Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Аналитический обзор. токсичные метаболиты сине зеленых водорослей и методы их определения 10
1.1 Сине-зеленые водоросли в окружающей среде. Токсичные метаболиты сине-зеле ных водорослей - цианотоксины 10
1.1.1 Нейротоксичные сакситоксины 11
1.1.2 Нейротоксичные анатоксины 16
1.1.3 Гепатотоксичные микроцистины 18
1.2 Другие виды биологической активности изучаемых цианотоксинов 23
1.3.Методы определения цианотоксинов 23
1.3.1 Скрининговые методы анализа 24
1.3.2 Методы селективного определения изучаемых цианотоксинов
1.3.2.1 Хроматографические методы определения цианотоксинов 26
1.3.2.2 Масс-спектрометрические методы определения цианотоксинов 28
1.4 Методы масс-спектрометрии, применяемые для анализа биологических молекул 30
1.4.1 Метод матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации - масс спектрометрии 30
1.4.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография-масс-спектрометрия с
электрораспылительной ионизацией 30
1.4.3 Типы современного оборудования для жидкостной хромато-масс-спектро-метрии 31
1.4.4 Идентификационные требования при проведении масс-спектрометрического анализа 33
1.5 Пробоподготовка для масс-спектрометрического анализа микроцистинов 34
ГЛАВА 2 Разработка аналитической процедуры анализа изучаемых цианотоксинов с применением метода масс спектрометрии 37
2.1 Анализ стандартных соединений изучаемых цианотоксинов методом высоко эффективной жидкостной хроматографии- тандемной масс-спектрометрии 37
2.1.1 Хроматографическое разделение 37
2.1.2 Масс-спектрометрическое детектирование 39
2.1.2.1 Масс-спектрометрическое детектирование соединений группы сакситоксинов 40
2.1.2.2 Масс-спектрометрическое детектирование анатоксина-a 41
2.1.2.3 Особенности масс-спектрометрического детектирования микроцистинов
2.1.2.3.1 Зависимость характера спектра от применяемых режимов фрагментации 44
2.1.2.3.2 Фрагментные спектры, получаемые на разных типах приборов 46
2.1.2.3.3 Фрагментные спектры соединений группы микроцистинов 47
2.1.3 Метод одновременного масс-спектрометрического определения анатоксина-а и микроцистинов 54
2.2 Оптимизация процедуры пробоподготовки образцов биомассы для хромато-масс-спектрометрического анализа микроцистинов 54
2.2.1 Одновременная экстракция анатоксина-а и микроцистинов из природной воды 55
2.2.2 Оптимизация процедуры пробоподготовки для анализа микроцистинов из биомассы методом хромато-масс-спектрометрии 56
2.2.2.1 Оценка эффекта обработки биомассы ацетонитрилом до целевой экстракции 56
2.2.2.2 Влияние обработки биомассы ацетонитрилом на эффективность экстракции 58
2.2.2.3 Оптимизация процедуры экстракции микроцистинов из биомассы с использованием водно-ацетонитрильных смесей 60
2.2.2.4. Количественное определение содержания микроцистинов и анатоксина-а в объектах окружающей среды 64
ГЛАВА 3 Применение разработанной аналитической процедуры для исследования распространенности цианотоксинов в водоемах различных регионов России 67
3.1 Определение изучаемых цианотоксинов в озерах Северо-Западного региона России (на примере озер Сестрорецкий разлив и Нижнее Суздальское) 67
3.2 Определение микроцистинов и анатоксина-а в заливах Балтийского моря
3.2.1 Прибрежная зона восточной части Финского залива Балтийского моря 72
3.2.2 Определение цианотоксинов в воде и биомассе Куршского залива 73
3.3 Определение изучаемых цианотоксинов в Волжских водохранилищах 74
3.3.1 Цианотоксины в Рыбинском, Горьковском и Чебоксарском водохранилищах в период аномально жаркого лета 2010 г 74
3.3.2 Цимлянское водохранилище 74
3.4 Определение нейротоксичных циантометаболитов в водоемах Северо-западного, Центрального региона России и Западной Сибири 77
ГЛАВА 4 Методы компьютерного моделирования для прогнозирования биологической активности цианометаболитов 79
4.1 PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances - взаимосвязь «структура активность») 79
4.2 QSAR («Quantitative Structure – Activity Relationship», «количественное
соотношение структура–активность») 82
ГЛАВА 5 Экспериментальная часть 84
5.1 Примененные методы исследования 84
5.2 Приборы и материалы 84
5.2.1 Оборудование для МАЛДИ-МС анализа 84
5.2.2 Оборудование для ВЭЖХ-МС анализа 85
5.2.3 Оборудование для анализа фитопланктона 87
5.2.4 Реактивы 87
5.3 Параметры хромато-масс-спектрометрического анализа 87
5.3.1 Условия хроматографического разделения 87
