Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 10
1.1. Загрязнение почв пестицидами 10
1.2. Классификация пестицидов 21
1.2.1. Классификация пестицидов по объектам применения 21
1.2.2. Классификация пестицидов по воздействию на организмы 23
1.2.3. Классификация пестицидов по химическому составу 25
1.3. Влияние пестицидов напочвенную биоту 28
1.4. Микробиологическая деградация пестицидов 34
1.5. Разложение пестицидов в почвах 41
1.6. Характеристика пестицида тетраметилтиурамдисульфида и его биодеструкция 47
Экспериментальная часть
Глава 2. Объекты, материалы и методы исследований 52
2.1. Характеристика объекта исследований 52
2.2. Материалы исследований 54
2.3. Методики проведения исследований 56
2.3.1. Методика подготовки почв к исследованиям 56
2.3.2. Методика внесения пестицида в пробы почв и метод последовательных разведений почвенной суспензии 57
2.3.3. Методика выделения и определения численности почвенных микроорганизмов 58
2.3.4. Методы выделения доминирующих видов микроорганизмов из почв 60
2.3.5. Методика определения способности использования почвенными микроорганизмами углерода и энергии из органического ксенобиотика 62
2.3.6. Методика изучения деструктивной активности микроорганизмов. Идентификация штаммов деструкторов 64
2.3.7. Методика определения токсичности водных вытяжек из почв по смертности дафний 65
2.3.8. Методика определения фитотоксичности загрязненных почв на проростках пшеницы 69
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение 73
3.1. Микробиологическая активность черноземных почв 73
3.2. Влияние пестицида тетраметилтиурамдисульфида на численность основных групп почвенных микроорганизмов 78
3.3. Получение микроорганизмов - деструкторов пестицида ТМТД 86
3.4. Идентификация штамма деструктора пестицида ТМТД 92
3.5. Получение опытных образцов суспензии деструктора ТМТД 94
3.6. Оценка эффективности ремедиации чернозема обыкновенного, загрязненного пестицидом ТМТД, методами биотестирования 96
3.6.1. Оценка эффективности ремедиации по экотоксикологическому исследованию на гидробионтах 96
3.6.2. Исследование фитотоксического эффекта загрязненной почвы на проростках пшеницы 101
3.7. Теоретические аспекты эколого-экономической эффективности исследуемого метода биоремедиации 112
Заключение 115
Выводы 120
Список сокращений и условных обозначений 122
Список использованной литературы 124
Приложения 141
- Влияние пестицидов напочвенную биоту
- Методика определения токсичности водных вытяжек из почв по смертности дафний
- Получение микроорганизмов - деструкторов пестицида ТМТД
- Исследование фитотоксического эффекта загрязненной почвы на проростках пшеницы
Введение к работе
Актуальность темы. Одной из серьезных современных экологических проблем является загрязнение природных объектов органическими пестицидами, обладающими высокой токсичностью и персистентностью. Интенсивное применение химических средств защиты растений привело к тому, что они рассматриваются в числе самых опасных синтетических поллютантов (Ермаков и др., 2001; Ананьева, 2003; Попов и др., 2003). По многочисленным данным их применение приводит к подавлению не только вредных организмов, но и большинства других видов. Пестициды ухудшают качество почв, так как убивают живые организмы, которые участвуют в почвообразовательных процессах и поддерживают плодородие почв.
Установлена огромная роль микроорганизмов в поддержании экологического равновесия. Многочисленные формы микроорганизмов обладают способностью включать в обмен веществ ксенобиотики, то есть использовать их в конструктивном и энергетическом метаболизме клетки (Квеситадзе, 2002).
В результате использования микроорганизмов-деструкторов происходит не только очистка почвы от ксенобиотиков, но и повышение плодородия почвы, восстановление ее основных функций, так как именно микроорганизмы осуществляют в почве разложение растительных и животных остатков, превращая их в новые органические вещества, которые при взаимодействии с минеральными компонентами придают почве все ее специфические свойства (Мотузова, Безуглова, 2007).
Следовательно, изучение микробиологического способа очистки почвы от пестицидов чрезвычайно актуально. В связи с этим ведутся поиски штаммов микроорганизмов-деструкторов для различных видов пестицидов. Микробная деградация токсикантов, осуществляемая за счет ферментных систем, является обнадеживающим подходом для деструкции органических токсикантов. По многочисленным данным биологические методы восстановления загрязненных почв требуют намного меньше затрат для своего применения, чем известные небиологические технологии, что объясняет актуальность проводимых исследований по разработке и применению на практике биотехнологических способов очистки почв, загрязненных пестицидами.
Пестицид тетраметилтиурамдисульфид (ТМТД) нашел широкое применение на всей территории Российской Федерации, в том числе и в Саратовской области, в связи с низкой стоимостью и эффективностью использования. Поэтому, проведенные исследования по определению влияния пестицида ТМТД на почвенные микроорганизмы на примере чернозема обыкновенного, а также определение способности микроорганизмов из этих почв к биодеструкции пестицида ТМТД имеет важное научно-теоретическое и практическое значение.
Степень разработанности проблемы. Вопросы влияния пестицидов на почвенные микроорганизмы и их микробная деструкция составляют значительную часть зарубежных исследований в области почвенной микробиологии, отечественными авторами им отводится меньшее внимание.
