Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние вопроса 12
1.1 Экологические аспекты процесса вермикультивирования 12
1.2 Эффективность вермикомпоста в стимулировании роста растений и подавлении фитопатогенных микроорганизмов 16
1.3. Особенности' взаимоотношений дождевых червей с бактериальной и грибной микрофлорой 24
Глава 2. Объекты и методы исследований 33
2.1. Объекты исследований 33
2.2. Методы исследования ростостимулирующеи активности вермикомпоста 34
2.2.1. Постановка эксперимента по определению ростостимулирующеи активности кислотной и щелочных вытяжек из исследуемых вариантов вермикомпоста 34
2.2.2. Постановка эксперимента по изучению особенностей взаимоотношений Е. fetida Andrei и сапротрофной микрофлоры субстрата и их влияние на формирование ростостимулирующеи активности вермикомпоста 35
2.3. Методы исследования фунгистатической активности вермикомпоста 37
2.3.1. Условия проведения биотестов для определения фунгистатической активности бактерий рода Pseudomonas в вермикомпосте 37
2.3.2. Условия проведения эксперимента, направленного на исследование фунгистатической активности бактериальных изолятов рода Pseudomonas, выделенных из органического субстрата на разных стадиях вермикультивирования 39
2.3.3. Условия проведения эксперимента, направленного на изучение влияния общей численности сапротрофных грибов в вермикомпосте на фунгистатическую активность выделенных из него бактериальных изолятов рода Pseudomonas 39
2.3.4. Постановка эксперимента для изучения динамики фунгистатический активности бактериального сообщества вермикомпоста в процессе его созревания 40
2.3.5. Условия проведения эксперимента по изучению влияния динамики общей численности сапротрофных грибов в вермикомпосте на фунгистатическую активность бактериальных изолятов рода Pseudomonas, выделяемых из него 41
2.3.6. Условия проведения эксперимента по определению зависимости фунгистатической активности бактерий рода Pseudomonas от трофической стратегии микромицетов вермикомпоста 41
2.4. Методы изучения эффективности интродукции активных штаммов микроорганизмов в вермикомпост 42
2.4.1. Условия проведения эксперимента по определению эффективности интродукции бактерий Pseudomonas sp. В-6798 в вермикомпост 42
2.4.2. Условия проведения эксперимента по исследованию эффективности интродукции гриба рода Trichoderma в органический субстрат, перерабатываемый дождевыми червями Е. fetida Andrei 44
2.5. Методы изучения влияния длительности вермикультивирования и фактора хранения вермикомпоста на его биологическую активность 45
2.5.1. Постановка эксперимента № 1 по изучению влияния длительности вермикультивирования на качество вермикомпостов 46
2.5.2. Постановка эксперимента № 2 по изучению влияния длительности вермикультивирования на качество вермикомпостов 47
2.5.3. Условия проведения эксперимента по изучению влияния фактора хранения на биологическую активность вермикомпоста 48
2.6. Статистическая обработка результатов 49
Глава 3. Ростостимулирующая активность вермикомпоста 51
3.1. Изменение ростостимулирующей активности вермикомпоста в процессе
переработки органического субстрата дождевыми червями Е. fetida Andrei... 51
3.2. Особенности взаимоотношений дождевых червей Е. fetida Andrei и сапротрофной микрофлоры органического субстрата в процессе вермикультивирования 56
3.3. Влияние взаимоотношений дождевых червей Е. fetida Andrei и сапротрофной микрофлоры органического субстрата на формирование ростостимулирующей активности вермикомпоста 67
Глава 4. Фунгистатическая активность вермикомпоста 78
4.1. Фунгистатическая активность бактерий рода Pseudomonas в вермикомпосте 78
4.2. Влияние общей численности сапротрофных грибов в вермикомпосте на фунгистатическую активность выделенных из него бактериальных изолятов рода Pseudomonas 80
4.3. Зависимость фунгистатической активности бактерий рода Pseudomonas от трофической стратегии микромицетов 86
Глава 5. Эффективность интродукции активных штаммов микроорганизмов в вермикомпост 95
5.1. Эффективность интродукции бактерий Pseudomonas sp. В-6798 в
вермикомпост 95
5.2. Эффективность интродукции гриба рода Trichoderma в органический
субстрат, перерабатываемый дождевыми червями E.fetida Andrei 109
Глава 6. Биотехнологические аспекты процесса вермикультивирования 125
6.1. Влияние длительности вермикультивирования на качество вермикомпоста 125
6.2. Влияние фактора хранения на биологическую активность вермикомпоста 133
Выводы 144
Список использованной литературы
- Эффективность вермикомпоста в стимулировании роста растений и подавлении фитопатогенных микроорганизмов
- Постановка эксперимента по изучению особенностей взаимоотношений Е. fetida Andrei и сапротрофной микрофлоры субстрата и их влияние на формирование ростостимулирующеи активности вермикомпоста
- Влияние взаимоотношений дождевых червей Е. fetida Andrei и сапротрофной микрофлоры органического субстрата на формирование ростостимулирующей активности вермикомпоста
- Влияние общей численности сапротрофных грибов в вермикомпосте на фунгистатическую активность выделенных из него бактериальных изолятов рода Pseudomonas