5.3.2 Условия получения масс-спектров стандартных соединений сакситоксинов 88
5.3.2.1 Условия получения фрагментных масс-спектров высокого разрешения стандартных соединений сакситоксинов 88
5.3.2.2 Условия проведения тандемного масс-спектрометрического анализа при исследовании нейротоксических «цветений» природных водоемов 89
5.3.3 Получение масс-спектров микроцистинов 90
5.3.3.1 Условия получения масс-спектров высокого разрешения микроцистинов 90
5.3.3.2 Получение фрагментных масс-спектров высокого разрешения для идентификации структурных вариантов и изучения фрагментации микроцистинов. 91
5.3.3.3 Условия одновременного масс-спектрометрического определения анатоксина-а и микроцистинов 91
5.4 Условия получения МАЛДИ-МС спектров 92
5.5 Пробоотбор образцов из природных водоемов 92
5.6 Микроскопический анализ образцов фитопланктона 92
5.7 Иммуноферментный анализ 93
5.8 Пробоподготовка образцов для проведения ВЭЖХ-МС анализа цианотоксинов 93
5.8.1 Пробоподготовка образцов биомассы для проведения ВЭЖХ-МС анализа микроцистинов и анатоксина-а 93
5.8.2 Обработка биомассы ацетонитрилом до целевой экстракции микроцистинов 93
5.8.3 Подготовка образцов биомассы для ВЭЖХ-МС анализа нейротоксинов 94
5.8.4 Пробоподготовка образцов природной воды 94
5.8.5 Амплификация участков генов синтеза цианотоксинов 94 5.9 Методы компьютерного моделирования для прогнозирования биологически
активных свойств соединений 95
Заключение 98
Список сокращений 99
Список литературы
- Масс-спектрометрические методы определения цианотоксинов
- Метод одновременного масс-спектрометрического определения анатоксина-а и микроцистинов
- Определение изучаемых цианотоксинов в Волжских водохранилищах
- Условия получения фрагментных масс-спектров высокого разрешения стандартных соединений сакситоксинов
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Эвтрофирование водоемов способствует массовому развитию («цветению») сине-зеленых водорослей (цианобактерий). Такие «цветения» часто приводят к появлению в воде токсичных метаболитов цианобактерий — цианотоксинов, опасных для здоровья и жизни людей и животных. В настоящее время «цветут» многие водоемы Российской Федерации. В водоемах Северо-западного региона России обнаружено более 20 потенциально-токсических видов цианобактерий. Среди цианотоксинов наиболее опасны сакситоксины (STX, более 50 вариантов структур) в связи с их высокой токсичностью и микроцистины (MCYST, более 80 вариантов структур) из-за высокой стабильности и распространенности. Вследствие значительной разницы в токсичности этих соединений необходимо проводить определение вариантов их структур. В отсутствии полного комплекта стандартных соединений создание аналитической процедуры селективного определения вариантов структур цианотоксинов в водоемах является актуальной проблемой.
Степень ее разработанности. Согласно международному стандарту ISO 20179:2005 (введен в 2005 г) определение MCYST в воде проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектированием, валидированным для количественного определения трех соединений группы MCYST-RR, -YR и -LR. Идентификация других вариантов структур не проводится из-за ограниченного перечня коммерчески доступных стандартов. Поэтому для определения цианотоксинов за рубежом применяют метод хромато-масс-спектрометрии. Однако предлагаемые алгоритмы идентификации не применимы для некоторых типов масс-спектрометрических приборов.
Кроме известных токсических свойств цианометаболиты могут проявлять другие виды биологической активности. Прогноз новых видов фармакологически значимой биологической активности с целью разработки оригинальных фармацевтических компонентов является актуальной задачей в связи с политикой импортозамещения в сфере производства и обращения лекарственных средств.
Цели и задачи: целью является создание оптимизированной аналитической процедуры масс-спектрометрического (МС) определения структурных вариантов циано-токсинов в объектах окружающей среды с использованием более доступных масс-спектрометров низкого разрешения в отсутствие полного набора стандартных соединений.
Задачи: 1) Разработка классификации диагностических ионов для идентификации целевых соединений МС методом. 2) Оптимизация процедуры извлечения цианоток-синов из биомассы. 3) Проведение скрининга токсичных цианометаболитов в водоемах разных регионов России. 4) Прогноз биологической активности цианометаболитов.
