Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 15
1.1. Этапы формирования биопленок 15
1.1.1. Обратимое прикрепление 15
1.1.2. Необратимое прикрепление 16
1.1.3. Формирование микроколоний 17
1.1.4. Формирование биопленки 17
1.1.5. Дисперсия биопленки 18
1.2. Структура биопленок 18
1.2.1. Вода 19
1.2.2. Экзополисахариды 19
1.2.3. Внеклеточные белки 20
1.2.4. Внеклеточная ДНК (внДНК) 21
1.3. Факторы, влияющие на адгезию бактерий 22
1.3.1. Факторы окружающей среды 23
1.3.2. Характеристики поверхности материала 23
1.3.3. Бактериальные характеристики 25
1.3.4. Сывороточные или тканевые белки 26
1.4. Механизмы резистентности к антимикробным препаратам 27
1.4.1. Неспособность антимикробных агентов проникать к отдельным клеткам в составе биопленки 27
1.4.2. Фермент-опосредованная резистентность 28
1.4.3. Метаболическое состояние организмов в биопленке 28
1.4.4. Гетерогенность клеток, растущих в составе биопленки 29
1.4.5. Quorum sensing (QS) 31
1.4.6. Присутствие персистирующих клеток в биопленках 33
1.4.7. Эффлюксные насосы 34
1.4.8. Структура внешней мембраны 37
1.4.9. Стрессорный ответ 37
1.4.10. Генетические адаптации 38
1.4.11. Горизонтальный перенос генов 38
1.4.12. Частота мутирования 39
1.4.13. Фенотипы колоний 40
1.5. Стратегии борьбы с бактериальными биопленками 40
1.5.1. Ингибирование системы сигнализации c-di-GMP 40
1.5.2. Ингибиторы Quorum sensing 41
1.5.3. Диспергирование внеклеточного полисахаридного вещества биопленки ферментами 43
1.5.4. Расщепление пептидогликана 44
1.5.5. Ингибирование путем деструкции матрикса биопленки 44
1.5.6. Изменение мембранного потенциала или пермеабилизация мембран 45
1.5.7. Ингибирование деления клеток и выживания 46
1.5.8. Ингибирование адгезии бактериальных клеток к поверхности 46
1.5.9. Ингибирование биопленки полисахаридами 47
1.5.10. Комбинированная терапия 48
1.5.11. Бактериофаги 48
1.5.12. Липосомы 48
1.5.13. Наночастицы металлов 49
1.5.14. Эфирные масла и жирные кислоты 54
2. Обсуждение результатов 58
2.1. Чувствительность планктонных культур Methylophilus quaylei к антибиотикам 59
2.2. Влияние олеата натрия на жизнеспособность планктонных культур бактерии M. quaylei 64
2.3. Получение биопленок бактерии Methylophilus quaylei на тефлоне и полипропилене 65
2.3.1. Характеристика материалов для выращивания биопленок 65
2.3.2. Формирование биопленок на поверхности полипропилена и тефлона 66
2.4. Влияние антибиотиков на жизнеспособность бактерии M. quaylei в сформированных биопленках 67
2.5. Влияние олеата натрия в комбинации с антибиотиками на биопленки бактерии M. quaylei 68
2.5.1. Определение жизнеспособности бактерии M. quaylei в биопленках в присутствии олеата натрия в комбинации с антибиотиками 68
2.5.2. Количественная оценка биопленок M. quaylei методом окрашивания красителем кристаллическим фиолетовым 72
2.5.3. Микроскопическое исследование архитектуры биопленок M. quaylei 73
2.6. Влияние полимиксина B на формирование биопленки бактерией Methylophilus quaylei 80
2.7. Получение и характеристика биогенных наночастиц серебра на основе бактерии Methylophilus quaylei 83
2.7.1. Получение и характеристика биогенных наночастиц серебра на основе нативных культуральных жидкостей штаммов бактерии M. quaylei MT и M. quaylei SM 83
2.7.2. Получение и характеристика биогенных наночастиц серебра на основе бесклеточной культуральной жидкости M. quaylei MT 86
2.8. Влияние наночастиц серебра на жизнеспособность планктонных культур бактерии M. quaylei 88
2.9. Изучение антибиопленочного действия биогенных НЧС 89
3. Экспериментальная часть 99
Выводы 111
Список литературы 113
- Гетерогенность клеток, растущих в составе биопленки
- Эфирные масла и жирные кислоты
- Микроскопическое исследование архитектуры биопленок M. quaylei
- Изучение антибиопленочного действия биогенных НЧС
Гетерогенность клеток, растущих в составе биопленки
На скорость роста и метаболическую активность бактерий влияют различия в концентрации и составе питательных веществ и наличии кислорода в биопленках. Уровень роста и активности бактерий внутри биопленки подтверждается различной концентрацией метаболических субстратов и продуктов [60]. Это приводит к гетерогенности микробной популяции. Метаболическая активность клеток стимулируется питательными веществами и кислородом в периферической области биопленки, которая поддерживает размножение бактерий.