Введение к работе
Современная мировая наука и практика большое внимание уделяют проблемам переработки органических отходов и их рационального использования как высокоценного биологического ресурса (Бирюкова, Суханова, 2004, Garg, et al., 2005). Однако большинство разработанных на сегодняшний день технологий биоконверсии, как правило, не являются безотходными и экологически чистыми, требуя больших энергозатрат (Филиппова, 2002, Garg, et al, 2006). При этом качество нативных отходов животноводства не отвечает агротехническим и экологическим требованиям из-за неудовлетворительных физических свойств, наличия патогенов, жизнеспособных семян сорняков и неприятного запаха, а также вероятности загрязнения почвы и грунтовых вод водорастворимыми фракциями азотсодержащих соединений (Мишустин и др., 1979; Матросова и др., 2004; Inbar et al., 1993). Одним из направлений агробиологической науки, призванной решить эту проблему, является вермикультивирование, которое получило широкое распространение как за рубежом, так и в России и относится к ресурсо-и энергосохраняющим технологиям переработки органических отходов.
Вермикультивирование представляет собой искусственное разведение технологичных дождевых червей для переработки органических отходов в биологически активное высокоэффективное удобрение - вермикомпост. Вермикомпост содержит не только все необходимые для роста растений питательные вещества в сбалансированном виде, но также и большое количество стимуляторов роста, ферментов, антибиотиков, выделяемых червями и комплексом ассоциативной микрофлоры (Tomati, 1988). Одним из важнейших агротехнических преимуществ вермикомпоста перед традиционным подстилочным навозом является отсутствие в нем яиц гельминтов, патогенной микрофлоры и высокие удобрительные и технологические свойства (Нанштейн, 1975; Касатиков, Касатикова, 2002).
Кроме того, на фоне снижения обеспеченности растений основными элементами минерального питания и увеличения темпов деградации сельскохозяйственных угодий, использование вермикомпоста способствует воспроизводству почвенного плодородия и оздоровлению почв, связыванию тяжелых металлов и радионуклидов (Atiyeh et al., 2000b; Наумова и др., 2002; Бирюкова, Суханова, 2004). Таким образом, вермикультивирование относится к перспективным технологиям, позволяющим одновременно решить проблему утилизации органических отходов, повышения урожайности культур и качества сельскохозяйственной продукции, а также защиты растений от болезней и вредителей (Szczech, 1999; Arancon et al., 2006b).
Современная практика вермикультивирования располагает большим разнообразием технологических приемов и технических средств (Покровская, 1991). В первую очередь для повышения эффективности процесса вермикультивирования необходимо выбрать оптимальный состав и способ подготовки органического субстрата перед интродукцией дождевых червей. Одним из наиболее эффективных способов, ускоряющим процесс подготовки субстратов по сравнению с обычным компостированием, является их смешивание с торфом, запасы которого в Западной Сибири значительны.
Тем не менее, эффективность внесения чистого торфа в качестве органического удобрения мала, поскольку содержащиеся в нем питательные элементы труднодоступны как для почвенных микроорганизмов, так и для растений. Тогда как совместное его использование с отходами животноводства в качестве смеси для последующего вермикультивирования позволяет активизировать органическое вещество торфа и, таким образом, способствует рациональному использованию его биоресурсного потенциала.
Совместно с торфом или вместо него в качестве наполнителей могут быть использованы различные целлюлозо- и лигнинсодержащие материалы, такие как солома и опилки, что позволяет уменьшить плотность сложения торфонавозной смеси и одновременно решить проблему утилизации и растениеводческих отходов. Кроме того, торф успешно используется в качестве компонента грунтов для выращивания растений на основе вермикомпоста, доля которого составляет 10-30 %.
Стремление к увеличению эффективности технологии вермикультивирования ориентирует производителей вермикомпоста на максимальный выход готового продукта. Действительно, по мере увеличения длительности вермикультивирования повышается степень переработки органического субстрата и, следовательно, увеличивается процент выхода вермикомпоста. Однако следует учитывать, что биоконверсия — это необратимая трансформация органического вещества, которая при превышении оптимальных сроков вермикультивирования, приводит к разрушению биологически активных веществ и, следовательно, к снижению качества вермикомпоста. Тем не менее, вопрос о том, как длительность вермикультивирования влияет на качество вермикомпоста остается открытым. Поскольку одним из аспектов качества вермикомпоста является его биологическая активность, актуальным становится изучение влияния длительности вермикультивирования на уровень биологической активности вермикомпоста.