Научная новизна: Предложена классификация диагностических ион-продуктов для идентификации структурных вариантов MCYST в отсутствии полного набора стандартных соединений. Показано, что обработка ацетонитрилом сухой лиофи-лизированной биомассы способствует снижению содержания матричных высокомолекулярных соединений в экстрактах. Апротонный диполярный растворитель ацето-нитрил в составе двухкомпонентной водно-органической смеси способствует эффективному извлечению целевых соединений. Получена информация о составе и концентрациях цианометаболитов в акваториях различных регионов России с использованием разработанной процедуры МС анализа. Установлено широкое распространение гепатотоксических цианобактериальных цветений, нейротоксические цветения регистрировались в единичных случаях. Получен прогноз фармакологически значимых свойств некоторых STX и плейотропной биоактивности MCYST.
Теоретическая и практическая значимость рабты: Развитие МС методов изучения цианометаболитов. Предложенная классификация диагностических фрагментов позволяет адаптировать методику МС определения MCYST для любого типа хромато-масс-спектрометров, включая более распространенные приборы низкого разрешения. Предложена процедура селективного извлечения MCYST из биомассы, позволяющая снизить содержание белков в экстрактах.
Проведенные исследования выявили необходимость регулярного мониторинга МСYST в водоемах в связи с установленными случаями превышения безопасного уровня содержания (по рекомендациям ВОЗ) и потенциальной опасностью для населения.
С помощью методов компьютерного моделирования сделан прогноз о возможности проявления противоопухолевой активности неосакситоксина и гониатоксина 2, позволяющий рассматривать их в качестве кандидатов для исследований in vitro, in vivo.
Методология и методы исследования. Для разработки варианта метода определения цианотоксинов в объектах окружающей среды использовали МС методы: высокоэффективная жидкостная хроматография-масс-спектрометрия высокого разрешения (ВЭЖХ-МС ВР), тандемная масс-спектрометрии (МС/МС), масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (МАЛДИ-МС). Теоретические пути фрагментации ионов изучали с использованием программы MassFrontier 5.1. Прогноз биологической активности был получен с использованием методов компьютерного моделирования PASS (PASS Refined 2014) и 3D-QSAR (AutoDock Vina).
Положения, выносимые на защиту
-
Усовершенствованная методика селективного выделения MCYST из биомассы.
-
Метод идентификации структур MCYST на основе их специфической фрагментации.
-
Результаты исследований водоемов различных регионов Российской Федерации.
-
Прогнозируемая фармакологическая активность нейротоксичных цианометаболитов.
Степень достоверности и апробация работы. В работе использованы современные методы хромато-масс-спектрометрии, адекватные поставленным целям и сформулированным задачам. Результаты исследования обработаны в соответствии с установленными требованиями. Соискатель имеет 12 опубликованных статей по теме диссертации и 12 работ в материалах международных конференций.
А- сакситоксины, Б - микроцистины Рисунок 1 - Структура изучаемых соединений
Сакситоксины (STX) - группа нейротоксичных цианометаболитов (более 50 соединений), пуриновые алкалоиды, переменные позиции в четырех положениях могут
Масс-спектрометрические методы определения цианотоксинов
Сине-зеленые водоросли или цианобактерии - древнейшие организмы на Земле, появившиеся 2,15 миллиардов лет назад и способствовавшие образованию атмосферы на планете [1]. Благодаря способности фотосинтезировать, а также связывать азот из атмосферы и окружающей среды, эти организмы относят к растениям, а именно, к сине-зеленым водорослям. Однако, исходя из строения клетки, схожего с бактериальной, наличия в ней рибосом, а также муреиновой клеточной стенки их причисляют к прокариотам, имеющим грамотрицательную характеристику [2]. Цианобактерии характеризуются высокой способностью к адаптации, распространены практически повсеместно, могут находиться во всех экосистемах от наземных до водных сред обитания, в том числе и в экстремальных условиях, таких как горячие источники, гиперсоленые среды и ледники [3-5]. На сегодняшний день установлено, что 46 видов цианобактерий способны продуцировать токсичные метаболиты (цианотоксины) [6], которые представляют опасность для здоровья людей и животных [7].
