Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 13
1.1. Биохимическое потребление кислорода (БПК) 13
1.1.2. Методы определения БПК5 14
1.1.2.1 Стандартный метод 18
1.1.2.2 Фотометрический метод 20
1.1.2.3 Манометрический метод 20
1.2 Методы определения БПК с использованием биосенсоров 21
1.2.1 Типы БПК-биосенсоров в зависимости от вида преобразователя 22
1.2.1.1 Биосенсоры на основе биолюминисцентных бактерий 22
1.2.1.2 Микробные биотопливные элементы 23
1.2.1.3 Амперометрические БПК-биосенсоры 23
1.2.1.3.1 Электрохимические БПК-биосенсоры на основе редокс медиаторов 24
1.2.3.1.2 Амперометрические БПК-биосенсоры на основе
кислородного электрода 24
1.2.2 Тип биологического материала используемого в БПК биосенсорах 25
1.2.2.1 Биосенсоры на основе индивидуальных культур 26
1.2.2.2 Биосенсоры на основе ассоциаций микроорганизмов 31
1.2.3 Коммерческие БПК-биосенсоры 34
1.3 Особенности биохимии дрожжевых клеток 39
1.3.1 Особенности дрожжей Debaryomyces hansenii 41
1.3.1.1 Строение дрожжей Debaryomyces hansenii 44
1.3.1.2 Влияние солености среды на дрожжи D. hansenii 46
1.3.1.3 Применение дрожжей D. hansenii 47
1.3.2 Особенности дрожжей Arxula adeninivorans 49
1.4 Методы иммобилизации клеток 51
1.4.1 Иммобилизация клеток путем включения в массу носителя 54
1.4.2 Гидрогели 56
1.4.3 Использование гидрогелей в биодатчиках 57
1.4.5 Гидрогели в биосенсорах 58
1.4.6 Биосенсоры на основе ферментов, иммобилизованных в гидрогели 58
1.4.7 Биосенсоры на основе целых клетокмикроорганизмов, иммобилизованных в гидрогели 59
2. Экспериментальная часть 63
2.1 Получение поливинилового спирта, модифицированного N винилпирролидоном 63
2.2 Регистрация ИК-спектров 63
2.3 Регистрация ЯМР-спектров модифицированного поливинилового спирта и исходных веществ 64
2.4 Определение доли сшитого поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном 64
2.5 Культивирование клеток микроорганизмов 65
2.6 Проведение биосенсорных измерений 66
2.7 Заполнение и проверка качества электрода Кларка 67
2.8 Иммобилизация дрожжей с применением диализной мембраны 68
2.9 Иммобилизация микроорганизмов в гидрогель модифицированного поливинилового спирта 69
2.10 Определение ростовых параметров микроорганизмов 69
2.11 Сканирующая электронная микроскопия 69
2. 12 Определение БПК5 стандартным методом разбавления 70
3. Обсуждение результатов 71
3.1. Выбор биологического материала для создания БПК-биосенсора на основе индивидуальной культуры микроорганизмов 71
3.2 Составление искусственных ассоциаций микроорганизмов 74
3.2.1 Кривые роста дрожжей 75
3.2.2 Изучение стабильности во времени созданных ассоциаций 79
3.3 Разработка матрицы на основе гидрогеля поливинилового спирта модифицированного N-винилпирролидоном, подходящей для иммобилизации микроорганизмов 81
3.3.1 Влияние соотношения компонентов и времени синтеза на долю сшитого полимера 82
3.3.2 ИК-спектроскопия образцов модифицированного поливинилового спирта 83
3.3.3 ЯМР-спектроскопия образцов модифицированного поливинилового спирта и исходных веществ 87
3.4 Иммобилизация дрожжей D. hansenii ВКМ Y-2482 в гидрогель поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном 101
3.4.1 Зависимость ответа биосенсора от биохимического потребеления кислорода 104
3.3.2. Нижняя граница определяемых содержаний и предел обнаружения 109
3.4.3. Рабочий диапазон 110
3.4.4 Операционная стабильность 111
3.4.5 Долговременная стабильность 113
3.4.6 Основные характеристики разработанных биочувствительных элементов на основе дрожжей иммобилизованных в модифицированный поливиниловый спирт 119
3.4.7 Субстратная специфичность дрожжей Debaryomyces hansenii,
иммобилизованных в поливиниловый спирт, модифицированный N винилпирролидоном 120
3.5 Иммобилизация ассоциаций микроорганизмов 123
3.6 Влияние состава исследуемых проб на окислительную способность дрожжей Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 и ассоциации дрожжей O. angusta, A. adeninivorans, D. hansenii 131