Кроме того, актуальной задачей является установление микробиологических критериев для определения завершенности технологического цикла вермикультивирования в целях сохранения высокого качества получаемого вермикомпоста.
Поскольку в трансформации органического вещества в процессе вермикультивирования участвует микробное сообщество вермикомпоста, необходимо также выявить роль микрофлоры в процессах формирования ростостимулирующігх и фунгистатических свойств вермикомпоста, которые являются основными критериями качества.
Изучение возможности усиления и регулирования полезными свойствами вермикомпоста путем увеличения в составе микробоценоза активных штаммов микроорганизмов, отвечающих за ростостимулирующие и фунгистатические свойства, также представляет большой научно-практический интерес.
Цель работы - Исследовать теоретические и прикладные аспекты рационального использования биоресурса технологичных дождевых червей и потенциала микробного сообщества органических отходов для разработки научных основ управляемого вермикультивирования и воспроизводства почвенного плодородия.
Задачи исследований:
1. Установить ключевые биологические факторы, определяющие ростостимулирующую активность вермикомпоста.
2. Определить факторы, обусловливающие фунгистатическую активность вермикомпоста.
3. Исследовать особенности взаимоотношений технологичных дождевых червей Eisenia fetida Andrei и сапротрофной микрофлоры торфонавозного субстрата и их влияние на процессы биоконверсии органических отходов.
4. Изучить эффективность интродукции активных штаммов микроорганизмов в торфонавозный субстрат, перерабатываемый технологичными дождевыми червями.
5. Оценить влияние длительности технологического цикла вермикультивирования и фактора хранения вермикомпоста на его качество.
Защищаемые положения:
1. В вермикомпосте основными продуцентами стимуляторов роста, как аминной, так и гумусовой природы, являются микроорганизмы, участвующие в трансформации азотсодержащих органических веществ, динамика численности которых определяется свойствами органического субстрата. Влияние дождевых червей сказывается на увеличении абсолютных показателей биологической активности вермикомпоста. Фунгистатическая активность вермикомпоста обусловлена высокой численностью в нем бактерий рода Pseudomonas, супрессивные свойства которых индуцируются периодическими всплесками численности микромицетов.
2. Доминирование в микробном сообществе вермикомпоста представителей r-типа экологической стратегии снижает эффективность интродукции в него активных чужеродных штаммов бактерий рода Pseudomonas вследствие возможного обострения конкуренции быстрорастущих форм бактерий за субстрат, приводящей к деформации состава сообщества и элиминации из него наиболее активных аборигенных штаммов бактерий. Более эффективная интродукция в вермикомпост грибов рода Trichoderma, обусловленная их высокой конкурентоспособностью, является перспективным технологическим приемом, позволяющим сократить сроки вермикультивирования, повысить качество вермикомпоста и продлить период его хранения.
3. Длительность периода вермикультивирования оказывает значительное влияние на качество получаемого вермикомпоста. При использованном в опытах соотношении массы червей и субстрата оптимальным технологическим циклом являются 6-8 недель, о чем свидетельствуют максимальный уровень биологической активность копролита, отсеваемого в данный период, и наилучшие показатели его качества в процессе последующего хранения.
Научная новизна.
Впервые установлена решающая роль сапротрофного микробного сообщества, в частности бактерий рода Pseudomonas, в формировании фунгистатической активности вермикомпоста. Уровень антагонистической активности бактерий обусловлен динамикой численности микромицетов в органическом субстрате и зависит от типа трофической стратегии грибов. Ростостимулирующая активность вермикомпоста определяется соединениями как аминной, так и гумусовой природы, основными продуцентами которых являются микроорганизмы-аммонификаторы. Установлено, что среди стимуляторов гумусового ряда наиболее активными в копролитах являются фульвокислоты.
Впервые показано, что характер динамики численности микроорганизмов и основных показателей биологической активности вермикомпоста в процессе его созревания зависит, прежде всего, от свойств самого субстрата. Влияние дождевых червей сказывается на увеличении абсолютных значений параметров активности.
В работе впервые исследованы популяционные аспекты взаимодействия чужеродных и аборигенных видов быстрорастущих форм микроорганизмов при разработке технологического приема интродукции в вермикомпост активных штаммов микроорганизмов родов Pseudomonas и Trichoderma. Установлено влияние длительности периода вермикультивирования на качество получаемого вермикомпоста и его показатели в процессе хранения.
Практическая значимость.
Результаты работы могут быть использованы для создания научно обоснованных технологий биоконверсии органических отходов путем управляемого вермикультивирования в целях получения высококачественного вермикомпоста с заданными свойствами. Выявленные основные биотехнологические параметры вермикультивирования могут быть использованы в качестве критериев определения оптимального срока технологического цикла вермикультивирования. Разработанный технологический прием интродукции гриба рода Trichoderma в вермикомпост позволяет сократить период технологического цикла вермикультивирования, повысить выход вермикомпоста и продлить сроки его хранения.
Публикации и апробация работы.
Основные результаты работы были представлены на Ежегодной научной студенческой конференции (Томск, 2002), 6-й Международной научной школе-конференции студентов и молодых ученых "Экология Южной Сибири й сопредельных территорий" (Абакан, 2002), Международной научно-практической конференция "Высокие технологии добычи, глубокой переработки и использования озерно-болотных отложений" (Томск, 2003), 1-й и 2-й Международной научно-практической конференции молодых ученых СО РАСХН "Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых" (Краснообск, 2004, 2006), 4-ом Московском Междунар одном Конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2007), 11-й Всероссийской научно-практической конференции "Научное творчество молодежи" (Анжеро-Судженск, 2007). Всего по теме диссертации сделано 20 публикаций, в том числе 2 - в изданиях, рецензируемых ВАК.
Объем и структура работы.
Диссертация изложена на 169 страницах, состоит из введения, 6 глав, выводов, списка литературы, 8 таблиц и 63 рисунков. Список литературы включает 243 источника, из которых 143 иностранных авторов.
Эффективность вермикомпоста в стимулировании роста растений и подавлении фитопатогенных микроорганизмов
Многочисленные эксперименты в полевых и тепличных условиях показали, что применение вермикомпостов ускоряет рост растений и повышает качество урожая многих культур, таких как бобовые, кресс-салат (Masciandaro et al., 1997), виноград, бананы, клубника, томаты (Степанова, 2002; Мерзлая, 2004; Zaller, 2007), зерновые, репа и сельдерей (Терещенко, 2001), яровая пшеница, овес, кукуруза (Ломако, Аскаров, 2003), ячмень, морковь, свекла столовая, лук (Касатикова, Касатиков, 2002; Касатиков, Касатикова, 2002), кориандр, рапс, пекинская капуста (Ломако, Аскаров, 2003), райграс, картофель (Корсунова и др., 2002; Терещенко и др., 2004), кукуруза (Мерзлая, 2004), огурец (Тен и др., 2004), белокочанная капуста и пшеница (Shanna et al., 2004).
Многолетние исследования Огайского государственного университета таюке продемонстрировали, что добавление вермикомпостов на основе навоза КРС, свиного навоза, пищевых и бумажных отходов в смесь для выращивания растений (Metro-Mix 360) или в почву значительно увеличивает всхожесть, рост, развитие и урожайность различных овощных (томатов, перцев, салата), ягодных (клубники, малины), декоративных культур (петуний, бархатцев, хризантем, бальзаминов, подсолнечника) и фруктов (виноград) (Subler et al., 1998; Atiyeh et al., 2000b, 2001, 2002; Arancon et al., 2003a, 2004, 2005, 2006b).
Способность вермикомпостов повышать рост растений приписывают разнообразию физико-химических факторов, поскольку вермикомпосты обладают высокой пористостью и водоудерживающей способностью, имеют большую площадь поверхности, обеспечивая сильную поглотительную способность и сохранение питательных веществ. Вермикомпосты содержат питательные вещества, такие как нитраты, обменный фосфор, растворимый калий, кальций и магний в легко доступных для растений формах (Masciandaro, 2000).
Кроме того, увеличению продуктивности растений таюке способствуют огромное разнообразие и активность микроорганизмов (Tomati et al., 1988), присутствие биологически активных веществ, таких как регуляторы роста растений и гуминовые кислоты (Tomati et al., 1988; Muscolo et al., 1999; Atiyeh et al., 2001, 2002; Arancon et al, 2003b), содержащиеся в вермикомпосте и стимуляция колонизации микоризными грибами корней (Cavender et al., 2003).
Улучшение роста корней таюке связано с большей доступностью питательных элементов в копролитах дождевых червей, которые содержат больше доступных минеральных питательных элементов, чем почва. Но, несмотря на большее содержание доступных питательных элементов для растений в почве с дождевыми червями, их концентрация, как считают многие исследователи, мало влияет на рост растений.
Механизмы, с помощью которых дождевые черви увеличивают доступность питательных элементов для растений, до сих пор обсуждаются, но, как предполагают некоторые исследователи, они зависят от активности микроорганизмов в кишечнике дождевых червей. Гипотеза, о том, что микробные метаболиты, особенно вещества регулирующие рост растений, могли \ быть ответственные за стимулирующее влияние копролитов дождевых червей, была впервые выдвинута R.L. Nielson (1965) на основе экспериментов Н. Норр и C.S. Slater (1949), которые обнаружили, что добавление живых и мертвых дождевых червей в почву было связано с увеличением роста тестируемых растений. Затем J.N. Parle (1963) выдвинул гипотезу об участии микроорганизмов в стимулировании роста растений, а -последующие микробиологические, физические и химические изменения в .созревающих копролитах подтверждали, что дождевые черви и их копролиты стимулируют почвенное плодородие, увеличивая стабильность агрегатов с помощью полисахаридов бактерий и посредством увеличения скорости разложения органического материала микрофлорой.
R.L. Nielson (1965), наблюдавший увеличение урожая на пастбище в почве с дождевыми червями, предположил, что продуцированные ростостимулирующие соединения синтезируются дождевыми червями и секретируются ими в копролиты, а затем и в почву. Однако, как он установил, эти вещества не являются продуктами метаболизма животных, а могут высвобождаться микрофлорой, обитающей в пищеварительном тракте дождевых червей.
Присутствие ауксино-подобных веществ в копролитах было позже снова подтверждено J.A. Springett и J.K. Syers (1979), которые исследовали рост корней проростков райграса в присутствии копролитов двух видов дождевых червей (Aporrectodea caliginosa и Lumbricus rubellus) и различных доз фосфатов. Они заключили, что дождевые черви изменяют доступность питательных элементов и/или способность поглощать элементы питания или влияют на механизмы роста растений. Различия в способности разных видов дождевых червей высвобождать ростостимулирующие вещества может зависеть от особенностей микрофлоры кишечника.
Постановка эксперимента по изучению особенностей взаимоотношений Е. fetida Andrei и сапротрофной микрофлоры субстрата и их влияние на формирование ростостимулирующеи активности вермикомпоста
Постановка эксперимента по изучению особенностей взаимоотношений Е. fetida Andrei и сапротрофной микрофлоры субстрата и их влияние на формирование ростостимулирующей активности вермикомпоста
Для определения влияния сапротрофной микрофлоры и дождевых червей на ростостимулирующие свойства вермикомпоста, обусловленные соединениями аминокислотной природы, дождевых червей культивировали на двух видах органического субстрата следующего состава: низинный торф с подстилочным навозом КРС (1:4 по массе) и низинный торф со свиным навозом (1:4 по массе). Контрольным вариантом эксперимента являлась исходная ТНС.
Культивирование червей, отбор образцов для получения кислотных вытяжек, определение интенсивности накопления аминокислот и проведение биотеста с кислотными вытяжками осуществляли в соответствии с методиками, приведенными в разделе 2.2.1. Продолжительность эксперимента - 84 дня. В субстрат, содержащий свиной навоз, запуск червей осуществляли на 1,5 недели позже в связи с высоким содержанием аммиака, токсичного для червей.
Микробиологический анализ включал в себя определение общей численности микроорганизмов, численности неспорообразующих желто-пигментных и флюоресцирующих бактерий на МПА.
Пробы для микробиологического анализа отбирались каждую неделю. Субстрат, отобранный методом конверта из пяти точек, просеивали через обработанное спиртом сито с диаметром отверстий 3 мм. Из смешанной усреднённой пробы брали 1 грамм отсеянного вермикомпоста для микробиологического анализа.
Анализ осуществляли методом посева по стандартной методике (Аникеев, Лукомская, 1983) из 4-6 разведений в трехкратной повторности. Засеянные чашки инкубировали в термостате при температуре 25 ±1С. Подсчет колоний микроорганизмов осуществляли на 3-7 сутки. Результаты микробиологического анализа пересчитывали на 1 г а.с.в. по формуле (Аникеев, Лукомская, 1983): _А- Км? J V где N - количество КОЕ в 1г а.с.в.; А - количество колоний в чашке Петри; Kw -коэффициент влажности; V - объем 1 капли (0,06 мл); п - номер рабочего разведения.
Кроме того, в течение эксперимента один раз в неделю определяли активность протеазы по следующей методике (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1980). Фотопленку разрезали на прямоугольники и вставляли в пластмассовые рамки. Через две недели рамки осторожно вынимали и высушивали пленки. Пленку помещали на разлинованную на кальке сетку с квадратами площадью 4 мм . После учета числа квадратов сетки, совпадающих с пятнами разложения на пленке, определяя процент разложения пленки. По проценту разложения негативного слоя пленки судили о протеолитической активности вермикомпоста.
С целью определения влияния сапротрофной микрофлоры и дождевых червей на ростостимулирующие свойства вермикомпоста, обусловленные соединениями гумусовой природы, дождевых червей культивировали на органическом субстрате, состоявшем из низинного торфа и подстилочного навоза КРС (1:4 по массе) на протяжении 82 суток.
Для изучения динамики ростостимулирующей активности вермикомпоста в процессе его созревания осуществляли регулярный отбор проб для получения щелочных вытяжек из вермикомпоста, с которыми проводили биотест на семенах пшеницы по методике, представленной в разделе 2.2.1.
Кроме того, дважды в неделю отбирали пробы вермикомпоста на химический анализ для определения содержания фульвокислот и гуминовых кислот по методике Пономаревой-Плотниковой (Определение фракционного 1975). Также определяли активность полифенолоксидазы согласно методике, описанной в разделе 2.2.1.
Пробы для микробиологического анализа отбирались в динамике дважды в неделю по вышеописанной методике. Микробиологический анализ включал в себя: определение общей численности микроорганизмов, численности неспорообразующих желто-пигментных и флюоресцирующих бактерий на МПА, численности амилолитических микроорганизмов на КАА.
Для исследования фунгистатической активности вермикомпоста во всех экспериментах осуществляли вермикультивирование дождевых червей на ТНС в соответствии с описанием, приведенным в разделе 2.2.1.
Для исследования фунгистатической активности бактерий рода Pseudomonas, содержащихся в вермикомпосте, (Сэги, 1983) бактериальные изоляты, относящиеся к роду Pseudomonas, формирующие на МПА желто-пигментные, бесцветные или флюоресцирующие колонии и представляющие собой грамотрицательные неспорообразующие палочки с характерным типом движения выделяли в чистую культуру.
Морфологические признаки отсеянных бактериальных культур проверяли путем прямого микроскопирования живых и фиксированных окрашенных препаратов по стандартной методике (Аникиев, Лукомская, 1983).
Фунгистатическую активность бактерий рода Pseudomonas определяли в серии биотестов с чистыми культурами сапротрофных грибов - родов Penicillium, Aspergillus, Trichoderma и фитопатогенных грибов - Fasarium oxysporum, Bipolaris sorokiniana, Rhizoctonia solani.
В соответствии с приведенной на рисунке 2.1 схемой каждую бактериальную культуру рода Pseudomonas наносили на комплексную агаризованную среду (КГА : МПА= 1:1) микробиологической петлей в виде прямого штриха. На 3-й сутки в каждую чашку с бактериальным штрихом раскладывали по одному агаровому блоку гриба, рост которого измеряли по 6-ти направлениям от агарового блока. Чашки выдерживали в термостате при температуре 2 5±1 С. Повторность биотеста - шестикратная.
Влияние взаимоотношений дождевых червей Е. fetida Andrei и сапротрофной микрофлоры органического субстрата на формирование ростостимулирующей активности вермикомпоста
Для выявления роли дождевых червей и сапротрофной микрофлоры в формировании ростостимулирующей активности вермикомпоста на всем протяжении вышеописанного эксперимента еженедельно проводили биотесты с кислотными вытяжками, полученными из трех исследуемых органических субстратов по методике, описанной в разделе 2.2.1 .
По результатам эксперимента установлено, что в вариантах с вермикомпостами на обоих видах навоза наблюдалась прямая зависимость между содержанием в субстрате аминокислот и активностью кислотных вытяжек по отношению к зеленой массе проростков пшеницы. Согласно данным, представленным на рисунке 3.14, абсолютные показатели активности вытяжек в варианте с вермикомпостами была выше, чем в варианте с компостом ТНС. Наиболее ярко эта тенденция была выражена по отношению к зеленой массе (рис. 3.15).
По отношению к зеленой массе максимальные уровни активности кислотных вытяжек, полученных из вермикомпоста на основе навоза КРС, были зафиксированы на 35 и 49-е сутки, чему предшествовало максимальное накопление аминокислот в период с 28 по 42-е сутки (рис. 3.13). Для вермикомпоста на основе свиного навоза максимум активности приходился на 49-е сутки, следовавший за максимальным накоплением аминокислот на 42-е сутки (рис. 3.13).
Расчет коэффициента корреляции подтвердил наличие в вариантах с вермикомпостами более тесной связи между содержанием НПП и активностью вытяжек по отношению к зеленой массе проростков пшеницы (г=0,34 и 0,21 соответственно), чем в компосте ТНС (г=0,06).
Снижение уровня активности кислотных вытяжек по отношению к зеленой массе проростков наблюдалось для обоих вариантов вермикомпостов после 49 суток и соответствовало уменьшению содержания аминокислот. Основываясь на полученных результатах можно предположить, что в вермикомпосте аминокислоты являются одними из основных стимуляторов роста вегетативной части растений. Для варианта с компостированием ТНС отмеченная зависимость выражена в меньшей степени.
Как видно из представленных рисунков 3.14 и 3.15, динамика активности кислотных вытяжек в отношении веса зеленой массы и веса корней проростков во всех вариантах опыта имела сходный характер. Максимальную активность по отношению к корням проростков кислотные вытяжки во всех вариантах опыта проявляли на 21-е сутки наблюдений. На 42-е сутки наблюдалось снижение активности кислотных вытяжек, при этом вытяжка из компоста ТНС оказала ингибирующий эффект на рост корней.
Следует отметить, что снижение стимулирующей активности кислотных вытяжек на 42-е сутки сопровождалось уменьшением буферной емкости органических субстратов, взрывообразным ростом общей численности микроорганизмов и увеличением активности протеаз (рис. 3.6, 3.12, 3.14, 3.15). Не исключено, что в данный период имело место скачкообразное изменение состава органоминерального комплекса субстрата с переходом его в качественно новое состояние. Дальнейшее увеличение, начиная с 44-х суток эксперимента, активности кислотных вытяжек сопровождалось снижением общей численности микроорганизмов и восстановлением буферной емкости органического вещества субстрата (рис. 3.6, 3.14, 3.15).
Проведенный корреляционный анализ показал, что на динамику активности кислотных вытяжек по отношению и к корням, и к зеленой массе основное влияние оказывают микроорганизмы самого органического субстрата. Коэффициенты корреляции для компоста ТНС, вермикомпоста на основе навоза КРС и вермикомпоста на основе свиного навоза составляли соответственно: -0,73 и -0,34, -0,44 и -0,36, 0,58 и 0,31.
Помимо основного влияния микрофлоры субстрата на динамику активности кислотных вытяжек, дождевые черви также вносят вклад в изменение активности вытяжек. Это подтверждалось более тесными взаимосвязями между динамикой накопления НПП и динамикой активности вытяжек как по отношению к зеленой массе, так и к массе корней в вариантах с вермикомпостами по сравнению с компостом ТНС. Коэффициенты кросскорреляции для вермикомпоста на основе навоза КРС составили 0,42 и 0,64, для вермикомпоста на основе свиного навоза - 0,57 и 0,70 и для компоста ТНС-0,41 и 0,56.
Таким образом, на начальных этапах вермикультивирования основным продуцентом протеолитических ферментов является микрофлора органического субстрата. По мере переработки органического субстрата в процессе вермикультивирования возрастает роль протеаз, продуцируемых червями, о чем свидетельствовало наличие второго пика активности в вариантах с вермикомпостами. На динамику активности кислотных вытяжек влияют свойства микробного сообщества самого органического субстрата, а черви оказывают влияние на абсолютные значения активности вытяжек.
В целях исследования активности ростостимулирующих веществ гуминовой природы из органического субстрата, перерабатываемого дождевыми червями получали щелочные вытяжки для проведения биотеста.
Анализируя динамику ростостимулирующей активности щелочных вытяжек по отношению к зеленой массе (1) и к корням (2) проростков пшеницы, можно заметить, что на протяжении всего периода вермикультивирования она имела колебательный характер и изменялась с определенной периодичностью (рис. 3.16).
Влияние общей численности сапротрофных грибов в вермикомпосте на фунгистатическую активность выделенных из него бактериальных изолятов рода Pseudomonas
Для проверки предположения о зависимости уровня фунгистатической активности псевдомонад от численности грибов в вермикомпосте был проведен эксперимент, в ходе которого было спровоцировано резкое скачкообразное увеличение численности грибов в перерабатываемой червями ТНС за счет первоначального снижения влажности субстрата на 10 % и последующего обильного увлажнения. Непосредственно до и после увлажнения субстрата из него выделяли бактериальные культуры рода Pseudomonas и определяли уровень их фунгистатической активности, о котором судили по степени подавления скорости радиального роста чистых культур грибов Bipolaris sorokiniana и Fusarium oxysporum.
В результате изучения зависимости уровня фунгистатической активности псевдомонад от численности низших грибов в вермикомпосте было установлено, что резкое увеличение влажности субстрата привело не только к более чем двукратному росту численности грибов (с 412 тыс. до 841 тыс. КОЕ / 1 г а.с.в.), но и к увеличению таких показателей вегетативного роста микромицетов, как длина и плотность гиф (с 3,7 мм и 16 шт./мм перед увлажнением до 5,7 мм и 44,8 шт./мм2 после увлажнения соответственно). Л.К. Алехина с соавт. (2001) наблюдали аналогичную вспышку численности грибов, с последующей вспышкой численности бактерий, при инициации микробной сукцессии путем увлажнения почвы.
По результатам биотестов установлено, что фунгистатическая активность бактериальных изолятов рода Pseudomonas, выделенных из вермикомпоста после увлажнения, возросла по отношению к F. oxysporum и В. sorokiniana с Ю,9±2,9 % до 24Д±2,3 % и с 3,7±1,1 % до 9,8±1,3 % соответственно.
Поскольку взаимоотношения в любой экосистеме формируются на основе конкуренции и трофических связей между микроорганизмами (Мирчинк, 1988), увеличение активности бактерий, возможно, произошло за счет реутилизации грибной массы (Битюцкий и др., 2002), поскольку экскреты и мертвая биомасса грибов представляют собой доступный субстрат, увеличение содержания которого активизирует микроорганизмы
Кроме Н.П. Битюцкого с соавт. (2002), наблюдавшего увеличение численности микроорганизмов-аммонификаторов, данное предположение подтверждает исследование К. Tomberg с соавт. (2003), в которых инокуляция почвы дереворазрушающими грибами обусловила увеличение численности грамотрицательных бактерий. Авторы обосновали это тем, что грамотрицательные бактерии увеличили свою численность благодаря высвобождению элементов питания, выделению метаболитов и увеличению содержания доступного углерода в процессе разложения органического вещества грибами.
К тому же, грибы создают вокруг себя среду, насыщенную продуктами обмена (аминокислотами, белками, пептидами мочевиной, моносахарами, органическими кислотами, витаминами и минеральными веществами), что и привлекает другие микроорганизмы (Проблемы биоконверсии..., 1986; Мирчинк, 1988). Иногда колонизация мицелия заканчивается его лизисом. Среди микроорганизмов, лизирующих мицелий грибов встречаются и бактерии рода Pseudomonas. При внесении отмершего мицелия в почву происходит заметное увеличение числа почвенных бактерий. Бактерии также могут развиваться на гифах грибов, как эпифиты, используя грибные метаболиты и не причиняя им никакого вреда. Споры грибов, выделяющие питательные и ростактивирующие вещества, обуславливают усиленное развитие бактерий на их поверхности (Мирчинк, 1988).
Таким образом, результаты эксперимента подтвердили вероятность того, что фунгистатическая активность псевдомонад в вермикомпосте в значительной степени может быть обусловлена активностью грибной составляющей микробоценоза вермикомпоста. Следует отметить, что полученные результаты соответствуют сведениям S. Scheu и D. Parkinson (1994) и G.G. Brown (1995) об увеличении в субстратах, перерабатываемых червями, прежде всего быстрорастущих форм микромицетов (r-стратегов), способных быстро использовать легко ассимилируемые соединения, находящиеся в копролитах.
Однако из результатов биотестов следует, что уровень фунгистатической активности бактериальных изолятов рода Psendomonas, выделенных из органического субстрата в процессе его переработки дождевыми червями; увеличивался к 10-20 суткам культивирования и снижался к 30 суткам (рис. 4.2). Таким образом, можно заключить, что фунгистатическая активность вермикомпоста является величиной непостоянной и может значительно изменяться как в процессе вермикультивирования, так при хранении вермикомпоста.
Полученные данные позволили предположить, что вермикомпост к моменту его созревания будет обладать низким уровнем фунгистатической активности. Для проверки этого предположения было проведено исследование динамики фунгистатической активности бактериального консорциума органического субстрата, перерабатываемого червями на протяжении более длительного срока - 2 месяцев.
Поскольку помимо бактерий рода Psendomonas на фунгистатическую активность вермикомпоста влияют бактерии и других таксонов, была разработана новая методика, позволяющая оценить фунгистатическую активность всего бактериального сообщества (раздел 2.3.4).
Результаты, представленные на рисунке 4.4, свидетельствуют о том, что кривая динамики фунгистатической активности бактериального консорциума вермикомпоста на протяжении проанализированного периода времени имела вид, близкий к синусоиде. Следовательно, предположение о возможном снижении уровня фунгистатической активности вермикомпоста к моменту его созревания являлось необоснованным, поскольку изменение фунгистатической активности имело достоверно колебательный характер.
В следующем эксперименте в процессе вермикультивирования выделяли бактериальные изоляты рода Pseiidomonas и оценивали уровень их фунгистатической активности стандартным методом бактериального штриха (раздел 2.3.1).