Известно, что массовому развитию цианобактерий («цветению») способствует эвтрофирование [8-9]. В настоящее время «цветение» цианобактерий становится все более интенсивным и широко распространенным даже в ранее «не цветущих» водоемах. Совместное влияние повышения среднегодовых температур (изменение планетарного климата) и высокой концентрации биогенных веществ в водоемах аддитивно воздействуют на увеличение темпов роста именно токсических видов цианопрокариот [10]. Периоды увеличения биомассы цианобактерий заканчиваются массовым отмиранием клеток и последующим выбросом внутриклеточных токсинов в воду. Цианотоксины - внутриклеточные токсичные метаболиты цианобактерий, выделяющиеся во внешнюю среду в результате «цветения» и последующего лизиса (разрушения) клеточной стенки. Их различают по способу воздействия на живые организмы на несколько групп, из которых для пресноводных водоемов наиболее актуальны нейротоксины (сакситоксины, анатоксины) из-за высокой токсичности и гепатотоксины (микроцистины, MCYST) вследствие их высокой стабильности и распространенности [11].
В организм человека токсины попадают в результате употребления загрязненной воды или морепродуктов, а также при рекреационном использовании «цветущих» природных водоемов [12, 13]. С распространением цианобактериальных «цветений» связывают рост онкологических и кишечных заболевания, аллергических дерматитов. При отравлении цианотоксинами степень поражения в зависимости от полученной дозы может быть от легкой до летальной; симптомы очень разнообразны и могут проявляться в виде гастроэнтеритов, абдоминальных болей, поражений печени и почек, тошноты, рвоты, воспаления горла, аллергических и дерматологических проявлений, судорог, паралича, удушья [7, 14].
Вредоносное «цветение» водорослей признано ООН одной из актуальных проблем современного мира [15]. За рубежом подобные токсические «цветения» водоемов рассматривают в качестве национальной проблемы, созданы специальные центры для их изучения и контроля, разрабатываются различные меры по предотвращению «цветений» и очищению постоянно «цветущих» водоемов [16-22]. В последние десятилетия цианобактериальные «цветения» все чаще регистрируются на территории Российской Федерации, в водоемах обнаружено более 20 потенциально-токсических видов цианобактерий [23-27]. Экстремальные последствия «цветения» возникают в водоемах южных регионов России. Недавним примером этому служит чрезвычайная ситуация, сложившаяся в Цимлянском водохранилище в октябре 2009 г., когда массовые скопления цианобактерий привели к засорению водозаборных сооружений и прекращению подачи воды жителям г. Волгодонска [28]. Регистрируются регулярные случаи массовой гибели рыб в Азовском море [29], Куршской и Вислинской лагунах Балтийского моря [30]. Однако, данные по определению содержания цианотоксинов в водоемах малочисленны и, как правило, носят отрывочный характер.
Таким образом, определение содержания цианобактериальных токсинов в водоемах на территории Российской Федерации является весьма актуальной задачей. Развитие таких исследований представляет исключительную важность, поскольку позволит реально оценить степень опасности «цветения» сине-зеленых водорослей в различных водоемах на территории России.
Сакситоксины, также известные как «паралитические яды моллюсков» (paralytic shellfish toxins, PSTs), являются одними из известных наиболее сильнодействующих природных токсинов. Их также называют «фактором быстрой смерти», поскольку смерть при употреблении летальной дозы наступает в течение 15 мин - 12 часов [31-33]. Благодаря экстремально низкому ЛД50, сакситоксины рассматривали в качестве химического оружия американскими военными [34]. В настоящее время включены в Список 1 (химикаты, представляющие собой высокий риск) «Конвенции о запрещении химического оружия» [33]. Первоначально считалось, что продуцентами этих токсинов являются только морские динофитовые водоросли родов Alexandrium, Gymnodinium and Pyrodinium [35], «цветение» которых приводит к массовым заморам рыбы, отравлениям диких животных и домашнего скота [14]. В настоящее время установлено, что некоторые роды пресноводных сине-зеленых водорослей - Aphanizomenon, Dolichospermum, Cylindrospermopsis, Lyngbya, Scytonema, Planktothrix и Raphidiopsis - также могут синтезировать сакситоксины [14, 32, 35]. В связи со способностью аккумулироваться в водных организмах (например, в моллюсках Gonyaulax) [36], сакситоксины могут являться причиной случаев массовых отравлений при употреблении в пищу зараженных морепродуктов и воды [35, 37-40].