Напротив, из-за плохой диффузии питательных веществ ограничивается метаболический потенциал внутри пленки, что приводит к медленному росту клеток в матриксе биопленки. Оценку метаболической гетерогенности и скорости роста клеток проводят, анализируя синтез клеточных ферментов внутри биопленки [61]. Изменения в цикле роста бактерий влияют на уровень синтеза ферментов пропорционально клеточной массе. В стационарной фазе или в медленно растущих бактериях синтез клеточных ферментов прекращается [62]. Биоциды действуют на метаболически активные бактерии, в то время как бактерии в фазе покоя менее восприимчивы к антимикробным агентам [63]. Повышение устойчивости бактериальных биопленок к антимикробным агентам подтверждает представление о гетерогенности скорости метаболического роста. Метаболическая активность зависит от наличия кислорода в биопленках. Биопленка P. aeruginosa при обработке антибиотиками ципрофлоксацином и тобрамицином погибает в чистом кислороде, однако снижение доступности кислорода повышает устойчивость к антибиотикам [64]. Образование биопленки также повышает уровень устойчивости к антибиотикам путем экспрессии определенных генов в анаэробных условиях. Процессы, ведущие к гетерогенности популяции, представлены на рисунке 7.
Эфирные масла и жирные кислоты
Эфирные масла (ЭМ) являются природными противомикробными агентами с широким спектром действия против бактерий, грибков и вирусов [156]. ЭМ могут ингибировать продукцию АТФ и активность АТФазы. Более того, ЭМ нарушают проницаемость мембран и транспорт протонов и жирных кислот через мембраны, что приводит к утечке метаболитов и ионов. Некоторые ЭМ действуют как QSI, воздействуя на гены QS и регулируя их, что приводит к снижению образования биопленок и продукции факторов вирулентности.
Свободные жирные кислоты (СЖК) представляют собой биологически активные амфифильные соединения. Когда экзогенные СЖК взаимодействуют с бактериями, они включаются в бактериальные мембраны, что вызывает увеличение текучести и проницаемости мембран клеток, изменяет их метаболизм, а также заряд и гидрофобность клеточной поверхности [157,158]. Предполагаемые механизмы антибактериального действия жирных кислот представлены на рисунке 18.
Ненасыщенные СЖК проявляют бактерицидное действие, нарушая цепь переноса электронов и окислительное фосфорилирование [158]. Кроме того, многие исследования показывают, что СЖК способны стимулировать рост бактерий и повышать жизнеспособность в условиях стресса. Согласна работам [159, 160], жирные кислоты, особенно олеиновая кислота и ее метиловые эфиры, ускоряли рост и увеличивали продукцию экзополисахарида Methylophilus quaylei, а также увеличивали жизнеспособность в условиях осмотического и окислительного стресса.
Олеиновая кислота проявляла наибольшую активность в оживленни дормантных клеток, что было связано с повышением уровня циклического АМФ и активацией клеточного метаболизма [2]. Некоторые СЖК способны влиять на Quorum Sensing бактерий, в частности, в структуре биопленок. В одном из исследований сообщалось, что цис-2-деценовая кислота способна вызывать дисперсию сформировавшихся биопленок Pseudomonas aeruginosa, а также других микроорганизмов [161]. Пальмитолеиновая и миристолевая кислоты ингибируют образование биопленки A. baumannii и снижают экспрессию регуляторов системы QS [162].