В основном работы проводились по определению влияния различных пестицидов на общую численность, видовой состав и структуру почвенных организмов и их чувствительность к пестициду. Имеются данные ряда зарубежных авторов, таких как F.W. Breazeale (1970), A.C. Guar (1977), K.H. Domsh (1984), P.H. Don и J.M. Pemberton (1985), J.S. Bridges и C.R. Dempsey (1988), A. Brokamp и B. Happe (1997), F.R.J. Schmidt (1997), L.В. Taiwo и В.А. Oso (1997), M. Biziuk (2001), D. Fournier, A. Halasz, J. Spain, P. Fiurasek и J. Hawari (2002), A. Fliebach и P. Mder (2004), А.В. Caracciolo (2005), М. Cyco и Z. Piotrowska-Seget (2009) и др.
Среди отечественных авторов 20 века следует отметить Н.Н. Мельникова (1980), А.В. Полякову (1985), М.Ф. Овчинникову (1987), А.Б. Азаматову (1988), И.М. Габрилович (1988), Д.Г. Звягинцева (1989), Г.Ф. Лебедеву, В.И. Агапова, Ю.Н. Благовещенского и В.П. Самсонову (1990), Ю.В. Круглова (1991), О.Е. Марфенину (1991), М.А. Анисимову (1997), Н.А. Куликову (1999), Л.А. Федорова (1999), А.В. Яблокова (1999) и др.
Воздействие различных пестицидов на почвенные микроорганизмы и их микробная деструкция исследованы в трудах современных отечественных ученых, таких как Н.Д. Ананьева (2001), П.А.Чиров (2002), О.Ю. Ксенофонтова (2004), О.П. Бурхан (2010). Исследования по поиску микроорганизмов-биодеструкторов пестицида ТМТД ранее были проведены и отражены в работе А.В. Колупаева (2010). Однако объектом исследования служила дерново-подзолистая почва, которая по своим характеристикам значительно отличается от чернозема обыкновенного.
Учитывая количество вносимых и уже имеющихся в биосфере пестицидов, следует отметить необходимость детального изучения существующей проблемы. Актуальность, теоретическая и практическая значимость обусловили выбор темы, определили цель, задачи и структуру исследования.
Цель работы – изучение влияния пестицида тетраметилтиурамдисульфида на численность основных групп микроорганизмов чернозема обыкновенного и поиск штаммов микроорганизмов-деструкторов этого пестицида.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Провести экспериментальные лабораторные исследования по изучению влияния различных доз пестицида ТМТД на численность актиномицетов, гетеротрофных бактерий и плесневых грибов.
-
Выделить устойчивые и доминирующие виды микроорганизмов из чернозема обыкновенного, загрязненного пестицидом ТМТД.
-
Выявить штаммы деструкторов пестицида ТМТД и произвести их идентификацию.
-
Изучить деструктивную активность выделенных штаммов микроорганизмов.
-
Определить эффективность микробиологической ремедиации чернозема обыкновенного методами биотестирования.
Научная новизна. Впервые изучено влияние различных концентраций пестицида ТМТД, широко используемого в настоящее время в сельскохозяйственной области, на рост и размножение микроорганизмов в обыкновенных черноземах. Выделен штамм микроорганизма-деструктора пестицида ТМТД из аборигенной микрофлоры чернозема обыкновенного, который способен использовать пестицид в процессе жизнедеятельности. Проведена его идентификация на основании изучения фенотипических признаков. Изучена деструктивная активность штамма бактерий, выделенного из чернозема обыкновенного.
Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость исследования заключается в том, что основные ее результаты способствуют расширению знаний в области ремедиации черноземных почв, загрязненных пестицидом тетраметилтиурамдисульфидом, определяя специфику влияния данного пестицида на почвенные микроорганизмы, способности выделения из аборигенной микрофлоры штамма-деструктора.
В работе впервые даны характеристики воздействия различных доз пестицида ТМТД на численность актиномицетов, плесневых грибов и гетеротрофных бактерий чернозема обыкновенного. Вид гетеротрофных бактерий Pseudomonas putida выделен из аборигенной микрофлоры почвы как наиболее устойчивый к пестицидному загрязнению. Штамм Pseudomonas putida Тм4 рекомендован как деструктор пестицида ТМТД для использования в целях очистки чернозема обыкновенного от его загрязнения.
Основные положения и научные выводы, разработанные и обоснованные автором, приняты к использованию в Федеральной целевой программе «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации на 2009-2013 годы».
Результаты диссертационного исследования используются в производственной деятельности предприятия ООО «ЭкоХим» для осуществления рекультивации территорий, загрязненных пестицидами (в том числе ТМТД), что подтверждается актом о внедрении.
Методология и методы исследования. Методологической базой послужили труды отечественных и зарубежных ученых по вопросам влияния пестицидов на почвенные микроорганизмы и их микробной деструкции. Основу данного исследования составляют комплексный анализ и системный подход в изучении рассматриваемой темы.
При проведении исследования и изложения материала автором были применены общенаучные методы: теоретико-методологический анализ литературных источников, эмпирические методы исследования в форме наблюдения, эксперимента, описания, измерения и сравнительно-сопоставительного анализа.
Применение указанных методов, а также анализ фактического материала позволил обеспечить объективность полученных выводов и результатов.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Снижение численности актиномицетов, плесневых грибов и увеличение численности гетеротрофных бактерий зависит от загрязнения чернозема обыкновенного различными концентрациями пестицида ТМТД.