3.6.1 Влияние pH-среды 131
3.6.2 Определение зависимости окислительной активности дрожжей от температуры среды 132
3.6.3 Зависимость окислительной активности дрожжей от присутствия в системе хлорида натрия 135
3.6.4 Зависимость окислительной активности дрожжей от присутствия в системе ионов тяжелых металлов 138
3.7 Анализ образцов воды 141
3.8 Использование результатов исследования для создания экспериментального образца биосенсорного анализатора БПК «Эксперт – 009» 144
Выводы 152
Список опубликованных научных работ по теме диссертации 154
Список литературы 157
- Методы определения БПК с использованием биосенсоров
- Определение доли сшитого поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном
- Иммобилизация дрожжей D. hansenii ВКМ Y-2482 в гидрогель поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном
- Зависимость окислительной активности дрожжей от присутствия в системе хлорида натрия
Методы определения БПК с использованием биосенсоров
Манометрический метод очень распространен в промышленном секторе, поскольку прост в использовании и позволяют измерять БПК в образцах с высоким уровнем органических соединений без разбавления (0-700 мг/дм3 по сравнению с 0-6 мг/ дм3 стандартного метода), что достигается с помощью конструкции прибора улавливающей большой объем кислорода [1]
Согласно определению Международного Союза по чистой и прикладной химии (IUPAC), биосенсор (biosensor) – это интегральная система, которая способна воспринимать и преобразовывать специфичную количественную или полуколичественную аналитическую информацию с использованием биологического распознающего элемента (биохимического рецептора), находящегося в тесном контакте с преобразователем [8]. Биосенсор представляет собой комбинацию биологического компонента и инструментального средства измерения (физико-химического анализатора). Принцип детекции, реализованный в биосенсорах, основан на том, что биоматериал, иммобилизованный на физическом датчике (преобразователе), при взаимодействии с определяемым соединением генерирует зависимый от его концентрации сигнал, который регистрируется преобразователем того или иного типа и после обработки данных представляется в численном виде [9].
Исследования по созданию БПК – биосенсоров проводятся с конца 70-х годов прошлого века [10-11], но разработки таких систем интенсивно продолжаются и в настоящее время [1,3]. Следует отметить, что с помощью биосенсоров возможно быстрое определение БПК (БПКбс), которое не всегда идентично величине традиционного БПК5. В последнее время развиваются новые подходы в биосенсорном анализе БПК, которые позволяют достичь приемлемой корреляции между показаниями биосенсора и традиционных методов. Корреляция данных, полученных с помощью биосенсорного анализатора, с данными, полученными методом БПК5, могут иметь значения порядка 0,67 – 0,99 [1].
Принцип работы БПК-биосенсоров на основе биолюминисцентных бактерий основан на том, что биолюминесцентное излучение коррелирует с энергией, полученной от утилизации источника углерода в аэробных условиях и индекс БПК оценивается по интенсивности излучения биолюминесценции. В статье [12] описано применение рекомбинантных бактерий Escherichia coli, содержащих гены luxCDABE для определения БПК в течение 2 часов с корреляцией данных R2 = 0,674. Для улучшения корреляции (R2= 0,995) и уменьшения времени отклика (25 минут) в работе [13] использован природный биолюминесцентный штамм Photobacterium phosphoreum. Ограничением при создании биолюминисцентных БПК-биосенсоров является сложность реакции биолюминесценции, так как реакцию регулируют многие внутриклеточные и внеклеточные факторы, которые могут повлиять на оценку индекса БПК. Кроме этого, биолюминисцентные бактерии чаще всего окисляют достаточно узкий круг органических субстратов, что снижает коэффициент корреляции.