Действительно, использование одних только антибиотиков и биоцидов для разрушения биопленок недостаточно, поскольку они хорошо известны как стимуляторы образования биопленки [163]. Современная стратегия борьбы с биопленками состоит в том, чтобы сочетать биоциды со специфическими антибиопленочными веществами, которые могут влиять на механизмы образования и дисперсии биопленок [164, 165]. Среди этих веществ -ненасыщенные жирные кислоты (НЖК)) [164, 160, 166]. Во всех известных случаях значительный антибиопленочный эффект НЖК наблюдается при использовании в концентрациях, которые не ингибируют рост [164, 166].
Микроскопическое исследование архитектуры биопленок M. quaylei
Для изучения изменений в структуре и морфологии биопленки М. quaylei МТ и М. quaylei SM выращивали на полипропиленовых купонах в течение 24 часов (Рисунок 7), затем биопленки переносили в свежую питательную среду с добавками олеата натрия и ампициллина и культивировали еще 24 ч. Затем купоны фиксировали формалином, высушивали, напыляли слоем золота и исследовали методом СЭМ (Рисунки 12-14). Для исследования методом световой микроскопии биопленки обрабатывали раствором кристаллического фиолетового и высушивали (Рисунки 12-14). В качестве контроля использовали биопленки, выращенные в питательной среде без добавок 48 часов. На СЭМ-микрофотографии М. quaylei МТ (Рисунок 12 А) показана биопленка, которую культивировали 48 ч без добавок. В этих условиях штамм М. quaylei MT формирует плотные биопленки, в которых клетки бактерий практически полностью покрыты матриксом. Биопленки обоих штаммов демонстрируют многослойную структуру, которая состоит из клеток, собранных в микро- и макроколонии, окруженные водными каналами.
Интересно, в присутствии 0.03 мг/мл олеата натрия в биопленках M. quaylei MT клетки оказались распределены более хаотично, соприкасаются друг с другом только полюсами, и водные каналы не видны (Рисунок 12 Б1,2). Визуализация с помощью СЭМ (Рисунок 12 Б1) показала уменьшение плотности матрикса увеличение пористости биопленки. Биопленки M. quaylei SM с олеатом натрия (Рисунок 14 Б), по данным световой микроскопии, в отличие от штамма M. quaylei MT, содержали больше водяных каналов, характеризующихся четкими очертаниями и значительно большим поперечным сечением по сравнению с контролем (Рисунок 14 А1, 2).
Для двух штаммов M. quaylei механизмы действия олеата натрия на биопленки оказались различны. Визуализация биопленки, полученной на полипропилене в присутствии олеата натрия показала, что расположение клеточных слоев в гидрофобном штамме М. quaylei MT было хаотичным, а жизнеспособные клетки занимали большее пространство. Плотность биопленки уменьшилась, что, очевидно, повлияло на рост бактерий и увеличило чувствительность к ампициллину. На структуру биопленки менее гидрофобного штамма M. quaylei SM олеат натрия влиял иначе: водные каналы заметно увеличились. Такая структура биопленки может способствовать интенсивной диффузии питательных веществ и кислорода в клетки, что приводит к ускорению роста и повышению эффективности антибиотиков.
Добавление 10 мкг/мл ампициллина к сформированным биопленкам М. quaylei MT приводит к изменению формы отдельных клеток, появлению нитчатых, удлиненных форм, погруженных в матрикс, в биопленке образуются поры (Рисунок 12 В1, 2). Совместное использование 0.03 мг/мл олеата натрия и 10 мкг/мл ампициллина сильно изменяет вид биопленки – переплетение нитчатых клеток формирует сильно пористую структуру, практически лишенную матрикса (Рисунок 13 Г1, 2). В присутствии ампициллина в концентрации 100 мкг/мл количество бактериальных клеток резко уменьшается, клетки приобретают укороченную и даже сферическую форму (Рисунок 13 Д1, 2). Визуализация с использованием световой микроскопии и СЭМ биопленок М. quaylei MT при добавлении ампициллина в концентрации 100 мкг/мл и олеата натрия в концентрации 0.03 мг/мл вызывает разрушение архитектуры биопленок, в поле зрения практически отсутствуют интактные клеточные структуры (Рисунок 13 Е1, 2). Аналогичную картину наблюдали и для штамма M. quaylei SM (Рисунок 14).
