Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 11
1.1. Разнообразие и применение биосовместимых материалов 11
1.2. Свойства биосовместимых материалов
1.2.1. Основные биологические свойства 16
1.2.2. Основные физико-химические и механические свойства
1.3. Использование биосовместимых материалов для 3D культивирования 21
1.4. Использование поли(3-гидроксибутират) для 3D-культивирования клеток
1.4.1. Основные свойства поли(3-гидроксибутирата) 24
1.4.2. Биосинтез и внутриклеточная деградация поли(3-гидроксибутирата) 27
1.4.3. Области применения поли(3-гидроксибутирата)
1.5. 3D-культивирование клеток на матриксе, основанный на поли(3-гидроксибутирате) и его сополимеров 30
1.6. Культивирование мезенхимальных стволовых клеток мыши 32
1.7. Репликативное старение клеток в культуре 35
1.8. Области применения стволовых клеток в медицине
1.8.1. Получение стволовых клеток 37
1.8.2. Применение МСК в медицине: перспективы и проблемы 39
ГЛАВА 2. Материалы и методы 42
2.1. Материалы и оборудование 42
2.2. Объекты исследования 45
2.2.1. Мезенхимальные стволовые клетки мыши
2.2.2. Полимерный матрикс 47
2.3. Изготовление полимерных матриксов 52
2.4. Исследование морфологии и пористости матриксов 52
2.4.1. Исследование физико-термических свойств матриксов
методом дифференциальной сканирующей калориметрии 53
2.4.2. Исследование механических свойств полимерныхматриксов...53
2.4.5. Исследование гидрофильности полимерных матриксов 54
2.5. Культивирование МСК мыши на матриксе 54
2.5.1. Фенотипирование МСК мыши методом проточной цитометрии 55
2.5.2. Определение старых МСК мыши методом окрашивания на -галактозидазу 55
2.5.3. Направленная дифференцировка МСК мыши в остеоогенную и адипогенную дифференцировку 56
2.5.4. Проверка МСК мыши, культивируемых на матриксе, на иммортализацию 57
2.5.5. Микроскопия 57
ГЛАВА 3. Результаты исследования и их обсуждение 58
3.1. Исследование полигидроксибутирата 58
3.1.1. Получение полигидроксибутирата 58
3.1.2. Термо-физические характеристики полигидроксибутирата 60
3.2. Сравнение параметров роста МСК мыши на матриксе и пластике 62
3.2.1. Характеризация поверхностного фенотипа и направленная дифференцировка МСК 62
3.2.2. Изучение скорости пролиферации МСК мыши на матриксе из ПГБ и культуральном пластике 65
3.3. Сканирующая электронная и конфокальная микроскопия 71
3.4. Влияние матрикса из ПГБ на размеры клеток 76
3.5. Влияние матрикса из ПГБ на старение клеток 80
3.6. Проверка МСК на иммортализацию 84
Заключение 86
Выводы .88
Список сокращений 90
Cписок литературы
- Использование поли(3-гидроксибутират) для 3D-культивирования клеток
- Мезенхимальные стволовые клетки мыши
- Фенотипирование МСК мыши методом проточной цитометрии
- Изучение скорости пролиферации МСК мыши на матриксе из ПГБ и культуральном пластике
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время активно развиваются научные направления, связанные с применением стволовых клеток (СК) в медицине. Такие перспективные области медицины и биологии как регенеративная медицина и тканевая инженерия не могут развиваться в отрыве от исследования СК. Значительное внимание в современной биомедицине уделяется восстановлению костной ткани, внутренних органов и кожи методами тканевой инженерии. Это, в том числе, связано с тем, что поражение органов и тканей в результате различных хронических заболеваний, травм и врожденных патологий занимают одно из первых мест среди причин смертности, временной нетрудоспособности и развития инвалидности. Кроме того, развитие таких междисциплинарных научных направлений способствует активному развитию и внедрению в клиническую практику целого ряда новых биотехнологических и биоинженерных методик, а также вносит вклад в выход фундаментальных исследований в биомедицине на новый уровень благодаря интеграции медицины, биологии, других естественных наук (физики, химии и др.) и инженерных дисциплин.