Для устранения кислородного ограничения реакции биодеградации, некоторые научно-исследовательские группы работают над развитием БПК биосенсоров на основе технологии биотопливного элемента (БТЭ). БТЭ состоит из анаэробного с анодом (отрицательный электрод) и аэробного с катодом (положительный электрод) отсеков, разделенных протоннообменной мембраной. В анаэробной ячейке микроорганизмы разлагают органические вещества и генерируют электроны и протоны. Протоны мигрируют из анодного отсека в катодную ячейку через мембрану, в то время как электроны проходят от анода к катоду через внешнюю электрическую схему, где кислород восстанавливается с образованием H2O. Поток электронов через электрическую цепь генерирует измеряемый ток, пропорциональный микробной биодеградационной активности, что позволяет оценить значение БПК в образце [1].
В публикациях [14-16] описаны БТЭ обладающие хорошей корреляцией со значениями БПК5, полученными стандартной методикой (R2= 0,95-0,98), однако, в большинстве случаев, оценка выполнена только на 3-5 пробах сточных вод. Большинство описанных БТЭ для определения БПК разрабатываются на основе бактериальных штаммов, что сужает спектр окисляемых субстратов в сравнении с дрожжами, и тем самым не позволяет окислять все органические вещества, входящие в состав сточных вод [17].
Определение доли сшитого поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном
Например, более высокая степень сшивки приводит к повышению механической прочности и уменьшению скорости диффузии, тем самым уменьшая размер ячеек. Размер сетки (размер ячеек) используется для определения диффузионного пространства, доступного для переноса молекул через матрицу гидрогеля (рисунок 9) [79].
Гидрогелям свойственно набухание в водных растворах за счет гидрофильности полимеров и осмотического давления [75]. Процесс набухания происходит в три этапа: (I) диффузия молекул воды через матрицу, (II) гидратация полимерных цепей и (III) расширение полимерных ячеек [80]. Степень набухания (максимальное количество поглощаемой воды) может меняться в зависимости от условий среды (рН, температуры, ионной силы) или изменения плотности поперечных сшивок, вследствие нарушения баланса. Высоко поперечно-связанные гидрогели имеют меньший размер ячеек и набухают меньше по сравнению с неплотно сшитыми гидрогелями. Кинетика набухания гидрогелей зависит от механизма проникновения растворителя в матрицу, и контролируется либо диффузией, либо установлением градиента концентраций [75]. Высокое содержание воды и минимальное влияние при взаимодействии с биологическими молекулами, имеют важное значение для применения гидрогелей при создании биохимических сенсоров. 1.4.3 Использование гидрогелей в биодатчиках
Гидрогели могут быть получены в виде водных растворов с помощью УФ- или термо-инициируемой радикальной полимеризации, с применением дополнительных реагентов, пептидов, водородных мостиков или ДНК [75].
Некоторые гидрогели чувствительны к малейшим изменениям в окружающей среде, и способны моментально давать ответ на малейшее физическое воздействие температуры, света, давления, электрического поля, ионной силы, и магнитного поля. Измеряемыми параметрами в таких сенсорах могут быть уменьшение размера, уменьшение плотности сшивки, а также увеличение содержания ионных групп, и размеров пор [75].
