Введение к работе
Актуальность В последнее время микробные полисахариды находят
широкое применение в медицине, фармацевтической, пищевой, парфюмерной, нефтедобывающей и других отраслях промышленности. Интерес к бактериальным полисахаридам вызван их разнообразным биологическим действием: оіш обладают иммуномодулирующей, антивирусной активностью, стимулируют кроветворение, эффективны при желудочно-кишечных заболеваниях. В связи с этим во многих странах мира ведется разработка способов получения полисахаридов путем микробиологического синтеза [Блинов Н.П., 1984, Virtorio Crescenzi, 1995].
Почвенный сапрофитный микроорганизм Bacillus mucilaginosus в процессе своей жизнедеятельности продуцирует внеклеточные полисахариды, которые находят применение в качестве препаратов направленного иммуномодулирующего действия [Виноградов Е.Я., 1973, Няникова Г.Г., 1990]. До сих пор полисахариды В. mucilaginosus получали только путем поверхностного культивирования. Биосинтез в условиях глубинного культивирования продуцентов экономически и технологически более целесообразен и позволяет добиться существенного увеличения выхода целевых продуктов. Однако производство экзогликанов при глубинной ферментации сопровождается значительным увеличением вязкости среды, что затрудняет доступ кислорода к клеткам и снижает их метаболическую активность. Для решения этой проблемы необходимо, в частности, отработать режим аэрации, разработать состав жидкой питательной среды, исследовать факторы, оказывающие наиболее сильное влияние на биосинтетическую активность продуцента. Кроме того, использование специальных технологических приемов, таких, как подготовка посевного материала, иммобилизация клеток продуцента, поможет значительно повысить выход экзополисахаридов. Получение значительных объемов полисахаридов с учетом особенностей их химического строения позволит предложить новые способы их применения.
При производстве экзополисахаридов возникает проблема утилизации биомассы, как отхода производства. Биомасса В. mucilaginosus богата аминокислотами, витаминами [Виноградов Е.Я.,1973] и может быть использована в качестве стимулятора роста микроорганизмов и азотсодержащего компонента
для приготовления микробиологических питательных сред. Рациональное использование биомассы может служить дополнительным доводом в пользу организации производства экзополисахаридов В. mucilaginosus как с точки зрения экономики, так и с точки зрения экологии.
Все вышеизложенное дает основание считать данное исследование актуальным и представляющим практический интерес.
Работа выполнялась в рамках Межвузовской научно-технической программы П - 104 «Биотехнология» по направлению «Биохимический синтез лекарственных и биологически активных соединений».
Цель и задачи исследования Настоящая работа посвящена разработке основ
биосинтеза экзополисахаридов бактериями Bacillus mucilaginosus в глубинных условиях культивирования, направленных на значительное увеличение целевого продукта. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Установить факторы, оказывающие существенное влияние на
биосинтетическую активность продуцента;
Интенсифицировать биосинтез экзополисахаридов при глубинном культивировании продуцента;
Определить влияние условий культивирования и состава питательной среды на химическое строение экзополисахаридов;
Разработать способ переработки биомассы, являющейся отходом в производстве экзополисахаридов;
Исследовать возможность использования экзополисахаридов, полученных при глубинном культивировании В. mucilaginosus, в качестве сорбента тяжелых металлов;
Научная новизна Впервые проведено комплексное исследование биосинтеза экзополисахаридов В. mucilaginosus в глубинных условиях культивирования. Установлено, что на биосинтез экзополисахаридов оказьшают влияние природа источников углерода и азота и соотношение этих компонентов в среде. Впервые показано, что дополнительное внесение источника углерода в питателыгую среду в стационарной фазе развития культуры В. mucilaginosus стимулирует синтез экзогяиканов. От уровня снабжения бактерий кислородом
зависит химическое строение и количество образующихся экзополисахаридов. Выявлено положительное действие УФ-света на биосинтетическую активность продуцента. Обработка споровой суспензии В. mucilaginosus УФ-светом перед ферментацией увеличивает выход экзополисахаридов в 6.5 раз.
Определено, что средняя молекулярная масса экзополисахаридов В. mucilaginosus варьирует в пределах 100-130 тыс Да, что говорит об их полидисперсности. Независимо от состава сред они относятся к к а - 1,4 -гстерогликанам и содержат глюкозу, галактозу, маннозу, уроновые кислоты. Условия культивирования и состав питательных сред влияют на соотношение функциональных груші в синтезируемых экзополисахаридах.
Впервые показано, что иммобилизация клеток В. mucilaginosus на хитиновых сорбентах повышает сорбционную способность экзополисахаридов в отношении ионов меди в 2.8 раза. Установлено, что экзополисахариды способствуют повышению эффективности иммобилизации клеток на сорбентах до 96%.
Практическая значимость Разработан состав питательной среды и режимы культивирования продуцента для производственного получения экзополисахаридов В. mucilaginosus (патент №2140454 от 27.10.99). На основе данных по культивированию продуцента в ферментаторе «Биотек-4» предложена схема безотходного цикла, позволяющая в едином технологическом процессе получать полисахариды, а биомассу после ферментативного гидролиза использовать в качестве компонента микробиологических питательных сред.
Особенности строения полисахаридов В. mucilaginosus позволили предложить новый способ их применения в качестве сорбентов тяжелых металлов. Комплексное исследование сорбционньгх свойств экзополисахаридов, биомассы В. mucilaginosus и агрохитина привело к созданию нового биосорбента способного из загрязненных почв инактивировать в течение десяти суток до 50% ионов меди. Особенности состава биосорбента позволяют пролонгировать его действие, устраняя негативное влияние тяжелых металлов на почвенную микрофлору, восстанавливая ее видовой состав, улучшая структуру и повышая плодородие почв.
Апробация работы Результаты работы были доложены на научно-технической конференции аспирантов СПбГТИ (ТУ), посвященной памяти М.М. Сычева (С.-Петербург, 1997), на симпозиуме "Молодые ученые - экологии города" (С.-Петербург, 1997), на научн. конф."Международные ежегодные экологические чтения памяти К.К. Сент-Илера" (Воронеж, 1998), на научн. конф. «Фундаментальные и прикладные вопросы биотехнологии и медицины» (С.Петербург, 2000 г.)
Публикации По материалам диссертации опубликовано 14 работ.
Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, шести глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждение результатов), выводов, списка литературы, приложения. Работа изложена на 167 страницах машинописного текста. В работу входит 23 рисунка и 36 таблиц . Библиография включает 155 наименований.