Одной из основных проблем использования СК в экспериментальных исследованиях
и медицинской практике является то, что в процессе выращивания и культивирования в
стандартных условиях клетки быстро стареют и замедляются в росте. Для того чтобы
преодолеть эту проблему, клетки стали культивировать на особых матриксах из
синтетических и природных биоматериалов, где СК находятся в среде, приближенной к
естественному окружению в организме. Использование таких матриксов и
культивирование клеток млекопитающих ex vivo позволяет исследовать физиологию изолированных клеток и тканей в условиях, более приближенных к естественным, а также необходимо для практического использования СК в регенеративной медицине.
Получение биоматериалов привело к новому направлению материаловедения, изучающего взаимодействие искусственных материалов с живыми клетками, тканями и органами: для нужд регенеративной медицины с целью полноценного замещения тканей и органов. Такие биоматериалы могут способствовать регенерации тканей, как в естественных условиях, так и при использовании различных биоинженерных методов стимуляции и управления регенерацией, как вне организма, так и внутри него. Для этого важно правильно имитировать естественные носители – внеклеточные матриксы. Важная роль внеклеточного матрикса – субстрат для прикрепления клеток, так как большая часть из них растет, лишь прикрепившись и распластавшись по твердому субстрату. Клетки, отделенные от внеклеточного матрикса, быстро теряют жизнеспособность и подвергаются
запрограммированной клеточной смерти – апоптозу, что часто наблюдается при культивировании клеток в объеме.
В настоящее время для разработки новых матриксов и подложек для тканевой
инженерии и регенеративной медицины используют биодеградируемые и
биосовместимые полимеры, такие как полигидроксиалканоаты (ПГА) - поли(3-гидроксибутират) (ПГБ) и его сополимеры, получаемые биотехнологическим путем.
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) жировой ткани являются перспективным инструментом клеточной терапии при различных заболеваниях, поскольку они способны трансформироваться в любые клетки соединительной ткани: в адипоциты, фибробласты, хондробласты, остеобласты и другие. В связи с этим возникла основная задача – размножение стволовых клеток в культуре для дальнейшего их применения в терапевтических целях.
При использовании стволовых клеток в медицинской практике возникает ряд
проблем, в частности, низкая частота встречаемости стволовых клеток (СК) в органах: их
сложно наработать в больших количествах, так как через небольшое время
культивирования клетки начинают стареть, что препятствует их использованию в качестве
терапевтического средства. Один из признаков старения – клетки начинают увеличиваться
в объеме, что весьма затрудняет их миграцию в пораженные органы и ткани. Например,
при внутривенном введении МСК, из-за своих размеров клетки попадают в так
называемые капиллярные ловушки в различных тканях, особенно в легких, что весьма затрудняет их миграцию в орган-мишень. Также возможна доставка МСК путем их введения непосредственно через артерии, ведущие в выбранный орган, но подобный путь может привести к таким осложнениям, как микрососудистая окклюзии. Так же сильно влияет на эффективность лечения стволовыми клетками продолжительность времени их культивирования in vitro. К примеру, высокая эффективность достигается, если клетки вводятся пациенту сразу после их выделения, а если клетки культивировать 24-48 часов, то эффективность терапии резко снижается, так как размножение клеток в больших количествах in vitro вызывает их старение и снижает их жизненный потенциал. Кроме того, чтобы получить большое количество первичных выделенных МСК, клетки нужно выделять из нескольких различных тканей с различиями в фенотипе, что также представляет проблему для использования МСК в терапевтических целях.
Для достижения воспроизводства стволовых клеток без потери их
биофункциональности, необходимо создать для них микроокружение с определенными характеристиками. Одним из подходов к решению данной проблемы является создание матриксов с развитой пористой структурой из биосовместимых полимеров.