Высокое содержание воды и гидрофильная природа гидрогелей делает их похожей на внеклеточный компонент матрикс. Вследствие чего гидрогели являются биосовместимыми и могут применяться в различных биомедицинских материалах, например, для создания мягких контактных линз и систем доставки лекарств [75]. В 2006 году опубликован обзор о применение гидрогелей в биологии и медицине [81], а в 2010 году опубликован подробный обзор о применение гидрогелей в биомедицинских устройствах [82]. Следовательно, гидрогели в биосенсорике могут применяться для покрытия деталей датчика, чтобы предотвратить нежелательное взаимодействие с биологическими молекулами или клетками. Их открытая пористая структура и гидрофильные свойства позволяют свободно диффундировать аналиту через гидрогель матрицы, тем не менее, диффузия крупных молекул, таких как белки, может быть ограничена и даже полностью исключена. Кроме простой защиты, гидрогели могут быть использованы в качестве матрицы для иммобилизации элементов биодатчиков. Гидрогели применяются при разработке биосенсоров с высокой селективностью и чувствительность рецепторов, которые должны быть иммобилизованы в их нативной конформации, чтобы происходило связывание с анализируемым веществом. Иммобилизация в гидрогели позволяет сохранять активность и функциональность ферментов, клеток и других биомолекул [67].
В статье [83] описан биосенсор для определения метанола в н гексане на основе алкогольоксидазы и пероксидазы хрена, иммобилизованных в полимерную гидрогелевую матрицу силикагеля. Диапазон определяемых концентраций метанола составил 2.3-90 мМ, сенсор устойчиво функционировал в течение 45 измерений и более 2-х недель в потоковом режиме измерений.
В работе [84] описано получение микрочастиц гидрогеля полиэтиленгликоля различной формы и размеров для включения различных ферментов (например, глюкозооксидазы и алкогольоксидазы, для обнаружения глюкозы и этанола, соответственно).
В работе [85] описан датчик на основе кислородного электрода Кларка и иммобилизованной биферментной системы в поли (карбамоил) сульфонатный гидрогель для косвенной детекции мочевины.
Разработано огромное количество биосенсоров на основе иммобилизованного в различные гидрогели (полиэтиленгликоль, полидиметилсилоксан, полиэтиленгликольдиакрилат, фермента глюкозооксидазы для количественного определения глюкозы в крови [75]. Матрицы на основе гидрогелей полиэтиленгликоля применяют для создания биосенсоров для обраружения пероксида водорода. В работе [86] описан новый тип композитного гидрогеля (золь-гель) на основе кремниевого ICA-золя и привитиго спополимера поливинилового спирта (ПВС) с 4-винилпиридином для создания биосенсора на пероксид водорода. Данная система проявляла высокую чувствительность 15мМ-1 и предел обнаружения 15 . 10-7 М.
Иммобилизация дрожжей D. hansenii ВКМ Y-2482 в гидрогель поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном
Удельная скорость роста клеточной культуры (, ч1) - зависит от концентрации лимитирующего субстрата и определяется на начальном этапе (экспоненциальная+линейная фазы) накопления биомассы (N), где можно пренебречь расходованием субстрата. Нахождение удельной скорости роста проводилось по уравнению In 7V = In 7V0 + ju. Исследование кинетики роста дрожжей по экспериментальным данным проводили в полулогарифмических координатах (логарифм оптической плотности (1пА) от времени культивирования (t,ч)). Удельную скорость роста дрожжевой культуры () находили как тангенс угла наклона прямой в координатах 1пА от t. Логарифм начального числа клеток (InNo) равен ординате точки пересечения с осью у [94].
Наибольшей удельной скоростью роста обладают дрожжи D. hansenii ВКМ Y-111 и D. hansenii ВКМ Y-1585, что может вызвать их преобладание в ассоциации с другими дрожжами, обладающими меньшей удельной скоростью роста. После проведения сравнительного анализ продолжительности основных фаз роста дрожжевых культур (таблица 10) и субстратной специфичности (рисунок 13), были выбраны штаммы микроорганизмов для создания ассоциаций.