Сакситоксины - группа нейротоксичных цианометаболитов, включающая более 57 соединений, относящихся к триалкил тетрагидро-пуринам, переменные позиции в четырех положениях, обозначенных на рисунке 1.1, могут содержать гидроксилы, карбоксилаты или сульфаты. Варианты расположения заместителей представлены в таблице 1.1 [14, 35]. Рисунок 1.1 - Общая структура соединений группы сакситоксинов Традиционно сакситоксины подразделяют на три основные группы: карбаматные (сакситоксин, неосакситоксин и гониатоксины 1-4 (GTX 1-4)), сульфокарбамоильные (В 1-2, С 1-4) и декарбамоильные (dcSTX, dc-neoSTX, and dc-GTX1-4). Эти группы отличаются по токсичности: карбаматные - наиболее токсичны, карбамоильные - менее токсичны, сульфокарбамоильные в десятки раз менее токсичны согласно данным токсикологических исследований на мышах при внутрибрюшинном введении [14, 35].
Метод одновременного масс-спектрометрического определения анатоксина-а и микроцистинов
Физико-химические свойства STX, AN, и MCYST значительно различаются, поэтому для их хроматографического разделения использовали разные типы колонок и составы подвижной фазы.
Поскольку STX гидрофильны, разделение смеси структурных вариантов проводили с использованием хроматографии гидрофильных взаимодействий (колонка TSK Amide Gel-80, Tosoh BioScience Corporation) в изократическом режиме. В качестве подвижной фазы использовали смесь вода/ацетонитрил с формиатным буфером (4mM, рН 3,5) в качестве модификатора. В выбранных условиях было отмечено, что сульфосодержащие структурные варианты сакситоксинов (GTX) удерживались на колонке слабее, чем структуры без сульфатной группы (STX и NEO) (рисунок 2.1).
Масс-хроматограмма по выделенному току смеси 6 структурных вариантов карбаматных сакситоксинов (GTX 1-4, STX и NEO) Для хроматографического разделения смеси MCYST и AN на обращенно-фазовой колонке оптимальной является модифицирующая добавка трифторуксусной кислоты (ТФУ) [130]. Однако при проведении масс-спектрометрического анализа ТФУ может вызывать подавление ионизации, в связи с этим в качестве добавки в подвижную фазу применяли муравьиную кислоту, которая не оказывает влияния на ионизацию [232]. В данной работе хроматографическое разделение смеси AN и 9 стандартных соединений MCYST проводили с использованием обращенно-фазовой колонки (Thermo Hypersil Gold 100x3 mm, 3mkm) и градиентного режима с увеличением органического компонента подвижной фазы вода-ацетонитрил, содержащей 0,05 % муравьиной кислоты [233].
Элюирование AN осуществлялось при начальных условиях в изократическом режиме при 5 % органического компонента первые 10 минут хроматографирования. Время удерживания AN составляло 3,6 минут, рисунок 2.2 (А).
Далее при нарастании органической компоненты последовательно элюировались MCYST. Можно было выделить две группы соединений, различающихся по времени удерживания: аргинин-содержащие (элюирующиеся при 60-65% ацетонитрила в подвижной фазе), представленные на рисунке 2.2 (Б), и аргинин-несодержащие (элюирующиеся в области большего содержания органической компоненты), изображенные на рисунке 2.2 (В).
Масс-хроматограммы по выделенному току для смеси AN (А) и 9 стандартных соединений МСYST: аргинин-содержащих (Б) и аргинин-несодержащих (В) Полученные результаты хроматографического разделения указывают на возможность проведения одновременного анализа AN и MCYST методом ВЭЖХ-МС с использованием обращенно-фазовой колонки. Разделение сакситоксинов осуществляли с использованием хроматографии гидрофильных взаимодействий. 2.1.2 Масс-спектрометрическое детектирование Чаще всего рутинный анализ цианотоксинов проводят с использованием более доступных масс-спектрометров низкого разрешения, некоторые из них (например, тройные квадруполи) могут обеспечивать большую чувствительность в режиме МЗР [211]. Для эффективной реализации МЗР-режима детектирования при использовании масс-спектрометров низкого разрешения необходима информация о диагностических ионах, которую можно получить с использованием тандемной масс-спектрометрии высокого разрешения.
Исследования проводили с использованием растворов стандартных соединений STX, AN и MCYST с применением масс-спектрометров высокого разрешения LCMS-ITOF (Shimadzu) и LTQ Orbitrap (Thermo). Характер фрагментных спектров, получаемых методом ВЭЖХ-МС/МС, значительно зависит от применяемого оборудования, режимов фрагментации и МС параметров проводимого анализа, которые отличаются для приборов разных типов. Так, применяемый в данной работе масс-спектрометр LTQ Orbitrap позволяет фрагментные спектры при нескольких режимах фрагментации.