Биосовместимые и биоразлагаемые полимеры, поли(3-гидроксибутират) и его сополимеры, получаемые микробиологическим путем, можно использовать для создания таких пористых матриксов с целью культивирования и размножения МСК в необходимых количествах для терапевтических целей, что представляет большой интерес для регенеративной медицины и тканевой инженерии.
Цeль рaбoты - изучение возможности длительного культивиpoвания МСК из
жирoвoй ткани мыши на поpиcтoм матриксе из поли(3-гидроксибутирата), подбор оптимальных условий роста клеток и замедление клеточного старения клеток в процессе их культивирования.
В соответствии с цeлью исследования были сформулированы следующие задачи:
- Получение пористого матрикса из поли-3-оксибутирата и исследование его
морфологии и физико-химических свойств.
- Подбор оптимальных условий культивирования МСК из жировой ткани мыши и сравнение параметров роста МСК мыши в условиях 2D (культуральный пластик) и 3D (биополимерный матрикс) культивирования.
- Исследование изменения размеров МСК мыши при культивировании клеток на
матриксе.
- Оптимизация условий для наработки МСК мыши при сохранении их клеточного
потенциала, жизнеспособности и замедления старения.
Научная новизна. B хoдe данной рaбoты впервые были подобраны оптимальные условия для культивирования МСК на матриксе из полимера ПГБ, синтезированного микробиологическим биосинтезом штаммом-продуцентом Azotobacter chroococcum 7B.
На примере МСК мыши было продемонстрировано, что пористый полимерный матрикс подходит для долговременного культивирования МСК, впервые было исследовано долговременное культивирование МСК мыши из жировой ткани на пористом матриксе из ПГБ, проводилось сравнение параметров роста МСК мыши в условиях 2D- и 3D- культивирования.
Впервые было показано уменьшение размеров МСК при культивировании на пористом матриксе. Изучена биосовместимость матриксов in vitro на культуре МСК мыши. Показана бльшая выживаемость клеток, культивируемых на матриксе, по сравнению с контролем. Также показано увеличение скорости роста МСК на матриксе.
Показано, что клетки, культивируемые на матриксе, меньше подвергаются старению. Показано, что клетки, культивируемые на матриксе не претерпевают
трансформацию, было показано, что клетки при длительном культивировании сохраняют свой поверхностный фенотип.
Пpaктичecкaя знaчимocть. Разработаны новые методы долговременного
культивирования МСК на пористом матриксе из ПГБ с использованием МСК из жировой
ткани мыши, которые пригодны для культивирования МСК в большом количестве для
дальнейших терапевтических и научно-исследовательских целей. Разработаны
оптимальные условия для долговременного культивирования и поддержания жизнеспособности клеток, а также наращивания клеточной массы. Также были получены данные, что при культивировании МСК на матриксе их размеры уменьшаются, что способствует возможному применению МСК для клеточной терапии. В перспективе разработанная методика может быть применена для наработки МСК мыши (широко используемого лабораторного животного в биомедицине) в биореакторах для научно-исследовательских целей, а научные основы метода – для наработки МСК человека с целью их клинического использования. Таким образом, полученные данные показывают, что трехмерный матрикс на основе ПГБ, является подходящим субстратом для долговременного культивирования МСК для их возможного дальнейшего применения в терапевтических целях в регенеративной медицине, а также в научно-исследовательских целях.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 статьей в журналах из перечня ВАК ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, 1 опубликована в зарубежном рецензируемом журнале.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы, содержащий ссылки на 144 источников. Диссертация иллюстрирована 39 рисунками и 3 таблицами.