В литературе нами не было обнаружено примеров аналогичного влияния олеата натрия и других жирных кислот на архитектуру и жизнеспособность клеток в биопленках. Стимулирующее действие олеата натрия на клетки имеет большое значение в формировании антибиопленочного эффекта из-за активации медленно растущих клеток в глубоких слоях биопленки, которые не чувствительны к ампициллину. Олеат натрия также может активировать персистирующие клетки. Исходя из наших предыдущих результатов [167], дзета-потенциал клеток при рН 7.0 в 0.1 М КС1 составляет -39.03 мВ для М. quaylei SM и -40.97 для штамма МТ. Добавление 0.015 мг/мл олеиновой кислоты в культуральную среду приводит к увеличению отрицательного заряда клеток до -44.48 и -54.56 мВ дляМ quaylei МТ иМ quaylei SM, соответственно. Увеличение отрицательного заряда клеток обычно приводит к усилению отталкивания, что может приводить к уменьшению агрегации клеток в биопленке. Особенно важным представляется обнаруженный нами синергидный антибиопленочный эффект олеата натрия в сочетании с антибиотиками на биопленки М. quaylei, и этот эффект усиливался при увеличении концентрации олеата натрия.
Изучение антибиопленочного действия биогенных НЧС
Для исследования влияния НЧС на жизнеспособность бактерий в составе предварительно сформированных биопленок нами были выбраны две концентрации НЧС – 9 и 18 ppm – равная концентрации для планктона и в два раза ее превышающая. Для определения значений КОЕ в биопленках их выращивали на ПП купонах в течение 24 часов, затем переносили в среду, содержащую а) полную питательную среду (контроль); б) стерильную БКЖ; в) комбинацию БКЖ и суспензии НЧС в отношении 3:1 по объему НЧС, содержащую 9 ppm НЧС; г) БКЖ и суспензию НЧС в отношении 1:1 по объему, содержащую 18 ppm НЧС и далее еще инкубировали в течение 24 ч. Результаты, полученные методом подсчета КОЕ, представлены на рисунке 24, а СЭМ-микрофотографии на рисунках 25-28. Эксперимент показал значительное дозозависимое снижение количества жизнеспособных клеток в составе биопленок обоих штаммов в присутствии НЧС. Действие НЧС на штамм M. quaylei MT, как и для планктонной культуры (Рисунок 23), интенсивнее, чем на штамм M. quaylei SM. Наибольший эффект был обнаружен при 18 ppm. Интересно, что в отличие от действия на планктон сама БКЖ M. quaylei MT обладает значительной ингибирующей активностью в отношении биопленок обоих штаммов. Для биопленки M. quaylei MT lоg(КОЕ/мл) был незначительно ниже, чем для M. quaylei SM.
Ранее [160] было обнаружено присутствие свободных жирных кислот и их метиловых эфиров в культуральной жидкости и клеточных липидах М. quaylei MT. Можно предположить, что антибиопленочный эффект бесклеточной культуральной жидкости M. quaylei MT может быть связан именно со свободными жирными кислотами в ее составе. Наши результаты согласуются с данными, представленными в работах, которые продемонстрировали, что причина ингибирующей активности БКЖ связана с присутствием их компонентов – экзополисахаридов или свободных жирных кислот [180-185]. Обнаруженный нами дозозависимый антибиопленочный эффект НЧС согласуется с антибиопленочной активностью НЧС, о которой сообщалось ранее [186, 187]. Так было обнаружено ингибирующее действие НЧС, полученных с помощью бактериальных БКЖ, на биопленки B. subtilis и S. aureus [186], E. coli, P. aeruginosa [187] в интервале концентраций НЧС 7.8-62.5 ppm.
Характеристика архитектуры биопленки методом СЭМ
Для изучения влияния НЧС на структуру и морфологию биопленок M. quaylei SM и M. quaylei MT их предварительно выращивали на ПП купонах в течение 24 часов, затем исходную среду заменяли питательной средой без добавок (контроль) (Рисунки 25, 26 А1, 2), бесклеточной культуральной жидкостью M. quaylei MT (Рисунки 27, 28 Б1, 2), смесью суспензии НЧС 18 ppm и БКЖ M. quaylei MT (Рисунки 25, 26 В1, 2), смесью суспензии НЧС 18 ppm и питательной среды (Рисунки 27, 28 А1, 2), суспензией НЧС 18 ppm и олеата натрия в концентрации 0.03 мг/мл (Рисунки 25, 26 Б1, 2), и далее еще инкубировали в течение 24 ч. Полученные биопленки изучали методом СЭМ.