Фрагментация с использованием ДИС–режима (“collision induced dissociation” -«диссоциация, индуцируемая соударениями») в настоящее время является наиболее широко используемой в тандемной масс-спектрометрии. В этом случае ионная диссоциация протонированных молекул происходит в линейной ионной ловушке благодаря столкновению с молекулами инертного газа. Механизм данной фрагментации не позволяет удерживать в ловушке массы фрагментов менее 28 % от массы иона-прекурсора (интервал отсечения масс – сut off), это явление получило название «правила 1/3». При увеличении энергии столкновений меняется соотношение интенсивностей ион-продуктов (фрагментарных ионов) с нарастанием доли фрагментов малых масс (m/z). Как правило, величина энергии столкновений 25 %-35 % является достаточной для получения представительного тандемного спектра [234]. Этот метод является эффективным для фрагментации «малых» молекул, где интервал отсечения масс является неинформативным.
HCD-фрагментация (“high-energy collisional dissociation” - «высокоэнергетичная камера соударения») является альтернативным методом разбиения, при котором ион-продукты образуются в результате многоступенчатого процесса активации. Это способствует детектированию низких m/z продукт-ионов (позволяет «обойти» правило 1/3). Величина энергии HCD значительно влияет на получаемый «рисунок» тандемного спектра (m/z ион-продуктов) в зависимости от структуры вещества. «Рисунок» тандемных спектров, полученных в HCD-режиме при больших значениях энергии, напоминает вид спектров фрагментации электронным ударом в газовой хроматографии-масс-спектрометрии [234]. 2.1.2.1. Масс-спектрометрическое детектирование соединений группы сакситоксинов
Особые затруднения могут возникать при идентификации аналитов с низкими массами, МС/МС-спектр которых может не содержать достаточного количества интенсивных характеристических фрагментов, то есть являться непредставительным. Нами были получены фрагментные спектры GTX 1-4, NEO, сакситоксина, представленные на рисунках 2.3 и 2.4.
Молекулы STX являются молекулами малой массы. Получаемые в режиме ДИС фрагментные спектры содержат небольшое количество диагностических ионов. Фрагментация ионов-прекурсоров GTX, в основном, происходит за счет потери молекул аммиака, воды, карбамоильной или сульфогруппы, рисунок 2.3. Варьирование энергии фрагментации в режиме ДИС не приводило к появлению других характеристических ион-продуктов для GTX.
Наиболее представительный фрагментный спектр был получен для STX ( представлен на рисунке 2.4 (А)) в ДИС-режиме при энергии 25%, диагностическими ион-продуктами являлись [M+H+-NH3-OCNH-H2O-H2O] и [M+H+-NH3-OCNH-H2O], рисунок 2.4 (Б) [235].
Определение изучаемых цианотоксинов в Волжских водохранилищах
Поскольку цианотоксины являются минорными компонентами в составе сложных природных смесей, главной задачей пробоподготовки являются извлечение и концентрирование целевых компонентов, а также снижение влияния матрицы [241]. Твердофазная экстракция на обращенно-фазвовом сорбенте является наиболее широко используемым методом при пробоподготовке для масс-спектрометрического анализа цианотоксинов из природной воды [162, 189, 223, 224].
Извлечение изучаемых цианотоксинов проводили с применением коммерчески доступных патронов Oasis HLB (Waters), которые благодаря развитой гидрофильно-липофильной поверхности сорбента способны удерживать широкий диапазон полярных соединений [189, 233, 242].
С учетом ранее достигнутых высоких степеней извлечения для различных вариантов MCYST при использовании ТФЭ картриджей Oasis HLB (85 %-95 %, среднеквадратичное отклонение 4 %-6 % по результатам 5 повторов), с его применением была изучена одновременная экстракция MCYST и AN. Оценка выбранного метода ТФЭ проводилась с помощью модельных систем: в воду, не содержащую токсинов, добавляли AN и MCYST-LR, -RR по 100 нг каждого из соединений, затем проводили экстракцию в условиях, использованных для извлечения MCYST [222-224]. Эффективность экстракции MCYST и АN при ТФЭ оценивали в дистиллированной воде, а также в образцах природной воды из двух озер СевероЗападного региона России - Сестрорецкого разлива, поскольку при экстракции природных образцов, степень извлечения целевых соединений зависит не только от типа используемого сорбента, но и от влияния матрицы образца [232]. Степень извлечения для AN из дистиллированной воды составляла 62 %± 4 % (по результатам 5 опытов). Влияние матричных соединений в модельной системе с использованием природной воды приводило к повышению интенсивности сигнала ионов микроцистинов, поэтому степень извлечения оказалась выше по сравнению с модельной системой на основе дистиллированной воды. Степень извлечения AN при экстракции из природной воды была близка с полученной при экстракции из дистиллированной воды.