Использование поли(3-гидроксибутират) для 3D-культивирования клеток
Стволовые клетки играют важную роль не только в разработке новых методов лечения и регенерации тканей, но и используются в качестве модели для биологических исследований. Использование СК, как неограниченного источника тканевой инженерии, дало надежду для регенерации тканей организма в лабораторных условиях. Тем не менее, влияние материала на развитие клеток в трехмерной структуре еще недостаточно изучено. Биоинженерные подходы к культивированию клеток, которые сочетают микросреды, включают в себя управление тканеспецифическим транспортом и сигнализацией и являются важными деталями для изучения развития тканей и регенерации. Вещественный состав и структура материала, используемого при культивировании клеток, влияют на их дифференцировку, рост и поведение. Различная модификация физических и биохимических свойств материала может влиять на дифференциацию СК. Например, культивирование СК в 3D матриксе, изготовленных из коллагена фибронектина, стимулирует дифференцировки клеток эндотелия; а добавление ламинина повышает способность эмбриональных стволовых клеток дифференцироваться в кардиомициты [3]. Последние исследования показывают, что биоматериалы можно представить как основные регуляторные сигналы, которые сочетаются с другими факторами при создании искусственной микросреды, с целью контролировать судьбу стволовых клеток. Предполагается, что многие перспективные терапевтические применения стволовых клеток потребуют разработку конструктивных материалов, оказывающих влияние на фенотип стволовых клеток. В этих материалах дифференциация столовых клеток происходит так же, как и в естественных условиях, что можно использовать для регенерации тканей, восстановления тканевого развития, гомеостаза и восстановления после травм на протяжении всей жизни. Регенерация изношенных и пораженных тканей с использованием некоторых форм клеточной терапии становится все более вероятным и приобретает все более широкие масштабы [4]. Компоненты внеклеточного матрикса (extracellular matrix, ЕСМ), такие как белки, коллаген, ламинин, а так же протеогликаны, например гепарансульфат, в комбинации с коктейлем экзогенных растворимых факторов роста используются для создания микросреды, которая влияет на поведение стволовых клеток в лабораторных условиях [5]. Примeрами биоматериалов также являются инертные металлы, полимеры, модифицированные полисахариды. Тем не менее, у природных материалов есть свои недостатки: высокий потенциал загрязнения, что может вызвать иммунный ответ при имплантации.
В последние годы были достигнуты значительные успехи в получении новых биоматериалов с заданными физико-химическими и медико-техническими свойствами. Синтетические материалы специально разработаны для взаимодействия с клетками на разных этапах (например молекулярных, клеточных и микроскопических) — тем самым они имитируют элементы природной ниши СК [6]. Химические полимеры представляют большой спектр контролируемых химических, физических и механических свойств, благодаря разнообразию доступных мономеров и сополимерных структур [7]. Диапазон их свойств чрезвычайно широк и определяется, прежде всего, конкретной сферой применения. Следует отметить, что успешное применяются те биоматериалы и их структуры, которые точно имитируют химический состав и иерархическую структуру природной ткани для замены и регенерации, в том числе адаптацию к биологическим изменениям в процессе заживления тканей и органов. К часто используемым полимерам относятся полиакрамиды, полиакрилаты, полиэфиры, сложные полиэфиры, полифумараты, полифосфанезы, полигидроксибутираты, полифозфазены и многие другие. Неорганические материалы используются как остеогенная ниша, а гибриды и композиты вышеупомянутых классов — как уникальные матрицы для конкретного применения [8]. Эфиры акриловой кислоты и ее производных, так называемые биоклеи, используются в травматологии, для склеивания костей при переломах, а также для склеивания разрывов и разрезов на внутренних органах. Мембраны полиметилметакрилата, полисульфона, полиакрилонитрил являются диализно-диффузионные пленочные мембраны, применяются в аппарате «искусственная почка» [9]. Волокнистые материалы, такие как винилацета, полимер-силикатные композиты служат в качестве шовных материалов, также они используются для протезов внутренних органов; полые волокна и модули — для аппаратов «искусственные легкие». Мембраны из полимолочной кислоты, фосфатидилхолина, полиакрилата, модифицированного хитозана служат материалами для микроинкапсулирования и предназначены для создание микрочастиц диаметром от несколько микрон, которые применяются в искусственной иммунизации и введении лекарственных препаратов [10].