Ассоциацию 1 составили микроорганизмы A.adeninivorans ВКМ Y-2677и O.angusta BKM Y-1397. Микроорганизмы A. adeninivorans обладают широкой субстратной специфичностью (рисунок 13) и являются базовыми в ассоциации. Добавление к ним микроорганизмов O. angusta ВКМ Y-1397 позволяет расширить спектр окисляемых субстратов за счет метанола, глицерина, вторичных и разветвленных спиртов. Кроме того, клетки A. adeninivorans ВКМ Y-2677 и O. angusta ВКМ Y-1397 имеют сходные фазы роста (таблица 10) и близкие значения удельной скорости роста (0,158 ч-1 и 0,160 ч-1), и можно предположить, что доминирования одного вида дрожжей над другим не произойдет.
Ассоциацию 2 составили микроорганизмы A. аdeninivorans ВКМ Y 2677, O. angusta BKM Y-1397 и D. hansenii ВКМ Y-2482. Добавление дрожжей D. hansenii к ассоциации 1 позволяет еще расширить спектр окисляемых субстратов, включив в него некоторые нитрофенолы и пищевые добавки (4-нитрофенол и бензоат калия). Однако продолжительность основных фаз роста культур заметно отличается. Дрожжи D. hansenii ВКМ Y-2482 являются самым быстро развивающимся видом микроорганизмов из трех культур (удельная скорость роста составляет 0,259 ч-1).
Изучение стабильности во времени созданных ассоциаций Нестабильность состава ассоциаций микроорганизмов во времени является главным препятствием к практическому внедрению БПК-биосенсоров на их основе, поэтому проведено исследование по выявлению количества жизнеспособных клеток в сформированных ассоциациях (рисунок 16).
Определение количества жизнеспособных клеток дрожжей в ассоциациях в течение времени высевом на плотные питательные среды: А) ассоциация дрожжей O. Б) ассоциация дрожжей A. angusta BKM Y-1397 и adeninivorans ВКМ Y-2677, O. A.adeninivorans ВКМ Y-2677 angusta BKM Y-1397 и D. hansenii ВКМ Y-2482. Во всех работах по созданию БПК-биосенсоров на основе искусственных ассоциаций [1, 24] показано общее время функционирования биосенсоров, однако оно может быть обусловлено высокой выживаемостью только двух или одного из используемых микроорганизмов. Поэтому актуальным представлялось изучить видовую устойчивость микроорганизмов в созданных ассоциациях. Видовую устойчивость во времени (42 суток) в ассоциациях изучали методом оптического микроскопирования и методом Коха. Условия хранения ассоциаций соответствовали условиям использования в биосенсорном анализаторе (комнатная температура, ежедневное промывание раствором глюкозо-глутаматной смеси с БПК5 = 20 мг/дм3 и трехкратное промывание буферным раствором).
Результаты исследования (рисунок 16) показали, что соотношение клеток разных видов дрожжей в ассоциации A.adeninivorans BKM Y-2677 и O. angusta BKM Y-1397 с течением времени не изменялось, поскольку данные микроорганизмы имеют схожие удельные скорости роста. Соотношение микроорганизмов в ассоциации A. аdeninivorans ВКМ Y-2677, O. angusta BKM Y-1397 и D. hansenii BKM Y-2482 изменилось только к концу периода исследования и составило 1:1:4. Необходимо отметить, что доминирование микроорганизмов D. hansenii BKM Y-2482 в ассоциации начинает наблюдаться к концу срока исследования. По результатам анализа методом Коха, подтвержденных данными оптической микроскопии до 23 дня исследований, соотношение микроорганизмов в данной ассоциации практически не меняется. Невысокая стабильность ассоциации дрожжей A. adeninivorans, O. angusta и D. hansenii, скорее всего, связана с более высокой скоростью роста и активным протеканием процессов метаболизма микроорганизмов D. hansenii. Удельная скорость роста клеточной культуры D. hansenii составляет 0,259 ч-1, в то время как для дрожжей A. adeninivorans и O. angusta удельная скорость роста 0,158 ч-1 и 0,160 ч-1 соответственно.