Существующие процедуры пробоподготовки для определения внутриклеточных цианотоксинов, содержащихся в биомассе основаны на разрушении клеточных стенок цианобактерий с последующей ультразвуковой экстракцией при использовании водно-спиртовых смесей в различном соотношении [130]. При этом оценка присутствия белковых матричных соединений в экстрактах обычно не проводится. Одним из способов очистки экстракта при анализе ряда биологических матриц является процедура осаждения белков [226]. Эффективным осаждающим агентом является ацетонитрил [227].
Влияние предварительной обработки ацетонитрилом на переход в экстракты белков и наличие в них MCYST оценивали методом МАЛДИ-МС. Для этого четыре навески одного образца биомассы на первой стадии обработали различными составами: серия А -ацетонитрилом, Б - 5 % муравьиной кислотой [161]; серия В - деионизованной водой [149]; серия Г - 20 мкл воды (инкубирование) с последующей обработкой 75 % водным метанолом [182]. Для извлечения MCYST, оставшихся в биомассе после первой обработки, проводили экстракцию 75 % водным метанолом. На основании литературных данных, сообщающих о малом (около 5 %) содержании аналитов в экстракте третьей обработки [182], экстракцию MCYST из биомассы проводили двукратно.
Для оценки присутствия белковых соединений был проведен МАЛДИ-МС анализ в диапазоне m/z 4000 - 15000. Анализ МАЛДИ-спектров, представленных на рисунке 2.13, показал, что соединения с молекулярной массой выше 4000 Да присутствуют во всех экстрактах, в которых экстрагенты содержали воду, рисунок 2.13 (Б-Г). Причем наибольшее количество соединений с высокими массами переходит в образец при обработке биомассы водным 5 % раствором муравьиной кислоты, рисунок 2.13 (Б1). Кроме того, белковые соединений присутствуют и в масс-спектрах экстрактов второй обработки в сериях Б и В, рисунки 2.13 (Б2, В2). В то же время, в серии А, как во время первой, так и во время второй экстракции, МАЛДИ-спектры которых представлены на рисунках 2.13 (А1, А2), соответственно, перехода в образец таких матричных соединений не наблюдается [243, 244]. Экстракты, полученные при обработке навесок биомассы следующими экстрагирующими составами: А1 –ацетонитрил; A2 - 75 % метанол (двукратная обработка); Б1 –5 % водная муравьиная кислота; Б2 -75 % метанол; В1 – вода; В2 - 75 % метанол; Г1 - инкубирование навески в 20 мкл воды с последующей обработкой 75 % метанолом; Г2 -75 % метанол. Рисунок 2.13 – МАЛДИ-масс-спектры в диапазоне сканирования m/z 4000-15000 для экстрактов пробы биомассы Данные МАЛДИ-масс-спектров в диапазоне m/z 950-1100 характерном для MCYST, представленные на рисунке 2.14, подтвердили, присутствие MCYST во всех экстрактах. Однако интенсивность сигналов, соответствующих MCYST в масс-спектре экстракта ацетонитрилом минимальна, пики лишь незначительно превышают уровень химического шума, что видно на рисунке 2.14 (А1). Для подтверждения присутствия в полученных экстрактах микроцистинов был проведен МАЛДИ-МС/МС анализ для соответствующих ионов-прекурсоров. Идентификация MCYST в МС/МС-спектрах осуществлялась по наличию фрагмента Adda-кислоты (m/z 135). Результаты тандемного анализа показали, что MCYST содержатся во всех экстрактах, кроме полученного путем обработки биомассы ацетонитрилом (данные не представлены).
Условия получения фрагментных масс-спектров высокого разрешения стандартных соединений сакситоксинов
Фрагментные спектры с использованием хромато-масс-спектрометра высокого разрешения LCMS-ITOF получали в ионной ловушке с использованием ДИС-режима, энергия столкновений 50%, энергия газа соударений 5 %-50 %, q (Frequency) = 0,169 для возможности детектирования фрагментов с низкими величинами m/z. Условия получения фрагментных спектров с использованием хромато-масс-спектрометра высокого разрешения LTQ Orbitrap: HCD (орбитальная ловушка) или ДИС (ионная ловушка). В обоих случаях при изучении фрагментации варьировали энергию столкновений в диапазоне 5 %-45 %, детектирование ион-продуктов выполняли в орбитальной ловушке.