Эпоксисоединения, полисульфоны, полиимиды служат для создания искусственных клапанов сердца, элементов искусственного сердца. Эксперименты на стыке биологии, химии, инженерии и медицины имеют важное значение для разработки биоматериалов. Это помогает создавать аналогичные биологическим материалы для направленного развития и регенерации тканей в естественных условиях, как вне организма, так и внутри него. Получение биоматериалов привело к новому направлению материаловедения, которое изучает взаимодействие искусственных материалов с живыми клетками, тканями и органами — для нужд трансплантологии, полноценному замещению тканей и органов [11]. Например, саморегулируемые материалы, состоящие из соединительной структуры предназначены для введения между имплантатом и костной тканью для снятия напряжений из-за разности в упругости соединяемых материалов, что может привести к разрушению имплантата и порче кости.
Существуют целый ряд неорганических и функционализированных биоактивных покрытий в протезно-костной терапии [12, 13]. Такие материалы изменяют свои свойства под действием изменения внешней среды, например колебания температуры, кислотности, давления.
Саморегулируемые материалы применяют не только в хирургии, а также в стоматологии (имплантаты и протезы), в генной терапии как система высвобождения и доставки генов и биоактивных веществ; в иммунологии — вакцины, заключенные в биологические мембраны; в фармакологии — синтез и очистка лекарственных соединений, система доставки и регулируемое высвобождение. Из биоразлагаемых материалов, получают микро- и нанокапсулы, которые нашли применение в генной терапии, в заместительной гормональной терапии при лечении диабета, очистке крови от различных продуктов распада, диагностировании и лечении опухолей различного характера [14]. В виде микрокапсул выпускают такие лекарственные препараты, как витамины, антибиотики, снотворные, противовоспалительные и многие другие. Из биоразлагаемых материалов, на основе молочной и гликолевой кислоты, получают пленки, которые используются в гинекологии, стоматологии, ольфтальмологии. Например, в оперативной стоматологии полимерные пленки могут использоваться для защиты полостей от кистозных новообразований, заживлении ран при удалении зубов и тканей [15].
Мезенхимальные стволовые клетки мыши
Также МСК можно выделять из фетальных органов гемопоэза и из скелетных мышц. Метод выделенияи культивирования МСК относительно прост, но существует проблема получения однородной клеточной популяции мезенхимальных стволовых клеток в достаточном количестве для трансплантации и консервации в больших количествах. По известным методикам выращивания МСК из костного мозга обычно получают гетерогенные популяции клеток стромы с незначительным содержанием в них стволовых клеток. В работе с МСК используются традиционные методики работы с клетками [96], в каждом случае подбирая индивидуальную последовательность действий, условия выделения и наработки клеточной массы.
Чтобы получить гомогенную культуру МСК из костного мозга, клетки культивируют в среде ДМЕМ (среда Игла в модификации Дюльбекко) с фетальной бычьей сывороткой (ФБС) [97] . Существуют еще один способ получения МСК для имплантации с целью направленной остеорегенерации [98]. В другой методике в процессе получения МСК выполняют ферментативную дезагрегацию, фильтрацию через мелкоячеистое сито, центрифугирование в растворе Хенкса, ресуспендирование в ростовой среде ДМЕМ/F12, глутамин и содержащей
15% ФБС. Затем клетки сеют на пластиковые чашки и через сутки удаляют неприкрепившиеся клетки. [99]. В работе Majumdar М.К. клетки выделяли из костного мозга человека, используя экспрессию эндоглина; их культивировали в среде без сыворотки в присутствии трансформирующего фактора роста-бета (TGF-beta), используя для роста трехмерные матриксы альгинатных шариков [100]. В другой работе выделенные МСК из пуповинной крови выращивали на культуральной посуде, которая проходила предобработку в коммерческой среде MSCGM — в этом случае клетки высеивали с высокой плотностью [101].