Таким образом, при создании рецепторных элементов БПК биосенсоров на основе сформированных ассоциаций необходимо учитывать, что окислительная активность для ассоциации A. аdeninivorans Y-2677, O. angusta BKM Y-1397 и D. hansenii BKM Y-2482 после 20-ти дней может определяться только одним (доминирующим) видом микроорганизмов.
Разработка матрицы на основе гидрогеля поливинилового спирта модифицированного N-винилпирролидоном, подходящей для иммобилизации микроорганизмов Ключевым моментом в формировании стабильного рецепторного элемента БПК-биосенсора является иммобилизация микроорганизмов. Основными требованиями, предъявляемыми к матрицам для иммобилизации микроорганизмов, являются: высокий уровень диффузии субстратов и продуктов, нерастворимость в водных средах (наличие сетчатой структуры), высокая емкость, механическая прочность. В качестве синтетического гелеобразователя часто используют поливиниловый спирт (ПВС) [95-96]. Однако применение ПВС в качестве основы рецепторного элемента биосенсорного анализатора затруднено, так как он образует тонкие, растворимые в воде пленки с низкой механической прочностью. Для создания сетчатых структур ПВС одним из подходов является введение сшивающих агентов [97-98]. Новым веществом, используемым для модификации ПВС, с целью иммобилизации микроорганизмов для создания распознающих элементов биосенсоров является N-винилпирролидон, поскольку он легко образует комплексы со многими соединениями (токсинами, лекарственными веществами, красителями), биосовместим, нетоксичен, является основой кровезаменителей. Для получения матрицы на основе модифицированного поливинилового спирта, подходящей для включения микроорганизмов, необходимо изучить факторы (соотношение исходных реагентов, условия проведения синтеза), влияющие на ее свойства.
Зависимость окислительной активности дрожжей от присутствия в системе хлорида натрия
В результате реакции протекающей по предложенному механизму (путь 1-3) происходит образование связи СН–0–СН которая в ИК-спектрах дает 3 характерных полосы поглощения (1136 см"1, 935 см"1 и 917 см"1). Подтверждением механизма является образование в ИК-спектрах сополимеров, в отличие от смеси ПВС и N-ВП, третьей полосы поглощения (1136 см"1) и исчезновение полосы поглощения 1625 см"1, подтверждающей разрыв двойных связей С=С в N-винилпирролидоне (рисунок 19).
Единственным путем протекания данной реакции является третий процесс, поскольку в ЯМР-спектрах нет сигналов других продуктов.
Для трех образцов сополимеров с различным мольным соотношением компонентов (ПВС, инициатор, N-винилпирролидон) проведено изучение струтуры методом сканирующей электронной микроскопии (рисунок 32).
В результате модификации поливинилового спирта N винилпирролидоном формируется гидрогель сетчатой структуры (рисунок 32) с различными размерами пор, в зависимости от мольного соотношения исходных компонентов. Так для соотношения ПВС : инициатор : N-ВП = 160 : 7 : 1 образуется сополимер обладающий однородной структурой, размер пор которого варьируется от 2 до 5 мкм (рисунок 32 А). При незначительном увеличении доли сшивающего агента (ПВС : инициатор : N-ВП = 160 : 7 : 2) видимого изменения размеров пор в набухшем гидрогеле не наблюдается (размер пор от 1 до 6 мкм) (рисунок 32 Б). В сополимере с высоким содержанием N-винилпирролидона (соотношение компонентов ПВС: инициатор: N-ВП = 160:70:10) (рисунок 32 В) происходит формирование структуры с большим количеством сшивок. Таким образом, для иммобилизации микроорганизмов может быть использован сополимер с соотношением компонентов ПВС : инициатор : N-ВП = 160 : 7 : 1, так как обладает однородной структурой и размер пор варьируется от 2 до 5 мкм.