Масс-хроматограмма была разделена на 2 сегмента. Сканируемый диапазон масс (полный ионный ток) (m/z) в первом сегменте составлял 100 – 450, во втором - 500 - 550 и 800 -1100. Температура ионного источника 320 С; поток газа - носителя (азот) 25 arb, напряжение на конусе 3,2 кВ. Фрагментацию проводили в ДИС-режиме с использованием линейной квадрупольной ловушки. Величина энергии фрагментации и напряжение на линзах варьировались для различных аналитов и составляли 35 % и 20 В - для анатоксина-а, 25 % и 35 В - для аргинин-содержащих микроцистинов, 35 % и 45 В - для аргинин-несодержащих.
Масс-спектры записывали в двух режимах: сканирование полных МС и МС/МС -спектров и MRM по 2 выбранным переходам (переход с образованием наиболее интенсивного ион-продукта выбирали в качестве количественного перехода, а второй по интенсивности ион-продукт применяли для подтверждающего перехода).
Для оценки изменения чувствительности прибора в течение дня и в течение нескольких дней к каждому раствору или экстракту добавляли одинаковое количество внешнего стандарта. Градуировочные зависимости, построенные для стандартных растворов анатоксина-а и микроцистинов были линейными (R2 = 0,985 - 0,998) в диапазоне концентраций от 0,25 до 10 нг на ввод. Величина относительного стандартного отклонения (RSD) 12% (N=10). 5.4 Условия получения МАЛДИ-спектров
Условия получения спектров следующие: режим детектирования положительных ионов с использованием рефлектрона при следующих настройках ионного источника: напряжение 20 кВ, напряжение на линзах (lens) 6,5 кВ, напряжение на рефлектроне (Ref) 24,38 кВ. Ионы детектировали для анализа микроцистинов в диапазоне m/z от 950 до 3000 (в режиме рефлектрона), для оценки высокомолекулярных примесей - m/z 3500-15000 (линейный режим). Масс-спектры регистрировали при помощи программы MALDI-MS Shimadzu Biotech
Из водоемов с отсутствием видимого цветения, поверхностные пробы воды (1 л) были собраны с помощью пластиковых бутылок. В лаборатории образцы фильтровали через Whatman GF/С фильтров. Фильтры с биомассой немедленно замораживали при –20 С до экстракции. Позже фильтры с биомассой были использованы для выделения ДНК и экстракции для анализа цианотоксинов методом ВЭЖХ-МС.
Для микроскопического исследования, пробы поверхностной воды (объем 1 л) фиксировали кислым раствором Люголя в модификации Усачева с дальнейшей дофиксацией 40 % формалином [270]. В водоемах с видимыми признаками цветения пробы биомассы фитопланктона отбирали с помощью фитопланктонной сетки или простым зачерпыванием с поверхности, отжимали и немедленно замораживали при –20 С до экстракции.
При проведении комплексных исследований природных водоемов территории России анализ образцов фитопланктона водоемов различных регионов России проводили согласно стандартной методике [270]. Зафиксированную кислотным раствором Люголя пробу воды концентрировали осадочным методом. Количественный и качественный анализ осуществлялся с использованием микроскопа (Микромед-3, LOMO, Санкт-Петербург, Россия). Подсчет численности водорослей производили в камере Учинская (0,01 мл). Биомассу определяли расчетным общепринятым способом, объем водорослей – методом геометрического подобия [270].
Скрининг цианотоксинов (микроцистинов, сакситоксинов и анатоксина-а) осуществлялся в водных экстрактах из сконцентрированного на фильтрах фитопланктона с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), используя соответствующие тест-системы ELISA («Abraxis LLS», США), согласно инструкциям фирмы-производителя. Процедура экстрагирования цианотоксинов из клеток микроводорослей включала добавление к фильтру дистиллированной воды, цикл замораживания и размораживания фильтра с последующей ультразвуковой обработкой.
Образцы из природных водоемов фильтровали для отделения биомассы, содержащей внутриклеточные токсины, затем биомассу лиофильно высушивали.
Навески лиофилизированной биомассы (примерно 20-40 мг) последовательно обрабатывали равными порциями (1 мл) различных комплексных смесей в определенной последовательности в ультразвуковой бане 15 минут (FinnSonic m03, Lahti, Finland). Полученный экстракт центрифугировали (центрифуга CM-50, компания ELMI; 14 тыс. об/мин, 10 мин), в аликвоты экстрактов добавляли аналитический стандарт, затем анализировали методами ВЭЖХ/МС и МАЛДИ-МС.