцинокы человека ?JsC/P%F-5 выявляли с помощью метода пероксидаза-антиле-роксидаза / Тацог- el, а^.,1978/. МКА к АФП бшш предоставлены Язозой А.К. /НИИ Канцерогенеза ОНЦ РАМН/. Антивидовая сыворотка и ПАП-комплекс были предоставлены арайзер ТД. ' /НИИ Канцерогенез ОНД РАМН/. Онкогенные потенцш клеток изучали путем введения бестимуснь мышам Вав/Ц /ш/пцяли оо/ш. / подкожно в область сшшы по 2>10 клеюк. Подсчитывали число мышей с опухолями через 3 недели. Способность роста в мягком агаре /2,5/2-й слой агара $)фо / определяли по частоте образования колоний. Клонирование клеток ' осуществляли путем посева их в различных концентрациях /1«1Сг, 2«102, 5-10^, 1-Ю3/ на чашку Петри диаметром 60 мм. Клетки, фи) сировали в 70# этаноле и окрашивали по Гимза. Подсчитывали число выросших клонов и определяли ко8ффивдент вффективности клширова ния, как отношение числа выросших клонов к общему числу посеянных клеток. Анализ ДНК выполняла с помочью дот-гибридизации. Суммарную ДНК выделяли аз клеток по :.ятоду / Vlirfl^li^i^ ei, q. , 1981/. ДНК Денатурировалц щелочью и наносил,; точки на капроновый фильтр, фиксировали ери. 80С в течение 2ч. в вакууме и гибридизовали с $рагментамн і лазт.идн рКРАЗ меченной ***%> с помощью ник-трансляции Ліаниатис Т. і др., 1S85/.