Введение к работе
Актуальность работы. До настоящего времени лимонную кислоту получают с помощью грибов в периодическом режиме культивирования. В последние годы наиболее перспективным рассматривается осуществление процесса в непрерывном режиме, э также использование полупроницаемых мембран с целью удержания биомассы продуцента в ферментере и увеличения эффективности процесса.
В литеретуре мало сведений о синтезе лимонных кислот в условиях непрерывного культивирования. В лабораториях и на фирмах в Англии, Швеции и Финляндии предпринимались попытки разработать процесс непрерывного получение лимонной кислоты с помощью грибов. Но они не привели к положительным результатам, в связи с тем, что грибы трудно культивировать в глубинных условиях и биохимический механизм синтеза кислоты грибами до сих пор не понятен.
Удобной моделью для разработки непрерывного процесса получения лимонной кислоты являются мутантные дрожжи Yarrowia lipoiytica N 1, полученные в 1972 г. в Отделе биоэнергетики ІЇБЯ.1 АН СССР, преимуществом которых является высокая кислотообразующая активность при их культивировании на различных органических субстратах.
Перспективным субстратом для микробиологического получения ряда веществ является этанол. Использование этанола в качестве субстрата обеспечивает образование продукта, который может применяться в пищевой и медицинской промышленности. Ранее сообщалось, что дрожжи Y.lipoiytica ы 1 при росте на этаноле продуцируют в условиях лимитирования роста клеток практически одну лимонную кислоту (Финогенова и др.,Г979).
В последние время накапливается все больше данных, показывающих, что при культивировании дрожжей на этаноле особую важность приобретают микроэлементы (цинк и железо), которые являются интегральными компонентами многих ферментных систем, участвующих в метаболизме этанола (алкогольдегидрогеназа, альдегиддегидрогеназа, каталаза, аконитаза, цитохромы и др.) (Ильченко и др.,1994). Показано также влияние концентрации кислорода, концентрации этанола и других факторов на синтез лимонной кислоты и ее изомера - изолимонной кислоты (Pinogenova et al. ,1991). Влияние этих факторов очень сложно изучить в условиях периодического культивирования при постоя-
2 нно меняющейся удельной скорости роста р накапливающихся продуктах метаболизма. Метод непрерывного, культивирования позволяет изучить действие одного фактора при строгом постоянстве всех остальных параметров.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей- работы было изучение возможности получения лимонных кислот из этанола дрожжами в условиях непрерывного культивирования. Но вместе с тем ставилась и практическая задача: выяснить условия культивирования дрожжей, способствующие максимальному биосинтезу лимонных кислот дрожжами и разработать способ непрерывного получения этого продукта. В связи с этой задачей объектом исследования являлся штамм дрожжей Yarrowia lipolytica N 1, который при росте на различных источниках углерода и энергии в том числе этаноле, продуцирует в условиях лимитирования роста культуры источником азота практически одну лимонную кислоту.
В число основных задач входило:
1) изучение особенностей роста дрожжей Y.lipolytica N 1 в
режиме рН-ауксостата и определение состава среды, оптимальной
для роста мутанта;
-
определение условий культивирования штамма-продуцента, оптимальных для получения лимонных кислот в непрерывном режиме;
-
характеристика основных физиологических и биохимических особенностей роста и синтеза лимонных кислот дрожжей Y.lipolytica N 1 на среде с этанолом в условиях хемостата;
-
разработка метода получения лимонной кислоты с помощью дрожжей Y.lipolytica N 1 из этанола в условиях непрерывного культивирования.
Научная новизна работы. В данной работе впервые устано
влена принципиальная возможность направленного синтеза лимон
ной кислоты дрожжами на среде с этанолом в условиях непрерыв
ного культивирования. В условиях продолжительного
непрерывного культивирования (более 1000 час) на среде
с этанолом в качестве источника углерода и энергии дрожжи
полностью сохраняли свою кислотообразующую активность.
Изучено влияние температуры, рн среды и концентрации органического субстрата на максимальную удельную скорость
росга дрожжей Y.iipolytica N 1 в режиме рН-ауксостата и разработаны питательные среды для роста мутанта и для синтеза лимонных кислот (с ограничивающим рост фактором - азотом).
Изучено влияние условий культивирования (удельной скорости роста, концентрации растворенного кислорода) и состава питательной среды (концентрации углеродного субстрата и микроэлементов цинка и железа) на рост продуцента и процесс кпслотообразовэния в строго контролируемых условиях хемостат-ного культивирования. Показано, что от условий культивирования и природы лимитирующего рост компонента зависит качественный и количественный состав экскретируег.шх продуктов.
Практическое значение работы. На основании изучения физиолого-Оиохимических особенностей роста дрожжей Yarrowia lipoiytica N 1 на среде с этанолом в условиях непрерывного культивирования разработаны рекомендации для управления процессом кислотообразования. Результаты настоящего исследования открывают новые подходы к оптимизации условий получения лимонных кислот дрожжами в периодическом режиме.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на совместных семинарах Лаборатории окислительного обмена веществ и Отдела ферментационной микробиологии.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 работы, три работы находится в печати.
Структура и объем диссертации.