-
Различные штаммы микроорганизмов-деструкторов ТМТД, используют пестицид как косубстрат или как единственный источник углерода. Ряд штаммов бактерий Pseudomonas putida обладают наивысшим деструкционным потенциалом.
-
Степень токсичности чернозема обыкновенного, загрязненного пестицидом ТМТД устанавливается по смертности дафний в почвенной вытяжке и по изменению всхожести семян и длины корней проростков пшеницы.
Апробация результатов исследований. Материалы исследований, изложенные в диссертации, были представлены на: Международной научно-практической конференции, посвященной 125-летию со дня рождения академика Н.И. Вавилова (Саратов, 2012); Международной заочной научно-практической конференции «Инновационное развитие в экономике, социологии, образовании, юриспруденции, управлении проектами, медицине, экологии» (Санкт-Петербург, 2012); V Международной научно-практической конференции «Научная дискуссия: вопросы физики, химии, биологии» (Москва, 2012); конференции «Модернизация экономики и общества России в условиях кризиса мирохозяйственных отношений» по итогам научно-исследовательской работы Саратовского государственного социально-экономического университета (Саратов, 2012); конференции «Экология и общество в условиях глобальной конкуренции: инновационные пути развития» по итогам научно-исследовательской работы Саратовского государственного социально-экономического университета (Саратов, 2013); V региональной научной конференции «Исследования молодых ученых в биологии и экологии» в СГУ имени Н.Г. Чернышевского (Саратов, 2013).
Публикации. Результаты исследований изложены в 9 печатных работах, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Личный вклад автора. Соискателем проведен анализ полученных данных, сформулированы основные положения диссертации, составляющие ее новизну и практическую значимость.
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный социально-экономический университет» на кафедре экологии и безопасности жизнедеятельности.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, двух глав экспериментальной части, включающих объекты и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов, списка использованной литературы и приложения. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, включает 16 рисунков и 19 таблиц. Список литературы включает в себя 178 источников.
Влияние пестицидов напочвенную биоту
Широкий спектр применяемых как пестициды веществ определяет многообразное и далеко еще не полностью изученное действие пестицидов непосредственно на микробную клетку. Производные карбаматов влияют на процесс деления клеток, органические соединения меди - на проницаемость мембран, ртутьорганические соединения - реагируют с клеточными компонентами, хиноны - воздействуют на перенос алекиронов в дыхательной цепи и т.д. Воздействие на эукариотические и прокариотические организмы может отличаться (Марфенина, 1991).
Прямое действие пестицидов на микробиоценозы почвы зависит от химических свойств препарата и видовой принадлежности микроорганизмов (Lai, Saxena, 1982). Влияние пестицидов на почвенные микроорганизмы определяется не только типом соединения, но и его дозой, персистентностью в среде, а также температурой, влажностью, сорбционной способностью, окислительно-восстановительными условиями почв (Хайниш и др., 1979). Более существенно микробиологические процессы в почве регулируются косвенным влиянием пестицидов, выражающимся в обеднении растительного покрова, изменении его растительного состава, нарушении ритма распада и синтеза многих органических соединений и др. (Агрономическая микробиология, 1976).
Определению воздействия пестицидов на почвенную биоту посвящено большое количество исследований (Helvi et al., 1985; Hart, Brookes, 1996). Эти работы проводились, в основном, в двух направлениях:
- определение влияния разных пестицидов на общую численность, видовой состав и структуру почвенных организмов и их чувствительность к пестициду;
- определение влияния разных пестицидов на микробиологические процессы трансформации различных элементов (С, N, Р и др.) в почвах. Следует отметить, что на почвенную биоту действие пестицидов может проявляться не только через их непосредственное влияние, но и косвенно, через изменения, происходящие под их действием в экосистемах, например, за счет изменения состава и количества поступающих в почву растительных остатков (Круглов, 1984).
По влиянию пестицидов на биологическую активность почв имеются многочисленные, но и весьма противоречивые сведения. Вносимые в производственных дозах пестициды чаще всего оказывают малое влияние на биологическую активность почв. Воздействие пестицидов четче всего может проявиться при систематическом их внесении или при однократном внесении супердоз в 10 и более раз превышающих производственные дозы. В зависимости от дозы изменения могут носить либо обратимый характер, либо закрепляться. Действие пестицидов может проявляться в изменении развития микроорганизмов и протекании рада микробиологических процессов (Марфенина, 1991).
Так, например К.Н. Domsh (1984) при изучении действия широкого набора пестицидов (более 70) на различные микробиологические показатели и процессы выявил ингибирующее действие ряда пестицидов, в первую очередь, на процессы разложения органического вещества и нитрификации. Под воздействием пестицидов может сильно снижаться численность некоторых групп микроорганизмов (Соколов, Эчкалов, 1977). Так некоторыми авторами отмечается тенденция преимущественного уменьшения численности отдельных групп микроорганизмов при внесении определенных пестицидов. Например, указывается, что каптан снижал преимущественно численность патогенных грибов, гептахлор - бактерий, цинеб - спороообразующих бактерий, эптам, дикват, атразин - грибов и т.д. Однако не ясно, насколько это воздействие сохраняется в разных экологических условиях (Хайниш и др., 1979; Марфенина, 1991).
