Формирование изомеров металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27a при про-зависимом фолдинге Сафина Дина Рашидовна

Содержание к диссертации

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ ..„. 5

RRFTTFHHF 6

ГЛАВА L ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8

1.1. Про-завнсимый СрОЛДіїНГ О СП КО В KfH OmiHIItlHtltfflVtll'»!.!»,, _iat О

1.1.1. Про-зависимы фолдинг протеолитических ферментов „ 9

1.2. Термолизин-подобные металлопротеиназы .._ _ _ 17

1. Структурно-функциональная организация термолизин-подобных металлопротеиназ

2. Организация активного центра молекулы термолизина _ 21

3. Организация субстрат-связывающего кармана 23

4. Организация сайтов связывания ионов кальция » „ 26

5. Про-последователыюсти термолизин-подобных металлопротеиназ _ _ _ 31

1.3. Термолизин-подобная металлопротеиназа

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЕДОВАНИЯ „ 48

6. Микробные штаммы и плазмиды » „ 48

7. Культивирование микроорганизмов _ 49

8. Выделение плазмидной ДНК _ „ _ 49

9. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот 49

10. Ферментативный гидролиз..- _._ _ 50

11. Полимеразная цепная реакция 50

12. Получение конструкций, обеспечивающих экспрессию модифицированных генов металлопротеиназ в клетках штамма ^

JJ LiK-rbiL t4jj J l-tL/ltl t J J~\J t (J H n ніші ніп )111111111^441(11141( mj \-f

2.8. Обработка амплификационпых фрагментов полипуклеотидкиназой 51

2.9. Трансформация клеток }\Лаі1іІО tJVtC^tlilO /~Vj t JflHt- нш кнниі н І ) І 41II Мишин! rnjL

2.10. Трансформация клеток Escherichia coli штаммы XL-1 (Blue) и

11. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 52

12. Анализ динамики накопления протеолитических ферментов в культуралыюй жидкости штаммов-продуцентов В. subtihs AJ73 _ 53

13. Анализ динамики накопления целевых белков в клетках Е. coli BL-21, несущих экспрессионные плазмиды _ 53

14. Экстракция нерастворимых целевых белков из мембранных фракций рекомбинантпых штаммов-продуцентов, несущих экспрессионные

J. 1J J.UO 1Y1 ХІ^^іУА-шц+мшмшяіц ллщшшш шнш | *.******»* ****** W** *# +* » <»»><»»»*» *»» mwwmmw *+«! »*»« in ><» »»»»** *J tj

15. Очистка целевых белков из биомассы штаммов-продуцентов, несущих экспрессионные плазмиды .._ „ „,„ 54

16. Очистка металлопротеиназы на аффинном сорбенте — 55

17. Электрофоретический анализ белков „.. 55

18. Количественное определение белка. _ _ 56

19. Фолдинг в системе in cis _ — 56

20. Фолдинг в системе in trans..„ _ _ _ _ „.. 56

21. Определение протеолитической активности ферментов 57

22. Влияние температуры на стабильность фермента _.. 57

23. Статистическая обработка данных _ 58

24. Представление молекул _ _.. 58

25. Компьютерный анализ результатов электрофорезов „ 58

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ _ 59

1. Характеристика металлопротеиназы Thermoachnomyces sp. 27а 59

2. Конструирование мутантных вариантов металлопротеиназы Thermoactinomyces sp, 27а, с делегированной дополнительной С-копцевой последовательностью _.. 60

3. Характеристика модифицированных вариантов металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а. - - 66

4. Конструирование изолированных фрагментов металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а „ 70

5. Биосинтез мутантных вариантов металлопротеиназ Thermoactinomyces sp. 27а, В. brevis, В. amylohquefaciens в клетках г..

3.6. Анализ внутриклеточной локализации модифицированных

вариантов металлопротеиназ в клетках Е. coh BL-21 „ 79

7. Очистка изолированных частей металлопротеиназ Thermoactinomyces sp. 27 и В. amylohquefaciens. - 80

8. Фолдинг металлопротеиназы Thermoactinomyces sp\2't'а 83

9. Фолдинг металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а в присутствии чужеродной про-последователыюсти 85

ЗЛО. Очистка вариантов металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а,

полученных при проведении фолдинга в системах in as и in trans 87

3.11. Характеристика металлопр отеиназ Thermoactinomyces sp. 27а,

реактивированных в системах in cis и in trans..„.~,- - 88

К TT А ГО ПАРНОСТИ Я?

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ _ _ 93

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ИПТГ

МХАХ

ПААГ

трис

ФМСФ

ЭДТА

Era^r

X-gal

изопропил-Р-О-тиогалактопиранознд металл-хелат аффинная хроматография

нитрилтриуксусная кислота

полиакриламидпый гель

полішеразная цепная реакция

трис(гидроксил)-аминометан

ультразвук

феїшлметилсульфонилфторид

этилепдиамиптетрауксусная кислота

ампициллин

ген устойчивости к ампициллину

ген щелочной металлопротеиназы хлорамфеиикол

ген устойчивости к хлорамфениколу

динигрофенил

эритромицин

ген устойчивости к эритромицину

ген металлопротеиназы

металлопротеиназа

5-бром-4-хлор-3-индолил-рМ>галактопиранозид

Введение к работе

Современная биотехнология включает в себя целый ряд разнообразных, быстро развивающихся социально ориентированных направлений исследований. Сюда входит создание новейших лекарственных препаратов, диагностикумов, разработка новых способов утилизации промышленных отходов и многое другое. При этом успехи современной биотехнологии во многом связаны с использованием разнообразных ферментов или ферментативных систем, позволяющих, с одной стороны, оптимизировать традиционные производства (на основе замены химических подходов энзиматическими или за счет повышения эффективности уже существующих ферментативных процессов), а с другой - развивать совершенно новые направления. Уровень современной белковой инженерии и ее успехи в области, направленной па оптимизацию биотехнологического производства, дают основания предпологать, что уже в достаточно скором времени конструирование оптимизированных ферментов de novo или на основе имеющихся полимерных, молекул станет реальной лабораторной практикой и позволит существенно повысить эффективность биотехнологических процессов, основанных на использовании биокатализаторов. Тем ни менее, на настоящее время наши знания о молекулярных механизмах, определяющих структурно-функциональные взаимосвязи в белковых молекулах, ещё не достаточны для направленного создания ферментов с заданными свойствами. Широкое применение в современной биотехнологии получили протеолитические ферменты (в частности, продуцируемые микроорганизмами, обитающими в уникальных природных и искусственных экосистемах), которые являются перспективными для практического использования, а также весьма интересными с научной точки зрения. Так одним из интригующих и мало изученных вопросов является механизм образования ферментами корректной пространственной структуры, а так же способность на базе одной и той же аминокислотной последовательности формировать функционально-активные белковые молекулы с различными свойствами.

Данная работа посвящена изучению возможности образования функционально различающихся изомеров протеолитических ферментов в ходе про-зависимого фолдинга на модели термолизин-подобной металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. Работа поддержана грантами РФФИ № 00-04-48280, № 00-04-48281, № 03-04-48755.

7 Цель работы.

Целью данной работы являлось выяснение возможности конструирования различающихся по специфичности действия протеолитических ферментов на базе единой аминокислотной последовательности без внесения замен в функционально существенные области молекулы.

Научная новизна.

Впервые сконструированы разнообразные модифицированные варианты гена металлопротеиназы Thermoactmomyces sp., осуществлена их экспрессия в клетках Bacillus subtilis и Escherihia coh и охарактеризованы соответствующие белки. Показано, что данный фермент формирует свою пространственную структуру по про-зависимому механизму и продемонстрировала возможность получения стабильных, отличных по своей субстратной специфичности, протеиназ на базе одной аминокислотной поел едовательности.

Практическая значимость.

Полученные результаты открывают новый подход для конструирования протеолитических ферментов с модифицированными свойствами, в частности, измененной субстратной специфичностью. Поскольку протеиназы занимают лидирующее место среди ферментов, используемых в практических целях, то этот подход может быть использован при оптимизации целого ряда биотехнологических производств.

Положении, выносимые на защиту.

1. Конструирование и характеристика модифицированных вариантов металлопротеиназы Thermoactmomyces sp.

Доказательство протекания фолдинга металлопротеиназы Thermoactmomyces sp. по про-зависимому механизму.

Изучение возможности использования гетерологичных про-последовательностей в качестве фолдинг-ассистентов.

4. Конструирование на базе одной полипептидной цепи протеолитических ферментов, отличающихся по своей субстратной специфичности.