В патенте РФ №2252252 от 20.05.2005г. описан еще один способ, где ткань сначала измельчают, обрабатывают раствором коллагеназы в среде Игла в модификации Дюльбекко, центрифугируют, а затем полученную суспензию очищают от эритроцитов с помощью лизирующего раствора и последовательно фильтруют через фильтры с разным размером пор и высеивают на матрасы или чашки Петри. Клетки получаются однородными с высоким выходом, жизнеспособными [102]. Также МСК получены из костного мозга с использованием гепарина и раствора Хенкса, а из жировой ткани — с помощью коллагеназы. Этот метод позволяет получить клетки с большим выходом [103].
Существует множество способов выделения клеток, любой из выбранных методов в зависимости от источника материала и поставленных задач.
Клеточные технологии считаются перспективным направлением в современной медицине. В настоящее время клеточная терапия с применением стволовых клеток является одним из основных подходов для лечения многих тяжелых заболеваний. МСК могут выступать в качестве эффективного лечения многих заболеваний. Применение СК в медицине в основном находится на предклинических испытаниях. Но уже в настоящее время МСК начинают успешно использовать и в клинических испытаниях, для лечения многих тяжелых заболеваний [104]. МСК используют в качестве таргетного средства в доставки терапевтических генов в опухоли различной этиологии. Были проведены опыты на экспериментальных моделях мыши, где было показано, что МСК доставляют терапевтические гены в опухоль и вызывают противоопухолевый эффект [105]. Также проводились исследования при применении МСК, как клеточное транспортное средство для адресной доставки терапевтических генов в опухоли при лечении рака молочной железы [106]. МСК также могут найти свое применение и в стоматологии: было показано, что МСК приводит к более быстрой регенерации поврежденных костей, а также к увеличению их плотности, по сравнению с результатами при естественном заживлении костей. Были проведены эксперименты на крысах, где изучали процессы регенерации нижней челюсти после введения аутологичных МСК. Результаты показали, что МСК способствуют регенерации кости [107, 108].
В отечественной работе было проведено исследование на крысах с ишемическим инсультом: результаты показали, что введение МСК активирует пролиферацию эндогенных нейрональных СК, а также активирует ангиогенез в пограничной с повреждением области, уменьшает объем поврежденной ткани мозга [109]. Уже сейчас начали проводить клинические испытания с использованием МСК при ишемическом инсульте [110, 111, 112].
В последние годы проведены эксперименты по влиянию МСК после введения крысам с черепно-мозговой травмой, которые являются одной из актуальных проблем в неотложной нейрохирургии. Известно, что ключевым фактором, отвечающим за репарацию нервной ткани, является формирование новых сосудов и генерация нервных клеток. По этим причинам использование МСК в черепно-мозговых травмах считается перспективным направлением [113, 114].
Несмотря на то, что МСК широко исследуются как в лабораториях, так и в клиниках, остается ряд нерешенных проблем, связанных с возникновением побочных действий применения МСК в терапии. К примеру, недавние исследования выявили как положительные свойства, так и недостатки МСК. Были проведены опыты на собаках, которым вводили МСК: у девяти из 10 собак развились отек легких и кровоизлияния [115]. Кроме того, введение МСК вместо нормальной регенерации поврежденного органа или ткани может запускать процесс образования тератомы, что еще больше усугубляет их функциональное состояние. Исходя из этого, использование клеточных технологий требуют дополнительных доклинических испытаний.
Фенотипирование МСК мыши методом проточной цитометрии
Полимер ПГБ, который был использован для культивирования МСК мыши, был получен путем микробиологического биосинтеза с использованием штамма-продуцента A. chroococcum 7Б. На рис. 7 показана микрофотография культуры клеток, накапливающих ПГБ. При накоплении ПГБ клетки приобретают округлую форму [121, 122].
Выход биомассы, содержащей полимер, составил 4,5±0,5 г/л, содержание ПГБ в расчете на сухую бактериальную массу составило 78,6±3,4%. Средняя молекулярная масса полимера составила 8,1104. Степень чистоты полимера составила 99,5%.