В последнее время количество таких сведений немного сократилось, что возможно связано с исследованиями новых более эффективных препаратов. Однако такие наблюдения продолжают появляться в современных работах. В частности, L. Mandic и соавторы (2005) при изучении влияния фунгицидов, гербицидов и инсектицидов на структуру почвенных микромицетов установили, что после внесения пестицидов, происходило увеличение численности грибного населения почвы. Отмечается, что среди гербицидов наибольшим стимулирующим эффектом обладал симазин. A. Niewiadomska и A. Sawicka (2002) показали, что при длительном применении гербицидов и фунгицидов в условиях вегетативного опыта изменяется численность микробного населения почвы. При внесении гербицидов происходило уменьшение количества бактерий в 3,5 раза, а грибов - в 5 раз. В то же время в вариантах с фунгицидами наблюдалось некоторое увеличение численности микробного населения (бактерий в - 1,1 раза, грибов - в 1,3 раза), а при совместном действии этих пестицидов было выявлено снижение численности бактерий и грибов примерно в 1,3 раза.
Имеются наблюдения, что почвенные грибы угнетаются большим числом пестицидов при их меньших концентрациях и в течение более длительного времени, чем другие микроорганизмы. Известно (Pesticide..., 1987), что в небольших дозах пестициды могут стимулировать ряд микробиологических процессов, общую численность и численность некоторых групп микроорганизмов. Эти изменения и связывают со способностью микроорганизмов использовать некоторые пестициды как источники питательных веществ. Отмечают, что стимулирующий эффект отдельных пестицидов может быть особенно выражен для определенных групп микроорганизмов. Например, каптан увеличивал численность ряда групп бактерий, актиномицетов и сапротрофных грибов, диэльдрин увеличивал численность аммонифицирующих, а атразин - нитрифицирующих бактерий (Хайниш и др., 1979). Эффект стимуляции, также как и ингибирования, чаще всего бывает выражен в начальный период после применения пестицидов (Соколов, Эчкалов, 1977). Однако следует подчеркнуть, что четко выраженной реакции почвенной биоты на внесение производственных доз пестицидов не наблюдается (Круглое, 1984; Pesticide.., 1987 и др.).
О влиянии одних и тех же пестицидов на почвенные микроорганизмы часто имеются прямо противоположные сведения. Например, для одного из наиболее распространенных гербицидов - атразина (Звягинцев, 1989). Это, возможно, связано как с их маловыраженным действием, так и зависит от различных почвенно-экологических условий, в которых проводились эксперименты. Сложность в определении эффекта воздействия создают и флуктуационные изменения в динамике показателей микробиологической активности, происходящие под влиянием естественных, не связанных с пестицидами, факторов (Марфенина, 1991).
В ряде случаев исследователями отмечается существенное изменение видового состава, смена доминантных форм почвенных микроорганизмов, например, для грибов и актиномицетов при внесении триазиновых гербицидов, у дрожжей при обработке молинатом и др. Высоко чувствительны к пестицидам определенного действия и почвенные водоросли. Отмечается высокий уровень чувствительности почвенных беспозвоночных (особенно дождевых червей) к внесению отдельных пестицидов (Звягинцев, 1989).
Имеется немало сведений о токсическом воздействии пестицидов на микроорганизмы почвы (Pesticide risk assessment..., 2008).
Отрицательное влияние вносимых в почву пестицидов чаще всего проявляется в жизнедеятельности микрофлоры только в первое время после внесения. В дальнейшем, как правило, состав и деятельность нормализуются. Это хорошо иллюстрируется частными примерами. Гербициды, фунгициды, инсектициды и дефолианты, содержащие активные ингридиенты глюфозинат и диносеб, угнетали рост и потребление субстратов микроорганизмами в течение 20 суток, а на 135 сутки эти показатели не отличались от исходных (Flifibach, Mader, 2004). При длительном применении пестицидов паракуата (Duah-Yentumi, Johnson, 1986), трифлуралина (Dumontet, Perucci, 1992) и атразина (Megharaj, 2002) наблюдается снижение микробной биомассы. Применение гербицида 2,4-Д в течение 15 лет привело к сокращению популяций бактерий, грибов и актиномицетов (Rai, 1992).
Методика определения токсичности водных вытяжек из почв по смертности дафний
Оценку степени токсичности водных вытяжек почв производили в опытах на биотестобъектах - гидробионтах (Daphnia magna Straus) согласно рекомендациям методики определения токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по смертности и изменению плодовитости дафний (2007).
Методика основана на определении смертности дафний {Daphnia magna Straus) при воздействии токсических веществ, присутствующих в исследуемой водной среде, по сравнению с контрольной культурой в пробах, не содержащих токсических веществ (контроль). Острое токсическое действие исследуемых водных вытяжек из почв определяется по смертности (летальности) дафний за определенный период экспозиции. Критерием острой токсичности служит гибель 50% и более дафний за 48 часов в исследуемой пробе при условии, что в контрольном эксперименте все рачки сохраняют свою жизнеспособность. В экспериментах по определению острого токсического действия устанавливают:
- среднюю летальную концентрацию отдельных веществ (кратность разбавления вод или водной вытяжки из почв, содержащих смеси веществ), вызывающую гибель 50% и более тест-организмов;
- безвредную кратность разбавления водных вытяжек, вызывающую гибель не более 10% тест-объектов за 48-часовую экспозицию. Подготовка проб почв к биотестированию. Отобранные на токсикологический анализ пробы почвы сначала разрыхляли вручную металлическим шпателем и освобождали от материала, относящегося к инородным (случайным) механическим включениям, а также остатков корней. Перед биотестированием пробы просеивали через лабораторные сита с диаметром отверстий 1 мм и доводили до воздушно-сухого состояния. Для чего пробу подсушивали в вытяжном шкафу, размещая ее на чистых листах плотной бумаги. Размещенные таким образом пробы почвы выдерживали открытыми не менее 2-х часов при комнатной температуре и влажности воздуха. Подготовленную пробу распределяли на ровной поверхности слоем толщиной не более 1 см и отбирали шпателем из 5-ти точек методом конверта. Для эксперимента использовали образцы почв, загрязненные пестицидом ТМТД в количестве 6 мг/кг (100 ПДК).
Методика биотестирования. В наших исследованиях биотестирование проводилось при температуре 20±2С для всех проб почвы. Подготовку посуды для отбора и биотестирования проб производили согласно вышеуказанной методике.
Водную вытяжку из почвы для биотестирования готовили в соотношении: 1 часть почвы и 10 частей культивационной воды (дистиллированной воды). Для приготовления водной вытяжки из почвы отвешивали 1 г пробы почвы. Навеску почвы помещали в колбу емкостью 100 см3 и приливали 10-кратное количество культивационной воды. Далее на аппарате для встряхивания жидкости полученную смесь в течение 2-х часов встряхивали, после чего отстаивали в течение 30 мин. Надосадочную жидкость сифонировали, а затем профильтровывали через наиболее пористые бумажные обеззоленные фильтры «белая лента», помещенные в воронку Бюхнера диаметром 15-20 см. Перед тем как вылить вытяжку на фильтр, содержимое колбы встряхивали, чтобы перенести на фильтр всю взвесь. Так как первые фильтраты практически всех проб почвы были мутными, то производили дополнительно 2-3-х кратное перефильтрование до прозрачного раствора. Для приготовления разбавлений исследуемых водных вытяжек использовали культивационную воду рН=7,0.
Определение токсичности каждой пробы без разбавления и каждого разбавления проводили в трех параллельных сериях. В качестве контроля использовали три параллельные серии с культивационной водой.
Биотестирование проводили в пробирках объемом 100 смЗ, которые заполняли 50 см исследуемой водной вытяжки. В пробирки помещали по 10 дафний в возрасте 6-24 ч. Из емкостей, в которых выращивали синхронизированную культуру, отлавливали дафний и отсаживали в отдельный химический стакан одновозрастных рачков, а затем по одному специальной пипеткой переносили в пробирки с исследуемой водной вытяжкой. Для каждой серии исследуемой водной вытяжки использовали 3 пробирки. Пробирки с пробами водных вытяжек и тест-организмами помещали во вращающуюся кассету устройства для экспонирования рачков УЭР-03. Благодаря вращению кассеты происходит непрерывная и одинаковая аэрация всех тестируемых проб. Учет смертности дафний в опыте и контроле проводили через 24 и 48 часов. Наблюдения прекращали в том случае, если в течение 24 часов во всех вариантах (разбавлениях тестируемой вытяжки) наблюдалась гибель более 50% рачков. Если отмечали гибель дафний в контроле, то результаты опыта не учитывали, а биотестирование повторяли.
Для определения острой токсичности исследуемых водных вытяжек из почв устанавливали среднюю летальную кратность разбавления водных вытяжек, вызывающую гибель 50% тест-объектов за 48-часовую экспозицию, и безвредную кратность разбавления водных вытяжек, вызывающую гибель не более 10% тест-объектов за 48-часовую экспозицию.
Рассчитывали процент погибших в тестируемых пробах дафний (А, %) по сравнению с контролем: А = хЮ0%, (4) где Хк - количество выживших дафний в контроле; Хт - количество выживших дафний в тестируемой пробе.
При А 10% тестируемая водная вытяжка не оказывает острого токсического действия (безвредная кратность разбавления);
При 10% А 50% - отсутствие острой токсичности в исследуемой пробе;
При А 50% - оказывает острое токсическое действие (средняя летальная кратность разбавления).
Сравнительный анализ индексов токсичности экспериментальных проб почв. Для получения сопоставимых результатов по итогам тестирования рассчитывали индекс токсичности оцениваемого фактора или интегральный показатель токсичности среды (ИТФ), который определяли по формуле: ИТФ=ТФЛФК , (5) где ТФ0 - значение тест-функции в опыте; ТФК - значение в контроле.
Для обобщения всех параметров, полученных в результате биотестирования производили расчёт ИТФ .
ИТФср - среднее значение величины ИТФ для каждого опыта, которое рассчитывали следующим образом:
ИТФср=ИТФ1+ИТФ2+..+ИТФп/п (6)
Затем сравнивали полученные результаты со шкалой токсичности, предложенной методическими рекомендациями.
Шкала токсичности:
1 - сверхвысокая: ИТФ=0;
2 - высокая токсичность (LD5o): ИТФ 0,5;
3 - средняя токсичность: ИТФ=0,5-0,7;
4 - низкая токсичность: ИТФ=0,71-0,90;
5 -норма: ИТФ=0,91-1,10;
6 - стимуляция: ИТФ 1,1.
Получение микроорганизмов - деструкторов пестицида ТМТД
Методология микробиологической деградации позволяет использовать для химического превращения любой микроорганизм. Применение в качестве биодеструкторов находят гетеротрофы, отличающиеся интенсивным обменом (Зименко и др., 1983).
В большинстве случаев выделение биодеструкторов проводят с использованием простых минеральных сред с добавлением пестицида в качестве единственного источника углерода. Для выделения некоторых штаммов-деструкторов необходимо дополнительное введение в среду кометаболитов, которые способствуют их росту и активности в разложении пестицидов. Одними из наиболее эффективных кометаболитов являются моно-и дисахариды (Sparling et al., 2008).
На этапе получения накопительной культуры при пассировке на средах с увеличенными концентрациями пестицида нами были выявлены штаммы бактерий, использующие пестицид в качестве единственного источника углерода и как косубстрат (таблица 11).
На данном этапе исследования идентификация штаммов не проводилась. В результате исследования был отобран штамм деструктор ТМТД (ТмЗ), использующий пестицид как косубстраг. Согласно полученным результатам, пестицид ТМТД наиболее активно стимулировал рост 3 штаммов гетеротрофных бактерий (Тм4, Тм9 и ТмЮ), которые образовывали крупные колонии с зонами просветления, что позволяет предположить способность данных культур использовать пестицид как единственный источник углерода, а, следовательно, и разрушать его. Это позволило нам отобрать данные штаммы для исследования деструкционного потенциала.
Необходимо отметить, что А.В. Колупаевым (2010) были проведены исследования в подобных условиях по выделению из дерново-подзолистых почв штаммов бактерий, способных к деструкции ТМТД и симазина. Результаты селекции показали, что большинство бактериальных изолятов составили представители pp. Pseudomonas (57%) и Flavobacterium (26%). Качественный и количественный состав бактериальных культур, селектированных с добавлением и без добавления кометаболита (сахарозы), принципиально не отличался. При сравнении признаков бактериальных штаммов, отселектированных по симазину и симазину+сахарозе, было установлено, что доля оксидазоположительных штаммов в варианте с симазином и сахарозой составила 60%, а в варианте без сахарозы - 80%. Также в аналогичных вариантах доли оксидазоположительных штаммов составили 80% и 60%, а облигатных аэробов - 90% и 80% соответственно. В случае селекции штаммов бактерий в присутствии ТМТД было установлено полное соответствие по изучаемым признакам в вариантах с сахарозой и без нее. А.В.Кулупаев показал, что селекция штаммов микроорганизмов-деструкторов ТМТД и симазина возможна и без добавления кометаболита. Также, было выявлено, что большинство из бактериальных штаммов, отселектированных по ТМТД и симазину, обладают одинаковым набором свойств: являются грамотрицательными (100% в случае с ТМТД и 92% в случае с симазином), каталазоположительными (100% в том и другом случае), оксидазоположительными (67% - ТМТД; 100% - симазина), способными к гидролизу желатины (100% в том и другом случае).
При исследовании штаммов микромицетов по морфологическим признакам один из четырех грибных изолятов был идентифицирован как Trichoderma viride, а остальные представляли собой светлоокрашенные формы стерильного мицелия Mycelia sterilia. Выделенные изоляты грибов были отнесены к типу быстрорастущих, которые получили преимущество среди почвенных микромицетов. В варианте с ТМТД без сахарозы не были выделены устойчивые штаммы микромицетов, так как в растворах возрастает биодоступность данного пестицида и он в большей степени оказывает ингибирующий эффект.
В результате было определено, что штаммы Pseudomonas sp. BAC8S1, Pseudomonas sp. BAC11S2, Pseudomonas sp. BAC15S2 и Pseudomonas sp. BAC20S2 обладают резистентностью к симазину и ТМТД в концентрациях 20 и 0,2 мг/мл соответственно. В то же время были отмечены случаи ингибирования роста штаммов как пестицидом, по которому не проводилась селекция (симазином - штаммов Enterobacteria sp. ВАС1Т1, Pseudomonas sp. BAC2T1, Pseudomonas sp. BAC3T1 и ТМТД - Enterobacteria sp. BAC7S1, Psendomonas sp. BAC13S2, Flavobactehum sp. BAC19S2, Rodococcus sp. BAC16S2), так и высокими концентрациями пестицида у штаммов, селектированных по данному пестициду (ТМТД - в концентрации ОД и 0,2 мг/мл - Pseudomonas sp. ВАС4Т2 и Pseudomonas sp. ВАСЗрТ2, соответственно; симазином - в концентрации 10 мг/мл - Flavobactehum sp. BAC14S2, Flavobactehum sp. BAC17S2). Было определено, что большинство бактериальных изолятов не обладают комплексной резистентностью к ТМТД и к симазину. В случае грибных изолятов была выявлена чувствительность к ТМТД в концентрации ОД мг/мл только у Mycelia sterilia Т12. Остальные штаммы микромицетов обладали резистентностью к высоким концентрациям данных пестицидов.
Наиболее устойчивые к токсическому действию пестицидов штаммы микроорганизмов, как правило, способны к активной биодеструкции этих ксенобиотиков (Bellinaso et al., 2003; Saikia, Gopal, 2004).
Для исследования деструктивной активности микроорганизмов по отношению к пестициду ТМТД, нами были выбраны штаммы бактерий Тм4, Тм9 и ТмЮ, у которых были обнаружены признаки роста и размножения в присутствии пестицида. Деструкцию ТМТД наблюдали при культивировании штаммов в жидкой среде М9, содержащей 300 мг/л пестицида в качестве единственного источника углерода. Об изменении концентрации препарата в среде с микроорганизмами судили по изменению поглощения УФ-излучения после осаждения биомассы центрифугированием.
При изучении биодеструкции ТМТД наблюдение вели за изменением поглощения в области 225 нм, что соответствовало первому пику поглощения.
Наиболее четкие изменения в спектральной характеристике были получены только при культивировании штамма Тм4. Выявленный пик при 225 нм исчезал на третьи сутки, а на седьмые зафиксировано возникновение нового пика в области 210 нм. Анализ полученных данных показал, что внесение штаммов деструкторов в среду с пестицидом вызывает изменение спектра поглощения УФ-излучения в области 210 нм. Установленные изменения в спектральной характеристике ТМТД при культивировании со штаммом деструктором говорят о трансформации пестицида (рисунок 8).
При культивировании штамма Тм4 на среде М9, содержащей пестицид ТМТД в концентрации 300 мг/л, наблюдался видимый рост численности микроорганизмов в течение 7 суток (таблица 12, рисунок 9).
Анализ полученных результатов позволил выделить штамм бактерий Тм4, который обладает наиболее активным деструкционным потенциалом и может быть рекомендован как деструктор пестицида ТМТД (Решетов, Тугаева, №3, 2013).
При сравнении собственных результатов исследования с ранее опубликованными, были обнаружены общие закономерности. Так, в исследованиях О.Ю. Ксенофонтовой (2004) биодеструкцию ряда пестицидов бактериями наблюдали в тех же условиях, что и в нашем эксперименте. Об изменении концентрации препарата в среде с микроорганизмами судили по изменению поглощения УФ-излучения после осаждения биомассы центрифугированием. Установлено, что внесение штаммов деструкторов в среду с пестицидом вызывает изменение спектра поглощения УФ-излучения в области 225 нм. Результаты исследования показали, что ряд штаммов почвенных бактерий, усваивая углерод пестицида, деструктивно влияли на него. Это наглядно демонстрировали смещенные пики поглощения УФ-излучения под влиянием штаммов родов Bacillus и Pseudomonas. В эксперименте N. Sahina и U. Tamer (2000) по разложению ТМТД бактериальными изолятами в было установлено, что степень биодеградации пестицида достигала 43,7%. В аналогичном эксперименте L.T. Richardson (1954) было установлено, что ТМТД подвергается биодеструкции микроорганизмами более чем на 95% после 55 дней культивирования.
Исследование фитотоксического эффекта загрязненной почвы на проростках пшеницы
Одним из важных показателей оценки перспективности штаммов микроорганизмов-биодеструкторов для технологии биоремедиации природных сред является отсутствие фитотоксичности (Молекулярные основы..., 2005).
В настоящем исследовании было изучено влияние пестицида ТМТД на токсичность чернозема обыкновенного по отношению к пшенице. В качестве тест-объекта была выбрана именно эта культура ввиду ее широкого сельскохозяйственного использования на изучаемых почвах.
Параллельно с исследованием фитотоксичности чернозема обыкновенного были проведены химико-аналитические исследования каждого образца почвы, участвующего в эксперименте, с помощью хромато-масс-спектрометра Agilent 5975С (таблица 17).
Для сравнительного анализа в эксперименте использовалась почва, загрязненная пестицидом ТМТД, которая не подвергалась ни поливу, ни рыхлению, ни перемешиванию. Этот образец находился в тех же условиях, что и экспериментальные образцы почв. Для последних двух вариантов опыта были применены различные технологии рекультивации:
- стимулирование дикой (аборигенной) микрофлоры в загрязненной природной среде путем создания необходимых условий для активизации ее жизнедеятельности (оптимальной температуры, величины рН, аэрации);
- выделение наиболее активной составляющей дикой микрофлоры непосредственно из мест загрязнения, подбор оптимальных условий культивирования, производство биомассы, внесение ее в загрязненную среду с последующей активизацией обычными агротехническими приемами.
К основным приемам, позволяющим создавать условия, необходимые для эффективной работы деструктора, относятся: увлажнение, рыхление (аэрация) и поддержание оптимальной температуры.
Для создания условий аэрирования, а также усреднения состава по всему объему при внесении сорбента и суспензии деструктора необходимо проведение операций поверхностного рыхления и объемного рыхления. При поверхностном рыхлении разрушается корка, образующаяся на поверхности почвы, препятствующая аэрированию. Рыхление проводят продольными движениями в поверхностном слое почвы, пласты земли при этом не переворачивают. При объемном рыхлении проводят тщательное перемешивание почвы.
На протяжении всего периода проведения активации осуществляют контроль за параметрами окружающей среды. Лабораторные исследования проводились в весенне-летний период, на протяжении которого среднесуточная температура в помещении фиксировалась на уровне 22-25С. Данный температурный режим соответствует оптимальным значениям температуры, необходимой для активного роста и работы деструктора. Увлажнение почвы осуществляется из расчета достижения влажности на уровне 60% (Аристовская, Чугунова, 1989).
Динамика деградации пестицида ТМТД в черноземе обыкновенном отражена на рисунке 13.
На рисунке 13 показана тенденция к снижению содержания пестицида ТМТД в почве во всех вариантах опыта. Однако на 7 и 14 сутки отмечено незначительное снижение концентрации пестицида.
В первом варианте опыта отмечено снижение содержания пестицида на 30 сутки в 2 раза. Вероятно, пестицид ТМТД подвергался микробной деструкции аборигенной микрофлорой чернозема обыкновенного. Однако этот процесс шел достаточно медленно. Лучшего результата удалось добиться во втором варианте опыта при использовании агротехнических приемов (полив, рыхление, перемешивание). В данном случае удалось активизировать почвенные микроорганизмы и содержание пестицида на 30 сутки составило 1,96 мг/кг, что в 3 раза ниже внесенной концентрации пестицида (6 мг/кг).
Наилучший результат по ремедиации был отмечен на 30 сутки в третьем варианте опыта с внесением в почву биодеструктора и использовании агротехнических приемов. При внесении в почву пестицида ТМТД 100 ПДК, что составляет 6 мг/кг, в черноземе обыкновенном остаточное его количество на 30 сутки составило 0,06 мг/кг, что соответствует предельно допустимой концентрации пестицида ТМТД в почве.
Отбор образцов почв для исследования фитотоксичности чернозема обыкновенного, загрязненного пестицидом ТМТД (100 ПДК) проводили на 7, 14 и 30 сутки после внесения в почву биодеструктора (БД). В качестве контроля служила почва, не загрязненная пестицидом. Также проводили сравнительный анализ с почвой, загрязненной пестицидом, но без внесения в нее микроорганизмов-био деструкторов.
Для проведения биотестирования чернозема обыкновенного использовали семена пшеницы со всхожестью не менее 95%.
Результаты проведенного исследования отражены в таблицах 18 и 19, а также на рисунках 14, 15 и 16.
Важным показателем фитотоксического действия пестицида ТМТД является всхожесть семян (таблица 18, рисунок 15). Анализ результатов исследований на 7 и 14 сутки после загрязнения почвы пестицидом ТМТД показал, что чернозем обыкновенный обладает второй степенью токсичности -опасно токсичная почва. Однако на 30 сутки эксперимента негативное воздействие пестицида ТМТД на всхожесть семян снижается. О чем свидетельствует понижение токсичности почвы до третьей степени - умеренно токсичная. Вероятно, это связано с постепенным разложением пестицида ТМТД аборигенной микрофлорой чернозема обыкновенного.
Положительный результат применения биодеструктора был отмечен на всех сроках наблюдения. На 7 и 14 сутки эксперимента почва была охарактеризована как «умеренно токсичная». Наилучший результат был отмечен на 30 сутки эксперимента. Применение биодеструктора способствовало разрушению пестицида ТМТД в черноземе обыкновенном, что сказалось на увеличении всхожести семян пшеницы по сравнению с показателями, полученными на 7 и 14 сутки. Почва была отнесена к пятой степени токсичности - практически не токсичная. Это свидетельствует о том, что внесенная культура биодеструктора, включившись в сложившийся биоценоз чернозема обыкновенного, увеличила детоксикационный потенциал почвы. Однако всхожесть семян пшеницы на всех этапах эксперимента не достигла контрольных показателей. Это говорит о том, что пестицид ТМТД является токсичным для большинства сельскохозяйственных культур и может влиять на количество, а также качество урожаев.
По результатам эксперимента нами было отмечено, что пестицид ТМТД оказывал негативное воздействие на корни проростков пшеницы, проявляющееся в угнетении их роста на всех сроках исследования (таблица 19, рисунок 16). На 7 и 14 сутки эксперимента по показателям суммы длины корней почва отнесена ко второй степени токсичности - опасно токсичная. На 30 сутки эксперимента мы наблюдали снижение негативного влияния пестицида ТМТД на рост и развитие корней проростков пшеницы. О чем свидетельствует понижение токсичности почвы до третьей степени - умеренно токсичная. Аналогичные данные были получены нами при исследовании всхожести семян пшеницы.
На 7 и 14 сутки в почве с биодеструктором мы наблюдали уменьшение токсического воздействия загрязнителя на число корней и их длину. По показателям суммы длины корней почва была отнесена к третьей степени токсичности - умеренно токсичная. Положительный результат применения биодеструктора также был отмечен и на 30 сутки эксперимента. Внесение биодеструктора в почву способствовало снижению фитотоксичности чернозема обыкновенного, загрязненного пестицидом ТМТД. В результате чего почва была отнесена к четвертой степени токсичности и охарактеризована как «мало токсичная». Как и в случае со всхожестью семян пшеницы, показатели роста и развития корней при применении биодеструктора не достигли контрольных, что говорит нам о высокой токсичности пестицида ТМТД по отношению к сельскохозяйственным культурам. Однако нами отмечена тенденция к снижению фитотоксичности чернозема обыкновенного, загрязненного пестицидом ТМТД, при применении микроорганизмов-биодеструкторов (Решетов, Тугаева, №4, 2012).
Результаты опытов дают нам основание предполагать, что наиболее перспективными агентами в биотехнологии ремедиации природных сред от пестицидов являются бактерии: они обладают высокой скоростью деструкции и меньшим фитототоксическим эффектом.
