Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. МЕТОДЫ РЕКУЛЬТИВАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ОБЪЕКТОВ
Глава 2. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДЕСТРУКЦИЯ НЕФТИ
2.1. Принципы микробиологической деструкции нефти 25
2.2. Методы интенсификации микробиологической деструкции 34
2.3. Стимуляция аборигенной микрофлоры 48
2.4. Интродукция углеводородокисляющих микроорганизмов 51
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 56
Глава 3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Объекты исследований 56
3.2. Микробиологические среды 56
3.3. Выделение микроорганизмов-деструкторов нефти и ее компонентов 57
3.4. Приготовление селективных агаризованных сред для выращивания углеводородокисляющих штаммов 58
3.4.1. Среды с диспергированным углеводородным субстратом 58
3.4.2. Агаризованные среды с нитроцеллюлозными фильтрами 58
3.5. Идентификация выделенных штаммов 59
3.6. Сравнительная оценка штаммов-деструкторов по степени утилизации нефтепродуктов в жидкой периодической культуре 59
3.7. Определение группового состава нефти методом жидкостно- адсорбционной хроматографии 60
3.8. Оценка углеводородокисляющей активности культур микроорганизмов гравиметрическим методом 61
3.9. Культивирование углеводородокисляющих микроорганизмов в проточной системе 61
3.10. Постановка лабораторного почвенного эксперимента 63
3.11. Определение содержания нефтепродуктов в почве весовым методом 64
3.12. Учёт численности микроорганизмов в почве 65
3.13. Построение дендрограмм сродства штаммов 65
3.14. Приготовление и условия хранения концентрированной суспензии микроорганизмов-нефтедеструкторов 66
3.15. Хранение культур микроорганизмов 67
3.16. Статистическая обработка полученных результатов 68
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Глава 4. СКРИНИНГ И ИССЛЕДОВАНИЕ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ
4.1. Скрининг микроорганизмов-нефтедеструкторов 69
4.2. Изучение физиологических свойств выделенных культур 74
Глава 5. СОСТАВЛЕНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ АССОЦИАЦИИ АКТИВНЫХ НЕФТЕДЕСТРУКТОРОВ С ПОМОЩЬЮ МАТЕМАТИЧЕСКОЙ МОДЕЛИ
5.1. Прогнозирование оптимального состава искусственной ассоциа- 78
ции
5.2. Построение дендрограмм сродства штаммов 80
5.3. Моделирование оптимального состава ассоциации 84
Глава 6. ИЗУЧЕНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ АССОЦИАЦИИ УГЛЕВОДОРО-ДОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ
6.1. Исследование устойчивости искусственной ассоциации 92
6.2. Исследование биодеструкции нефти ассоциацией микроорганизмов в открытой проточной системе 100
6.3. Влияние длительности хранения суспензии микроорганизмов- 109 нефтедеструкторов на их физиологическую активность
Глава 7. ИССЛЕДОВАНИЕ УГЛЕВОДОРО ДОКИС ЛЯЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ АССОЦИАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ-НЕФТЕДЕСТ-
РУКТОРОВ В МОДЕЛЬНОЙ ПОЧВЕННОЙ СИСТЕМЕ 114
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 124
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 134
ВЫВОДЫ 135
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 136
ПРИЛОЖЕНИЕ 160
- МЕТОДЫ РЕКУЛЬТИВАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ОБЪЕКТОВ
- Принципы микробиологической деструкции нефти
- Объекты исследований
Введение к работе
"Захватить нефть - захватить власть. Государству, захватившему власть над нефтью, будет обеспечена власть над морями с помощью тяжёлых масел, власть над небом с помощью бензина, власть над континентом с помощью бензина и газолина и, наконец, власть над всем миром, благодаря финансовому могуществу, которое даёт обладание этим продуктом, более ценным, более привлекательным, более могущественным, нежели само золото".
Анри Беранже /цит. по 85/
Нефть является одним из важнейших видов минерального сырья. Путем её фракционирования получают различные виды топлива, смазочные масла, вазелиновое масло, парафин, различные растворители, гудрон (асфальт) /92/. Кроме того, нефть является сырьем для получения органических веществ, лекарств, парфюмерных изделий, лавсана, каучука, пластмасс, красителей, пестицидов и т.п. /79/.
Нефть была известна человечеству еще с древнейших времен, но использовалась она в сыром виде и только как топливо для лампад и светильников. С тех пор нефть стала неизменным спутником человека, и потребность в ней неуклонно возрастала. В России первый завод для очистки нефти был построен на Ухтинском нефтяном промысле ещё в 1745 г, а в 1823 г братья Дубинины впервые создали устройство для перегонки нефти. Интересно, что в Америке первые опыты перегонки нефти осуществил лишь 10 лет спустя Силлиман /79/.
Начиная с 1860 года (год изобретения двигателя внутреннего сгорания), потребление нефти резко увеличилось, а с 1880 года добыча нефти растет по экспоненте, и сейчас её ежегодно извлекают из недр земли и донных
6 отложений в объеме 3,2« 10 л /170/.
Несовершенство технологий добычи, транспортировки, переработки и хранения нефти приводит к ее значительным потерям, которые достигают 50 млн. т/год, то есть 2% от общей добычи /71/. Именно поэтому нефть и нефтепродукты относятся к приоритетным загрязнителям биосферы /221/.
По данным отечественных исследователей ежегодное антропогенное поступление нефти в воды Мирового океана составляет 12-15 млн. т /91/, при этом, примерно 1/3 его поверхности постоянно или временно покрыта нефтяной пленкой. До 30% загрязнений вод нефтью приходится на бытовые и промышленные отходы, 27% на суда, 12% на аварии танкеров и нефтяных платформ, но в тоже время 24% загрязнений Мирового океана поступает со дна из естественных источников. Таким образом, нефтезагрязнение не является чисто антропогенным загрязнением, что объясняет наличие в биосфере организмов, способных нормально расти и развиваться в загрязнённых нефтью средах.
Нефтяное загрязнение почв, в отличие от загрязнения океана, по своим масштабам не является глобальным, а имеет локальный характер и поэтому изучено хуже /74/.
В России разведано около двух тыс. нефтяных месторождений, из них 12 - с запасами более 300 млн. т нефти, являются уникальными. Несмотря на небольшую тенденцию снижения добычи нефти (в 1993 г, было добыто 357 млн. т, в 2000 г - 323 млн. т), в России не наблюдается уменьшения общей площади нарушенных и загрязненных почв, а задолженность по возврату земель только возрастает /72, 89/.
В нашей стране приоритетными источниками загрязнения почвенного покрова нефтью и нефтепродуктами являются, в основном, аварийные ситуации при добыче, транспортировке и переработке нефти. Большинство производств не отвечает современным требованиям безопасности, оборудование физически изношено и морально устарело, имеет низкую надёжность. Из 400 тыс. объектов около 43 тыс. требуют модернизации или коренной реконструкции, около 12 тыс. подлежат выводу из эксплуатации. По данным Мини- стерства природных ресурсов Российской Федерации и Российского отделения «Гринпис» потери нефти и нефтепродуктов в России за счет аварийных ситуаций колеблются от 17 до 20 млн. т ежегодно, что составляет порядка 7% от добычи нефти /72/.
Наибольший риск аварийных разливов нефти обусловлен большой протяженностью и низкой технической надежностью нефтепроводов. Только за 1998 г от предприятий Нижневартовского района поступили данные о 736 авариях на трубопроводах, при этом в результате только 6 аварий было сброшено около 1000т нефти /76/. В Ханты-Мансийском округе ежегодно на землю выливается до 2 млн. т нефти /22/.
По данным экспертов голландской независимой консалтинговой компании IWACO, в настоящее время в Западной Сибири нефтью загрязнено от 700 тыс. до 840 тыс. га земель, что в 7 раз больше, чем территория Москвы. /22/.
Нефтяное загрязнение приводит к негативным изменениям в биоценозе почв /112/, а также к коренным изменениям в химическом составе, структуре и свойствах почв /24, 30/, резкому снижению продуктивности и ухудшению хозяйственной ценности земель. В нефтезагрязненной почве изменяется структура микробного сообщества /43, 49, 111/, подавляется фотосинтетическая активность высших растений /5, 16, 19, 38, 68, 70, 80, 100, 106/, уменьшается численность педофауны 111.
В результате разливов нефти почвы могут превращаться в типичные техногенные пустыни, в которых практически полностью подавлена жизнедеятельность биоты. Такие явления в широком масштабе проявляются в нефтедобывающих районах России (Поволжье, Западная Сибирь, Коми, Башкортостан), а также в большинстве населенных пунктов, где расположены нефтеперерабатывающие заводы и крупные хранилища горюче-смазочных материалов.
Процесс естественного самовосстановления загрязненной среды является очень длительным. Согласно устоявшемуся мнению, ауторемедиация нефтезагрязненных почв при уровне загрязнения 5000 мг/кг идёт от 2 до 30 лет и выше /31/. В северных регионах скорость этих процессов еще ниже. В связи с этим, последствия нефтезагрязнения там сказываются многие десятилетия, поскольку период распада нефти и ее производных в условиях Севера составляет минимум 50 лет /70/.
Цель настоящего исследования было изучение процесса биодеструкции нефти и нефтепродуктов микробными ассоциациями в открытых модельных системах.
Основные задачи работы
Разработать эффективный, простой и удобный в применении метод скрининга микроорганизмов-нефтедеструкторов и определения их численности.
Исследовать устойчивость ассоциации микроорганизмов-нефтедеструкторов при росте на нефтепродуктах в открытой проточной системе.
Исследовать поведение гетеротрофной микрофлоры и микроорганизмов-нефтедеструкторов при росте на нефти и нефтепродуктах в открытой проточной и в модельной почвенной системах.
Установить оптимальную периодичность инокуляции почвы мик-роорганизмами-нефтедеструкторами.
Исследовать условия и длительность хранения биопрепарата мик-роорганизмов-нефтедеструкторов.
Научная новизна
1. Исследована устойчивость микробной ассоциации в открытой проточной системе в условиях полной деструкции углеводородов. Показано, что 5 из 7 интродуцированных штаммов не только присутствовали в системе, но и в большинстве случаев доминировали по численности над сопутствующей микрофлорой.
Исследование поведения микроорганизмов-нефтедеструкторов в открытых системах позволило установить следующие закономерности ассимиляции углеводородов, входящих в состав нефти и нефтепродуктов: во-первых, в процессе ассимиляции нефти и нефтепродуктов происходит поэтапное потребление субстрата; во-вторых, в ходе ассимиляции углеводородов наблюдается преобладание численности сопутствующей микрофлоры над численностью микроорганизмов-нефтедеструкторов;
Разработан метод скрининга микроорганизмов-нефтедеструкторов и определения их численности с использованием агаризованных сред с нит-роцеллюлозными фильтрами.
Практическая значимость
1. Создана рабочая коллекция культур микроорганизмов- нефтедеструкторов. Полученные данные по широкому распространению уг- леводородокисляющих микроорганизмов демонстрируют принципиальную возможность создания специализированных биопрепаратов для биоремедиа- ции нефтезагрязнённых сред.
2. Установлена наиболее эффективная периодичность инокуляции почвы исследуемой ассоциацией микроорганизмов-нефтедеструкторов.
3. Установлены сроки и условия хранения ассоциации микроорганиз- мов-нефтедеструкторов, для её дальнейшего эффективного использования.
Организация исследований. Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (Пущино) и в Государственном Научном Центре прикладной микробиологии Минздрава РФ (Оболенск).
Апробация работы. Материалы диссертаций были представлены на 4-ой Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 1999), на конференции "Экобиотехнология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды" (Пущино, 2001), на международной конференции "Новые технологии для очистки нефтезагрязнённых вод, почв, переработки и утилизации неф- тешламов" (Москва, 2001) и на 1-ом международном конгрессе "Биотехнология - состояние и перспективы развития" (Москва, 2002).
Публикации. Материалы диссертационной работы изложены в 2 статьях и представлены в виде докладов на 6 на конференциях.
Структура и объём работы. Работа изложена на 179 страницах машинописного текста и состоит из введения, 2 глав литературного обзора, главы об объектах и методах исследований, 4-х глав полученных результатов, главы обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Библиография представлена 246 литературными источниками, из них 118 работ на русском языке. Иллюстративный материал включает 17 рисунков, 16 таблиц и 14 приложений.
Методы рекультивации нефтезагрязненных объектов
Низкие темпы самоочищения приводят к тому, что без проведения мероприятий по очистке количество загрязнённых нефтью и нефтепродуктами земель будет неуклонно расти. Применение рекультивации позволяет в короткий срок снизить концентрацию углеводородов в загрязнённой среде, уменьшить токсичность среды, добиться восстановления нарушенного биоценоза.
В настоящее время существует большое количество методов ремедиа-ции загрязненных нефтью почв и водных систем.
Известные методы рекультивации нефтезагрязненных сред условно можно подразделить на несколько групп:
1. Механические методы;
2. Термические методы;
3. Физико-химические методы;
4. Микробиологические методы.
В каждую группу входят несколько самостоятельных методов, отличающихся по степени воздействия на загрязнённую среду, а также экономическому и экологическому эффекту. Кратко охарактеризовать их можно следующим образом.
1. Механические методы.
1.1. Локализация и сбор нефти, разлитой по поверхности почвы, как правило, является первым этапом рекультивации. При помощи него удаётся значительно уменьшить площадь загрязнения, а концентрацию нефти в почве снизить до 5% /16, 54/. Для сбора разлитой нефти существует большое количество методик и устройств различной степени сложности.
Для сбора нефти с поверхности почвы чаще всего используют сгребание скребками и всасывание разлитой нефти насосами /57/. Собранная таким образом нефть подвергается регенерации и возвращается в оборот.
Для сбора нефти с поверхности воды чаще всего используют следующие методы /77/:
— всасывание плавающими насосами (нефть и загрязненная вода от качиваются с помощью специальных насосов, затем полученная эмульсия разделяется сепараторами);
— гидрофобный транспортер (данное устройство представляет собой нефтяной скребок, который вызывает прилипание нефти к ленте транспортера; нефть поднимается из воды, отжимается и удаляется в контейнер);
— вихревой способ (вращающийся погружной импеллер вызывает завихрение потока в подповерхностном объеме, в результате чего нефтяное пятно двигается вниз по направлению оси завихрения; оно погружается на дно вихревой воронки и становится более плотным; всасывающий насос, установленный в месте концентрации нефти, удаляет нефть вместе с небольшим количеством воды.);
— гидрофобные скиммеры (скиммеры - плавучие боты, рабочая поверхность которых покрыта материалом, притягивающим и удерживающим нефть; вращаясь, рабочие поверхности (диски, барабаны, тросы и т.д.) притягивают нефтяную пленку и поднимают ее внутрь резервуара; собираемая нефть в данном случае почти не требует очистки; степень очистки акватории составляет до 99 % /58/; для легких нефтей используют дисковые, барабанные и тросовые типы скиммеров; щеточные и ременные скиммеры эффективны для тяжелых нефтей и их фракций).
Преимущества: Данный метод является одним из немногих применяемых при сильном загрязнении.
Недостатки: При концентрациях нефти меньше 5% механический сбор становится неэффективным и экономически невыгодным, к тому же использование данной технологии влечёт за собой необходимость проведения дополнительных восстановительных процедур. Кроме того, эффективность этого метода во многом зависит от оперативности действий на загрязнённом участке, т.к. со временем нефть впитывается и просачивается в нижележащие горизонты. Еще один минус заключается в том, что этот метод непригоден на болотистых почвах и других неустойчивых грунтах.
Принципы микробиологической деструкции нефти
Еще недавно рост микроорганизмов на нефти считался редким явлением, и предполагалось, что бактерии, способные использовать нефть, встречаются только там, где имеется сама нефть (нефтяные промыслы, нефтехранилища). Однако, согласно современным данным, микроорганизмы-нефтеде-структоры распространены очень широко в природе и могут быть выделены из любой почвы, осадочных пород, морской и речной воды. Способность использовать нефть в качестве источника энергии присуща не единичным специализированным формам, а многим грибам, бактериям и водорослям.
Выделены и описаны микроорганизмы, отнесенные к 70 различным видам, на примере которых показана возможность биодеградации различных нефтяных углеводородов/33, 34, 35, 66, ПО, 115, 121, 125, 126, 127, 148, 151, 167, 168, 173, 179, 185, 189, 191, 194, 197, 205, 210, 217, 222, 227, 229, 235/. В числе таких микроорганизмов: бактерии (Achromobacter, Alcaligenes, Artro-bacter, Bacillus, Bacterium, Brevibacterium, Citrobacter, Clostridium, Coryne-bacterium, Desulfovibrio, Enterobacter, Escherichia, Flavobacterium, Metano-bacterium, Micrococcus, Micromonospora, Mycobacterium, Pseudomonas, Sar-cina, Serratia, Spirillym, Vibrio, Thiobacillus), актиномицеты (Endomyces, No-cardia, Streptomyces), грибы (Aspergillus, Cephalosporium, Penicillium), дрожжи (Candida, Debaryomyces, Endomycopsis, Hansenula, Rhodotorula, Sac-charomyces, Torula, Torulopsis, Trichoderma, Trichosporon). Наиболее активными деструкторами среди них являются представители родов Acinetobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Brevibacterium, Corynebacterium, Flavobacterium, Micrococcus, Mycobacterium, Nocardia, Pseudomonas, Serratia /171, 188, 232/.
Эукариотные микроорганизмы (мицелиальные грибы, дрожжи), хотя и обладают высокой углеводородокисляющей активностью, однако в загрязненных экосистемах занимают второстепенное положение /54, 140, 156, 204, 213/.
Углеводородокисляющие микроорганизмы (УОМ) широко распространены и являются нормальным компонентом незагрязненной системы /62/. Эти микроорганизмы являются гетеротрофами и могут усваивать разнообразные органические соединения - углеводы, белки, жиры и пр. Численность углеводородокисляющих микроорганизмов в чистых экосистемах не превышает 1-100 кл/г почвы, что составляет 0,05-5% от общего числа бактерий, растущих на МПА /62/. На загрязненных нефтью почвах их титр возрастает и колеблется от 102 до 107 кл/г почвы /52/.
Численность микроорганизмов-нефтедеструкторов в естественных биоценозах в немалой степени определяется климатическими условиями, типом почв, степенью их обработки, глубиной залегания грунтовых вод. Даже в таких экстремальных условиях, как в пустынных песчаных почвах, где микрофлора весьма скудная, в местах загрязнения дизельным топливом и креозотом по данным Богардта и Хеммингсена /133/ число фенантренокисляю-щих бактерий составляет 6-100-106 кл/г сухой почвы и 5 10 кл/мл грунтовых вод. В местах разлива нефтяных дистиллятов на поверхности антарктических почв число метаболически активных нефтеокисляющих бактерий по данным Керри /193/ составляет 10-10 кл/г почвы.
Нефть представляет собой сложный конгломерат веществ, включающий алифатические, циклические, смешанные структуры углеводородов разного молекулярного веса, различных уровней разветвления углеродных цепей, в различной степени поликонденсированные и содержащие комплексные металлоорганические соединения тяжелых металлов. Именно химический и композиционный состав отдельных компонентов нефти определяют особенности метаболизма утилизации их микроорганизмами. Решающее значение для использования алифатических углеводородов имеет длина цепи: по мере удлинения цепи парафинов растет число видов, способных использовать эти соединения, а также активность их использования. Использование же углеводородов с длинной цепью распространено у микроорганизмов широко, и н-алканы с 10-18 атомами углерода используются очень часто и с огромной скоростью. Часто микроорганизмы окисляют углеводороды настолько полно, что накопления промежуточных продуктов не происходит /110, 223/.
Объекты исследований
Выделение углеводородокисляющей микрофлоры проводили из загрязнённых нефтью или нефтепродуктами образцов грунта.
Для выделения микроорганизмов, способных к деструкции нефтепродуктов, использовали метод накопительной культуры. Последовательность работ при этом была следующая:
Навеску почвы (1-5 г, в зависимости от численности аборигенной микрофлоры) вносили в колбу со 100 мл синтетической среды, указанного выше состава, и 2 г нефти в качестве единственного источника углерода. Инкубирование проводили в течение 10 суток при 24 С (180 об./мин) с двукратным пассированием накопительных культур (через каждые 5 суток) на свежие среды с нефтью. По завершении цикла был произведен высев на синтетическую агаризованную среду, содержащую, в качестве единственного источника углерода, нефть. Отбирали отдельные колонии, производили высев на богатую среду (LB-среда), после чего проверялась способность выделенной культуры расти на стерильной жидкой минеральной среде с нефтью в качестве единственного источника углерода и энергии. Первоначально способность микроорганизмов к деструкции нефти оценивалась визуально (в случае деструкции плотный исходный сгусток нефти превращался во множество мелких частиц размером от 0,5 до 3 мм в диаметре).
Альтернативным методом выделения штаммов-нефтедеструкторов является прямой высев на селективные агаризованные среды с нефтью или мазутом в качестве единственного источника углерода и энергии.
Для приготовления сред с диспергированным углеводородным субстратом использовали ультразвуковой дезинтегратор. Для этого в колбы на 300 мл вносили не более 100 мл минимальной синтетической среды приведённого выше состава, добавляли 2% агара, 0,01% Твина-80, 0,7% мазута (или 1,0% нефти). После стерилизации, ещё горячую среду диспергировали на ультразвуковом дезинтеграторе MSE-150B при максимальной амплитуде /99/. Время диспергирования - 3 мин для нефти и 4 мин для мазута. При неудовлетворительной степени дисперсности субстрата повторяли диспергирование несколько раз. Полученную таким образом агаризованную среду с диспергированным углеводородным субстратом необходимо сразу же разлить в чашки Петри. Посев производили так же, как и на стандартные агари-зованные среды.