Затем, из очищенного препарата ПГБ получали пористые матриксы, показанные на рис. 8А, размером пор 170±30 мкм и пористостью 89±4%. На рис. 8Б видно, что поверхность мембран имеет множественные поры, соединенные между собой. Важно, что матриксы имеют систему сообщающихся и проницаемых пор для обеспечения подачи питательных веществ. Также важно, что структура такого матрикса должна быть трехмерной и иметь большое количество пор, которые способствует прикреплению, пролиферации стимуляции роста клеток в похожих на естественные условия in vitro. Такая структура еще способствует наработке внеклеточного матрикса. Важно учитывать механические свойства матрикса, которые должны соответствовать месту имплантации.
Придание импланту пористой трехмерной структуры также важно и для заместительной регенерации костной ткани in vivo [123, 124, 125].
Эксперимент был проведен в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН. 3.1.2. Термо-физические характеристики полигидроксибутирата
Полученная на основании анализа термограммы ДКС, как показано на рисунках 9 и 10, таблицы 2, начальная температура плавления (Tmнач) мембраны составила 151,1С, температура пика плавления (Tmпик) 168,70С. Рассчитанная степень кристалличности (Хс) ПГБ — 60,7 %. Все эти данные соответствуют физико-химическим характеристикам, ранее полученным для пленок из ПГБ [118]. Это говорит о незначительном влиянии метода порообразования с помощью газообразователя на физико-химические свойства полимера. Следовательно, можно допустить, что и
Эти данные соответствуют физико-химическим характеристикам полимера ПГБ. Таким образом, методика изготовления биополимерного матрикса не приводит к значительным изменениям физико-химических свойств полимерного материала.
Для проверки сохранения свойств МСК, культивируемых на матриксе, клетки культивировали на матриксе и культуральном пластике в течение 30 дней (10 пассажей) при гипоксии, после чего провели характеризацию их поверхностного фенотипа по нескольким наиболее употребительным позитивным и негативным маркерам МСК. Результаты этого анализа приведены на рис. 12 и в таблице 3.
Название анализируемого маркера указано под каждой диаграммой. Горизонтальные планки показывают анализируемую область, выбранную исходя из цитометрического профиля неокрашенных клеток, цифры над планкой показывают процент клеток, попадающих в анализируемую область. Горизонтальная ось показывает интенсивность флюоресценции (логарифмическая шкала), вертикальная ось — число событий. Полученные данные свидетельствуют, что картина экспрессии поверхностных маркеров культивируемых МСК соответствует литературным данным. В частности, подавляющее большинство МСК красились антителами к CD29 и CD44, являющимися позитивными маркерами; в то же время окраска негативными маркерами CD45 CD34 и CD11b отсутствовала.
По маркеру CD105 культивируемые клетки оказались гетерогенными, что также согласуется с литературными данными [148]. Существенных различий по поверхностному фенотипу между контрольными МСК, культивированными на пластике, и МК, культивированными на поли-3-оксибутиратном матриксе, не было обнаружено, что свидетельствует о том, что основные свойства МСК при культивировании на матриксе не меняются. Также смотрели свойства МСК с помощью направленной дифференцировки в остеобласты и адипоциты (рис. 13). Для направленной дифференцировки брали МСК от 3-его пассажа.
Изучение скорости пролиферации МСК мыши на матриксе из ПГБ и культуральном пластике
Проведенное нами исследование было направлено на изучение применимости полимерного матрикса на основе ПГБ, полученного микробиологическим путем синтеза штаммов Azоtоbаctеr chооcoccum 7Б, для рaзмoжeния клиничeски рeлeвaнтных типoв клeтoк для вoзмoжнoсти дoлгoврeмeнного пoддeржaния МСК мыши на матриксе в культуре. В кaчeствe тeстирoвaния были выбрaны МСК мыши, пoскoльку oни бoлее слoжны в культивирoвaнии, чeм МСК других видoв, и oтличaются высoкoй требoвaтeльнoстью к пaрaметрaм культуры. В ходе работы мы сравнивали параметры роста МСК жировой ткани мыши при длительном культивировании на культуральном пластике (2D) и на матриксе из полигидроксибутирата (3D). При этом трансформация и иммортализация клеточных культур не происходили. Были подобраны оптимальные условия культивирования клеток, которые могли бы быть пригодным для клеточной терапии и медицинских исследований. Культивирование МСК проводили в условиях гипоксии.