Биопленки M. quaylei SM и M. quaylei MT, полученные в контрольных условиях без добавок, представляют собой скопление клеток типичной палочковидной формы без видимых, погруженных в полимерный матрикс. Выдерживание сформированных биопленок в среде БКЖ M. quaylei MT приводит к уменьшению количества клеток, что хорошо согласуется с данными подсчета КОЕ. Обработка биопленок растворами наночастиц серебра в комбинации с БКЖ радикально изменяет морфологию отдельных клеток, включая образование нитевидных и удлиненных клеток, а также фрагментов клеток без цитоплазматического содержимого. Замена БКЖ на питательную среду в комбинации с НЧС действует подобным образом, но не так интенсивно. Клетки бактерий массово не разрушаются, хотя можно обнаружить в поле зрения микроскопа частично или полностью лизированные при непосредственном контакте с НЧС клетки (Рисунки 27, 28 А2). Наибольший эффект на биопленочные структуры обнаружило совместное использование НЧС и раствора олеата натрия - разрушение биопленки и структурные изменения в клеточной стенке бактерий, особенно сильные у штамма M. quaylei SM (Рисунок 25, Б1). Предположение, сделанное нами выше, о связи антибиопленочного эффекта бесклеточной культуральной жидкости M. quaylei MT с присутствием в ее составе свободных жирных кислот подтвердилось исследованиями методом СЭМ. Комбинация БКЖ и НЧС показала аддитивный ингибирующий эффект, который проявлялся в более выраженном разрушении структуры биопленки, но наибольшие разрушения биопленки, особенно сильные у штамма M. quaylei SM, были обнаружены в присутствии комбинации НЧС и олеата натрия.
Деление бактериальных клеток координируется множеством клеточных процессов [188]. На микрофотографиях биопленок M. quaylei SM (Рисунок 28 А1, 2) и M. quaylei MT (Рисунок 27 А1, 2), полученных в присутствии 18 ppm НЧС, обнаруживаются удлиненные клетки. Деление бактериальных клеток управляется несколькими белками-регуляторами [189]. Основываясь на наших результатах и литературных данных, мы предлагаем модель, согласно которой НЧС могут влиять на деление бактериальных клеток путем ингибирования функциональных белков, связанных с делением, что приводит к удлинению клеток [189]. В случае M. quaylei SM (Рисунок 28 А1, 2) обнаружены признаки лизиса клеток и потери внутриклеточного содержимого в присутствии 18 ppm НЧС. Можно предположить, что образование нитевидных клеток схоже с механизмом влияния ампициллина на форму бактериальных клеток [190] и может быть связано с взаимодействием НЧС с белками, связывающими пенициллин, что приводит к их ингибированию и лизису клеток.
Нельзя исключить и другие механизмы механизмы антимикробного действия НЧС [191-194]: 1) НЧС осаждаются на поверхности бактерий, а затем влияют на проницаемость клеточной мембраны; 2) в результате связывания ионов серебра с ДНК происходит нарушение структуры ДНК и ингибирование репликации, а связывание их с серусодержащими белками приводит к ингибированию функций этих белков; 3) НЧС индуцируют образование активных форм кислорода (АФК), вызывающих образование высокореакционноспособных радикалов, что является одной из основных причин повреждения клеток; 4) поглощение ионов серебра может приводить к нарушению синтеза АТФ.
Однако наибольший антибиопленочный эффект, обнаружен нами в присутствии комбинации НЧС с олеатом натрия или бесклеточной культуральной жидкостью M. quaylei MT, содержащей свободные жирные кислоты. Это подтверждает вывод, сделанный нами ранее о влияния олеата натрия и других жирных кислот на архитектуру биопленок и увеличение пористости, что увеличивает доступность клеток для антибиотиков и наночастиц серебра. Таким образом, олеиновая кислота, не ингибирующая планктонный рост бактериальных клеток и слабо влияющая на биопленочный рост, проявляет сильное антибиопленочное действие в сочетании с антибиотиками и наночастицами серебра. Этот синергидный эффект основан на способности олеиновой кислоты изменять физико-химические свойства поверхности клетки, а также свойства липидного бислоя.