Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Успехи гибридомной технологии привели к быстрому развитию производства и широкому применению мо-ноклональных антител(МКА) в практической диагностике. Рынок диагностических МКА сформировался уже к концу 80-х годов и в настоящее время бурно развивается. Совершенствуются принципы и методы иммунодиагностики с помощью МКА с целью повышения скорости и качества диагностики. В онкологии моноклональные антитела используют для дифференциального иммунологического исследования пункта-тов. скарификатов. соскобов с опухолей при хирургических операциях с целью уточняющей диагностики. Для целей скрининга и мониторинга, выявления рецидивов неприемлема пункционная биопсия для забора биологического материала. Поэтому используют свойство антигенов опухолей слущиваться и поступать в кровоток, где они могут быть определены с помощью МКА. С целью расширения возможностей диагностики злокачественных новообразований в последнее десятилетие широко разрабатываются методы серологического определения в сыворотке опухолеассоциированных антигенов. Для целей мониторинга рака молочной железы с большим или меньшим успехом используют такие маркеры, как РЭА (раково-эмбриональный антиген), сывороточные антигены: СА-15-3. МСА, СА 19-9. СА 125, TPS <тканеспе-цифнческий полипептидный антиген). 3 качестве диагностических признаков используются следующие критерии: 1) повышение уровня маркера против верхней границы нормы; 2) выраженная динамика снижения уровня маркера после лечения не менее, чем на 50% . На сегодняшний день все маркеры, используемые для серодиагностики зло-, качественных опухолей, содержатся в сыворотке здоровых доноров. Процесс злокачественного роста сопровождается лишь повышением уровня этих маркеров в сыворотке. Поэтому эти маркеры не могут быть использованы для скрининга. Их используют только для мониторинга терапии, обнаружения рецидивов. Дальнейшее развитие диагностики онкологических заболеваний связывается с выделением новых опухолеспецкфических МКА.
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью работы является улучшение качества диагностики .за счет расширения ряда маркеров для се-
родиагностики и создания экспресс-метода и диагностического набора для скрининга нового опухолевого маркера в сыворотке и цельной крови, а также иммуноферментной тест-системы для количественного определения нового опухолевого маркера. При выполнении работы были поставлены следующие задачи:
-
Разработать технологию получения высокоочищенных монок-лональных'антител ИКО-25 от гибридомы-продуцента.
-
Разработать технологию получения антигена мембран жировых глобул женского молока.
-
Разработать ИФА тест- систему количественного анализа нового опухолевого маркера в сыворотке крови.
-
Показать, что МКА ИКО-25 определяют антиген в сыворотке онкологических больных и не реагируют с сывороткой здоровых доноров.
-
Разработать экспресс-мотод для скрииингового теста, который может Сыть использован для оценки степени опасности радио-ционного поражения, картирования зон проживания с высоким риском канцерогенеза, . рандомизированного скрининга населения по отбору групп с. высоким риском онкологических заболеваний, мониторинга рабочих, занятых в потенциально канцерогенных производственных процессах, и раннего выявления опухолей.
-
Провести апробацию разработанных иммуноферментной и им-муноагглютинационной тест-систем на клиническом материале.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Выделен и охарактеризован новый мембранный антиген, экспрессированный на опухолях эпителиального генеза. Впервые разработан экспресс-метод для скрининга опухолезого маркера в цельной крови человека. На основе МКА. специфичных к новому маркеру опухолей эпителиального генеза. разработана ИФА тест-система для количественного определения нового опухолевого маркера в сыворотке крови.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Экспериментально доказано, что МКА ИКО-25 узнают опухолевый антиген в сыворотке онкологических больных и не реагируют с сывороткой здоровых доноров. Разра^ ботаны.-технология получения высокоочищенных моноклональных антител ИКО-25 и технология получения нового мембранного антигена.
Установлен состав антигена, что необходимо для получения отраслевого образца стандарта антигена, с помощью которого можно оценить концентрации опухолевого маркера в сыворотке. Разработана иммуно-ферментная тест-система для количественного определения нового опухолевого маркера в сыворотке. Впервые разработан "экспресс-метод для клинического определения опухолевого антигена в сыворотке и крови человека. Разработана и утверждена научно-техническая документация: 1. Лабораторный регламент(ЛР 64-13-3-90) на получение моноклональних антител к антигену мембран мембран жировых глобул женского молока.
-
Лабораторный регламент(ЛР 05800805-41-93) на получение реагента для прямого метода исследования опухолей молочной железы, яичников и легких.
-
Медико-технические требования на разработку и освоение моноклональных.антител для иммуноцитологической и гистохимической диагностики опухолей молочной железы, легких, яичника (Протокол N 5 от 17.09.1990 г.. Экспертная комиссия по реактивам Комитета по новой технике МЗ СССР).
-
Разработка технологии получения высокоочищенных моноклональных антител и характеристика их специфичности.
-
Разработка технологии получения высокоочищенного антигена мембран жировых глобул женского молока и изучение его структурных особенностей.
-
Разработка ИФА тест-системы для количественного определения нового опухолевого маркера в сыворотке крови.
' 4. Разработка иммуноагглютинационного экспресс-метода для определения маркера опухолей эпителиального генеза в цельной крови и сыворотке.
5. Сравнительный анализ разработанных иммуноферментной и иммуноагглютинационной тест-систем на образцах сыворотки и цельной крови больных с опухолями различной локализации, неонкологической патологией и здоровых лиц.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Диссертация апробирована на заседании Ученого совета НТЦ " Лекбиотех" АО "Биотехнология" 14 февраля 1996 г.
- д. -
ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи, тезисы.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы из источников. Работа изложена на 116 страницах, содержит 1В рисунков и 18 таблиц.