В хoде экспeримeнтoв по дoлгoвременнoму культивирoвaнию клeтoк, впервые было показано, что культивирование МСК мыши на матриксе из полигидроксибутирата спoсoбствует зaмeтнoму снижeнию скoрoсти стaрeния культуры. Тaкжe былo пoкaзaнo, чтo сущeствeнных различий пo пoвeрхнoстнoму фeнoтипу мeжду кoнтрoльными МСК, культивирoвaнными нa плaстике, и МСК, культивирoвaнными нa пoли-(3-гидрoксибутирaтнoм) мaтриксe, нe былo oбнaружeнo, чтo свидeтeльствуeт o тoм, чтo oснoвные свoйствa МСК при культивирoвaнии нa мaтриксe нe мeняются.
Было выявлено, что при культивировании МСК мыши на матриксе, скорость пролиферации клеток увеличивалась, количество клеток также увеличивалось по сравнению с контролем, когда клетки росли на культуральном пластике.
Нaми былo пoкaзaнo, чтo нa oбъемных пoристых мaтрикaсaх нaблюдaлaсь бoлее прoдoлжительнaя динaмикa рoстa культуры, чeм нa культуральном пластике, в котором пocле oбpaзoвaния мoнoслoя культурa клeтoк быстрo дeгрaдируeт.
Бoлee тoгo, трeхмeрный пoристый пoлигидрoксибутиратный мaтрикс, пo-видимoму, спoсoбeн зaщищaть МСК мыши oт кислopoднoгo cтpecca.
Также было отмечено, что культивирование МСК на пористом матриксе, уменьшает их размеры, что существенно важно при внутривенном введении клеток в терапии.
Из пoлучeнных в хoдe экспeримeнтa дaнныx cлeдуeт, чтo тpexмepный мaтрикс нa ocнoвe пoлигидрoксибутиpaтa является впoлнe пoдхoдящим субстpaтoм для дoлгoвpeмeннoгo культивирoвaния мышиных МСК и их 3D-рocтa в oбъeмe биoпoлимepнoгo мaтpикca и мoжeт с уcпexoм применяться в ткaнeвoй инжeнeрии для кyльтивирoвaния МСК чeлoвeкa в клиничeских цeлях. ВЫВОДЫ
Нa oснoвaнии пpовeдeнных иccледoваний и пoлученных рeзультaтов мoжнo сдeлaть слeдующие вывoды.
1. Нами получен биополимерный матрикс из ПГБ с характеристиками, подходящими для культивирования на нем клеток.
2. Впервые было показано, что при долговременном культивировании МСК мыши на пористом матриксе из ПГБ количество, скорость пролиферации клеток, а также продолжительность их культивирования увеличивалась по сравнению с контролем, различий по поверхностному фенотипу между контрольными и опытными МСК, не было обнаружено, также клетки не претерпевали трансформацию и иммортализацию, что свидетельствует от том, что основные свойства МСК при культивировании на матриксе не меняются
3. Впервые было показано, что МСК мыши при долговременном культивировании на биополимерном матриксе уменьшаются в размерах.
4. Впервые было показано, что 3D-культивирование МСК мыши на матриксе показало заметное снижение скорости старение в культуре. Благодарност и
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных исследований (грант № 14-04-01855) и при финансовой поддержке ГК №№ 16.512.11.2019, 14.740.11.1077 и 16.740.11.0652
Министерства образования и науки РФ в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007–2012 годы» и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» и ГК № 12411.1008799.13.148 Министерства промышленности и торговли РФ в рамках ФЦП «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу