Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Продукция микробной биомассы 11
1.1.1. Микроорганизмы - продуценты микробной биомассы 11
1.1.2. Характеристика белоксодержащей биомассы 14
1.2. Структура и свойства целлюлозосодержащих субстратов 16
1.2.1. Целлюлоза 16
1.2.2. Гемицеллюлоза, лигнин и другие, основные компоненты растительной биомассы 19
1.3. Ферментативное расщепление целлюлозы 21
1.4. Микробная деструкция лигнинцеллюлозы 25
1.5. Биосинтез ферментов целлюлазного комплекса у бактерий рода Cellulomonas 31
1.6. Регуляция синтеза целлюлаз у бактерий рода Cellulomonas 33
1.7. Оптимальные условия для продукции целлюлаз и клеточной массы при глубинном культивировании продуцентов 36
1.7.1. Время культивирования 36
1.7.2. Влияние рН и температуры 38
1.7.3. Роль ростовых факторов для культуры и синтеза ферментов 40
1.7.4. Значение дозы посевного материала для роста клеток и синтеза ферментов 40
1.7.5. Влияние углеводов на синтез целлюлаз 41
1.7.6. Влияние различных источников азота на синтез целлюлаз...42
1.7.7. Эффект Твина 80 43
1.8. Послеспиртовая барда. Ее характеристика и способы утилизации 43
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 49
2.1. Штаммы, использованные в работе 49
2.2. Питательные среды 50
2.2.1. Агаризованная среда для проведения селекционных работ, поддержания и хранения культуры Cellulomonas effusa 50
2.2.2. Питательные среды для глубинного культивирования Cellulomonas effusa 50
2.2.3. Питательные среды для определения целлюлолитической активности Cellulomonas effusa (ПС-2, ФС-1 и агаризованная среда с Na-КМЦ) 51
2.2.4. Питательные среды для получения мутации устойчивости к дезоксиглюкозе 52
2.3.Хранение, поддержание и глубинное культивирование культуры Cellulomonas effusa 53
2.3.1. Культивирование на колбах и в лабораторном ферментере объемом 3 литра 53
2.3.2. Получение посевного материала I и II генераций для культивирования в промышленных аппаратах объемом 30 и 100 м 54
2.4. Приготовление фиксированных мазков 55
2.5. Методика проведения мутагенеза для Cellulomonas effusa на растущей культуре 56
2.6. Методика получения мутантов, резистентных к дезоксиглюкозе 57
2.7. Определение содержания сырого протеина 58
2.8. Определение сырой клетчатки 60
2.9. Определение целлюлолитической активности 61
2.10. Определение редуцирующих веществ методом Бертрана 62
2.11. Определение ксиланов в культуральной жидкости 65
2.12. Определение титра клеток культуры Cellulomonas effusa 67
2.13. Определение содержания влаги и содержания сухих веществ..67
2.14. Контроль стерильности питательных сред 68
2.15. Определение аминокислотного состава 69
2.16. Оптимизация ферментационной питательной среды 7,0
2.17. Статистическая обработка данных 71
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 73
3.1. Схема экспериментальных исследований 73
3.2. Технология культивирования культуры Cellulomonas effusa в лабораторных условиях 74
3.2.1. Подбор состава посевной питательной среды для культивирования Cellulomonas effusa
и времени выращивания посевного материала 74
3.2.2. Посевной материал II генерации 78
3.2.3. Оптимизация ферментационной питательной среды 83
3.2.4. Предобработка целлюлозосодержащего сырья 87
3.3. Разработка метода определения целлюлолитической активности у культуры Cellulomonas effusa 93
3.3.1. Подбор питательных сред для разработки методики определения целлюлолитической активности методом с красителем конго-красным 94
3.3.2. Подбор оптимальных параметров проведения анализа по определению целлюлолитической активности..96
3.4. Получение мутантов с увеличенной целлюлолитической активностью 100
3.4.1. Получение мутантов культуры Cellulomonas effusa с помощью мутагена N-метилмочевины (NMM) 100
3.4.2. Проверка вариантов и отбор мутантов с повышенной целлюлолитической активностью 103
3.4.3. Получение мутантов резистентных к дезоксиглюкозе 106
3.5. Биоконверсия целлюлозных компонентов послеспиртовой барды с помощью мутантного штамма К-27 DGR в микробный белок 112
3.5.1. Выращивание культуры Cellulomonas effusa К-27 DGR в лабораторном ферментере на послеспиртовой барде, обработанной на гидродинамической установке 112
3.5.2. Выращивание культуры Cellulomonas effusa L-27 DGR в промышленном аппарате объемом 30 м на послеспиртовой барде 114
3.5.3. Выращивание культуры Cellulomonas effusa K-27DGR в промышленном аппарате объемом 100 м3 на послеспиртовой барде 116
3.6. Аппаратурно-техно логическая схема процесса получения кормового белка на основе послеспиртовой барды 118
ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПРИМЕНЕНИЯ НОВОЙ
ТЕХНОЛОГИИ БИОКОНВЕРСИИ ПОСЛЕСПИРТОВОЙ
БАРДЫ В КОРМОВОЙ ПРОДУКТ 121
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ 124
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 126
ПРИЛОЖЕНИЯ 139
- Микроорганизмы - продуценты микробной биомассы
- Штаммы, использованные в работе
- Схема экспериментальных исследований
Введение к работе
В последние годы получение новых видов энергии и топлива становится первоочередной задачей для всех стран мира. Биоэтанол (этанол), один из основных видов биотоплива, получают из сахарной свеклы, сахарного тростника, кукурузы, зерновых культур, картофеля и других видов углеродсодержащих растительных субстратов. Мировая потенциальная потребность в биоэтаноле составляет 2 млрд. тонн в год. В настоящее время в мире производится 32 млн. тонн этанола: из них 20 млн. тонн — топливный этанол, 8 млн. тонн — этанол для химической промышленности, 4 млн. тонн — для пищевой промышленности. Химическим синтезом производят 7% этанола, брожением — 93%. Получение спирта методами брожения сопровождается образованием в процессе производства послеспиртовой барды. Так, например, типовой завод по производству этанола мощностью 42000 дал/сут должен утилизировать, перерабатывать или реализовывать ежесуточно порядка 4500-5000 тонн жидкой барды. По экспертным оценкам, в настоящее время, в России годовой объем производимой барды составляет примерно 700 млн. дал, причем из них перерабатывается не более 5%.
Невостребованную барду большинство предприятий стараются слить в близлежащие водоемы либо на поля, что серьезно ухудшает экологическую ситуацию вокруг спиртзаводов. Проблема усложняется тем, что барда - это скоропортящаяся жидкость (влажность около 80%) и при температуре 15- нескольких часов.
Вопрос переработки послеспиртовой барды сегодня становится не менее важной и экономически привлекательной задачей, чем производство самого спирта. Организация переработки барды в эффективный белкововитаминный продукт будет способствовать организации нового высокорентабельного бизнеса производства кормовых продуктов, спрос на которые в мире превосходит предложение.
Можно выделить две основные технологические схемы, которые используются при переработке барды: Схемы с выпарными станциями для получения «Сухой барды (DDGS)»; Схемы с получением кормовых дрожжей.
Технология «упаривания фугата» в выпарных станциях самая распространенная в мире. Данная технология предлагается, например, шведской компанией «Альфа-Лаваль», датской фирмой «Atlas-Stord», рядом китайских и российских компаний. Однако стоимость выпарных станций и соответственно всего оборудования для утилизации достаточно высокая, процесс выпарки требует значительных энергетических затрат. Не полностью решаются экологические проблемы, т.к. для утилизации «выпара» требуются стационарные очистные сооружения. Все это отрицательно сказывается на себестоимости готовой продукции - сухой барды («DDGS»), главным недостатком которого является несбалансированность получаемого продукта по сырому протеину, так как максимальное его содержание в сухой барде не превышает 24 %. Также высокое содержание клетчатки в сухой барде - до
20%, существенно ограничивает круг его потребителей.
Вторая группа объединяет технологии, предусматривающие предварительную утилизацию Сахаров барды путем культивирования на ней кормовых дрожжей.
Однако, используемые дрожжи рода Candida относятся к условнопатогеннным микроорганизмам с высоким уровнем микологической опасности. Известны случаи заболевания птицы кандидозом при введении в ее рацион питания кормовых дрожжей.
Поэтому исследования по решению проблемы трансформации целлюлозосодержащих компонентов послеспиртовой барды в микробный протеин с использованием непатогенных нетоксичных бактерий является весьма актуальным.
Дели и задачи исследования. Целью работы является разработка технологии переработки послеспиртовой барды в богатый белком кормовой продукт путем культивирования бактерий Cellulomonas effusa. Для достижения поставленной цели в ходе работы решались следующие задачи: 1 .Разработать технологию культивирования Cellulomonas effusa в лабораторных условиях на целлюлозосодержащих субстратах;
2.Разработать оперативный, удобный метод определения целлюлолитической активности у культуры Cellulomonas effusa для проведения селекционных работ;
3.Получить мутанты с увеличенной целлюлолитической активностью;
4. Разработать технологию выращивания культуры Cellulomonas effusa в промышленных условиях на целлюлозосодержащих субстратах с получением белково-витаминного кормового продукта с использованием мутантного штамма;
5.Разработать аппаратурно-техно логическую схему производства кормового белка на основе послеспиртовой барды.
Научная новизна.
• Модифицирована оригинальная методика определения целлюлолитической активности для одновременной проверки большого числа клонов при проведении селекционных работ.
• После обработки исходного штамма мутагеном N-метилмочевиной получен мутантный штамм, характеризующийся повышенным синтезом целлкшолитических ферментов.
• Получен мутантный штамм К-27 DGR , резистентный к 5 мг/мл дезоксиглюкозы, с ослабленным эффектом катаболитной репрессии, и характеризующийся повышенным синтезом целлюлолитических ферментов.
• Впервые в России при микробной переработке послеспиртовой барды использовали непатогенные, не спорообразующие бактерии рода Cellulomonas, которые эффективно осуществляют биоконверсию целлюлозосодержащих субстратов в микробный протеин.
Практическое значение работы.
• Проведена апробация новой технологии переработки послеспиртовой барды и промышленная наработка белково-витаминного кормового продукта «Мультиприн» на спиртовых заводах в г. Ливны (ОАО «Этанол») и в г. Бутурлиновка (ООО Спиртзавод «Пираква»).
• Разработанные методики, штаммы, питательные среды и технология ферментации могут быть использованы для организации на спиртовых заводах линий по переработке барды с получением различных кормовых продуктов.
• Разработана аппаратурно-технологическая схема производства кормового белка на основе послеспиртовой барды.
• Показано, что с помощью разработанной технологии может быть получен высокобелковый кормовой продукт «Мультиприн».
Апробация работы.
Работа выполнялась в Московском Государственном Университете Инженерной Экологии.
Результаты диссертационной работы докладывались: на 11-ой Пущинской международной школе-конференции молодых ученых: Биотехнология — наука XXI век, Пущино, 2008 г.; на 2-й Биотехнологической выставкеярмарке РосБиоТех - 2008. Результаты работы, представленные на РосБиоТех - 2008, удостоены серебряной медали.
Публикации.
По материалам работы опубликовано 4 печатные работы, из них 2- тезисы в научных конференциях, 2 - статьи в журналах. Также получено положительное решение о выдаче патента (заявка № 2007113000/15(014124)).
Находится на рассмотрении заявка на изобретение «Переработка спиртовой барды в кормовой продукт». Данные работы выполнены с соавторами Сергеевой А.В., Бирюковым В.В., Мироновым В.А., Акопяном В.Б., Туляковой Т.В., Рухманом А.А. и др.
Соискателем были выполнены поставленные задачи исследований, основные экспериментальные исследования, разработаны методики. В определении биохимических характеристик принимали участие Ревякина Т.В., Петрищева О.А. Обсуждение результатов проводилось совместно с Сергеевой А.В., Бирюковым В.В. Вклад соискателя в работу является определяющим.
Микроорганизмы - продуценты микробной биомассы
По размерам дрожжевые клетки больше, чем бактериальные, что облегчает их отделение. Биомасса может быть использована в сыром виде. Однако, специфичная скорость роста дрожжей относительно низкая (время генерации 2-5 часов).
Бактерии. Специфическая скорость роста и выход биомассы у бактерий выше, чем у других категорий микроорганизмов. Общий протеин может достигать 80%. Содержание аминокислот в бактериальной биомассе сбалансировано, серосодержащие аминокислоты и лизин находятся в высокой концентрации. Содержание нуклеиновых кислот составляет от 10 до 16%, что выше, чем в дрожжевой биомассе.
Лимитировано количество видов, которые могут быть использованы для получения пищевого белка, т.к. многие бактерии являются патогенными. К тому же, отделение клеток от культуральнои жидкости затруднено из-за маленького размера бактериальных клеток.
Грибы. Относительно недавно стали использовать грибы для продукции биомассы. Чаще их используют для продукции ферментов, органических кислот и антибиотиков. Время генерации (5-12 часов) длиннее, чем у дрожжей и бактерий, требуется время для роста мицелия, рост не имеет экспоненциального характера. Содержание протеина (менее 50%) меньше, чем у дрожжей и бактерий, и их биомасса дефицитна по содержанию серосодержащих аминокислот. Существует проблема хорошей усваиваемости грибного белка. Принципиальным достоинством грибов является их способность использовать большое количество комплексных ростовых субстратов, таких как целлюлоза и крахмал, и к тому же грибная биомасса легко отделяется простой фильтрацией и имеет низкую себестоимость.
Водоросли. Потенциальное достоинство водорослей является их способность размножаться, используя ССЬ как единственный углеродный источник. Некоторые культуры {Cyanophytd) могут использовать атмосферный азот. Продукция водорослей имеет место в природных водоемах (прудах, озера, лагунах). Водоросли - традиционный пищевой компонент для многих народностей в Мексике {Spirnlina platensis) и в республике Чад {Spirnlina maxima), однако, водоросли имеют мало серосодержащих аминокислот. Биомасса водорослей имеет содержание нуклеиновых кислот от 4 до 6%. В нашей стране главным недостатком для выращивания водорослей является неподходящий климат, т.к. недостаточно тепла и света.
Штаммы, использованные в работе
В данной работе были использованы следующие штаммы и их производные (табл.6). В молодых культурах тонкие палочки неправильной формы, 1,7x0,4 мкм, прямые или слегка изогнутые, некоторые в парах V-образной конфигурации. В старых культурах палочки короткие и могут присутствовать немногочисленные кокки. Граммположительные. Подвижные за счет одного или нескольких жгутиков. Неспорообразующие.
При росте на агаризованной среде с триптоном и дрожжевым экстрактом образует выпуклые, желтые колонии, вросшие в агар, диаметром 1-3 мм.
Факультативный анаэроб. Образует кислоту на глюкозе, мальтозе, крахмале, манните и др. углеводах. Дает положительную реакцию на каталазу. Разжижает желатину, гидролизует крахмал. Синтезирует целлюлолитические ферменты. Восстанавливает нитрат до нитрита. Оптимальная температура для роста 30-32С.
Штамм является микроорганизмом, непатогенным для человека и животных и работа с ним не требует специальных мер предосторожности.
Схема экспериментальных исследований
Как известно, культура Cellulomonas effusa синтезирует в процессе культивирования ферменты, которые разрушают целлюлозосодержащий субстрат до простых Сахаров, усваиваемых микроорганизмом. По литературным данным синтез ферментов у Cellulomonas при глубинном культивировании достигает своего максимума после 56-72 часов роста. Известно, что сигналом к началу синтеза целлюлолитических ферментов для культуры служит присутствие в среде целлюлозосодержащих субстратов. С целью сокращения стадии ферментации и масштабирования объемов посевной среды для промышленной переработки барды была разработана стадия получения посевного материала II генерации.
Для определения оптимального состава посевной среды (исследуемые посевные среды представлены в таблице 12) и оптимального возраста посевного материала II генерации для получения микробного белка на стадии переработки целлюлозосодержащего сырья (послеспиртовой барды) через 24, 48, 72 и 96 часов культивирования были засеяны по 3 колбы с ферментационной средой. Как видно из таблицы 13, на среде №3 титр клеток культуры Cellulomonas effusa выше, чем на других вариантах сред и достигает на 4 сутки роста 2,1x10і КОЕ/мл. Ферментационная среда ФС (состава: (NH4)2S04 - 0,5%, (NH4)2HP04 - 0,5% и ЦСС в количестве 8% по сухому весу) была засеяна посевным материалом II генерации, выращенным на посевной среде №3 в течение 24, 48, 72 и 96 часов.