Для иммобилизации дрожжевых клеток Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 выбран полимерный носитель (соотношения компонентов ПВС : инициатор : N-ВП = 160 : 7 : 1) на основе поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирроидоном. На рисунке 33 представлены фотографии Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 в свободном и иммобилизованном виде, полученные методом сканирующей электронной микроскопии. 101 ВКМ Y-2482
В результате модификации поливинилового спирта N винилпирролидоном формируется гидрогель сетчатой структуры (рисунок 32) с размерами пор от 1 до 5 мкм, что позволяет включать клетки дрожжей D. hansenii имеющие размер 3-4 мкм (рисунок 33А). Как видно из рисунка 33Б дрожжи Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 занимают весь объем гидрогеля.
Подбор оптимального содержания дрожжей Debaryomyces hansenii в гидрогеле модифицированного поливинилового спирта является важной задачей, т.к. содержание биоматериала влияет на чувствительность биосенсора. Изготовлено 7 биочувствительных элементов с содержанием дрожжей от 5 до 60 мг на 100 мкл модифицированного гидрогеля поливинилового спирта, и толщиной от 0,05 до 0,2 мм (таблица 13).
Выбор оптимального содержания дрожжей в гидрогеле поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном производился по нескольким параметрам, таким как операционная и долговременная стабильность, коэффициент чувствительности и диапазон определяемых значений БПК.
Все характеристики определяли с использованием смеси глюкозы и глутаминойвой кислоты (ГГС) с концентрацией 150 мг/дм3 каждого компонента (суммарно 300 мг/дм3, что соответствует БПК=205 мг/дм3, согласно ПНДФ [7], таким образом БПК=0,68С(ГГС)). Глюкозо-глутаматная смесь (ГГС) была выбрана, так как её применение как стандарта при анализе БПК определено в ПНДФ [7].
При введении субстрата в измерительную кювету происходит его окисление микроорганизмами, вследствие чего увеличивается дыхательная активность дрожжей, и в приэлектродном пространстве снижается концентрация растворенного кислорода, что регистрируется с помощью кислородного электрода Кларка. кислорода По экспериментальным данным построены зависимости отклика биосенсора от БПК в измерительной кювете. №1 Содержание дрожжей 5 мг на 100 мкл геля №2: Содержание дрожжей 10 мг на 100 мкл геля №3: Содержание дрожжей 20 мг на 100 мкл геля №4: Содержание дрожжей 40 мг на 100 мкл геля №5:Содержание дрожжей 60 мг на 100 мкл геля
Зависимости ответа биосенсора от БПК, содержание дрожжей 20 мг на 100 мкл геля, толщина биорецепторных элементов от 0,05 до 0,2 мм.
Полученные зависимости величины ответов биосенсоров от БПК имеют гиперболический вид (рисунки 34,35). Аппроксимация проведена по уравнению Михаэлиса - Ментен, поскольку в стационарном состоянии зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата часто подчиняется этому уравнению: R=R S]0 Km+[S]0 где Km - и Rmax - основные кинетические характеристики ферментативной реакции. Rmax - максимальная скорость ферментативной реакции, при которой все молекулы фермента участвуют в образовании фермент-субстратного комплекса, достигается при [S];
При увеличении содержания дрожжей в биорецепторном элементе происходит увеличение кажущиеся константы Михаэлиса с 6 до 58 мг/дм3 таблица 14). Сама константа Михаэлиса не зависит от концентрации фермента, при увеличении количества фермента увеличивается скорость ферментативной реакции [101]. При увеличении толщины исследуемых биорецепторных элементов изменение константы Михаэлиса незначительно. Для снижения ошибок анализа обычно ограничиваются использованием линейного участка градуировочной кривой (рисунки 36, 37). Согласно уравнению Михаэлиса - Ментен концентрация субстрата будет пропорциональна отклику биосенсора только при концентрациях, гораздо меньших KM. Тогда уравнение приобретает следующий вид: