Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Структурные основы катализа под действием LOX 12
1.1. Липоксигеназы млекопитающих представляют собой единую полипептидную цепь, которая организована в виде двухдоменной структуры; в низших организмах встречаются гибридные белки 14
1.2. Малый N-терминальный домен LOX является важным структурным элементом, отвечающим за мембранное связывание и каталитическую активность 17
1.3. С-Терминальный домен LOX содержит субстрат-связывающий карман и каталитически активное негемовое железо 18
1.4. Междоменная подвижность как источник структурной гибкости LOX 20
1.5. Связывание лиганда с активным центром 12/15-LOX кролика приводит к конформационным изменениям белковой матрицы 20
1.6. Субстрат-связывающий карман LOX является гидрофобной полостью с выходом на поверхность белка 22
1.7. Молекулярный кислород проникает в активный центр LOX посредством строго контролируемых механизмов 26
1.8. Первичная структура LOX играет ключевую роль в реакционной специфичности окисления жирных кислот 27
1.9. Антароповерхностный характер и стереоконтроль липоксигеназной реакции 28
1.10. Геометрия трех ключевых аминокислот определяет позиционную специфичность 12/15-липоксигеназ (концепция триады) 31
1.11. Реакционная специфичность 15LOX2 человека и ее ортолога (8S-LOX мыши) не может быть объяснена концепцией триады 33
1.12. Реакционная специфичность изоформ LOX зависит от экспериментальных условий 34
1.13. Суицидальная инактивация LOX 34
1.14. Аллостерический характер LOX 37
1.15. Структура LOX в растворе 38 Глава 2. Эволюция LOX 40
2.1. Гены, кодирующие последовательность липоксигеназ, обнаружены в эукариотах и бактериях, но не найдены в археях 40
2.2. Существует ли общий прототип LOX? 42
2.3. Биологическая роль изоформ LOX 43
Глава 3. Будущее и перспективы развития исследований в области структурной биологии LOX 44
Глава 4. Химический синтез зондов активного центра липоксигеназ 47
4.1. Полный химический синтез терминальных и субтерминальных замещенных производных арахидоновой кислоты 47
4.1.1. Синтез региоизомерных по положению гидроксигруппы терминальных ацетиленов 48
4.1.2. Синтез ю-4/ю-З замещенных оптически активных производных арахидоновой кислоты 50
4.1.3. Синтез терминальных и ш-1/ш-2 субтерминальных замещенных производных арахидоновой кислоты 54
4.2. Синтез зондов активного центра на основе ингибиторов г12/15-1 ОХ 55
Глава 5. Изучение взаимодействия г12/15-1 ОХ с лигандом 62
5.1. Исследования r12/15-LOX с использованием аналогов их природных субстратов 62
5.1.1. Введение фотоаффинной метки в г12/15-LOX 62
5.1.2. Энантиоселективное окисление ґІ2/15-І ОХ региоизомеров ПНЖК гидроксилированных в субтерминальной части молекулы 66
5.2. Исследования r12/15-LOX с использованием ингибиторов липоксигеназного окисления 69
Глава 6. Роль кислорода в реакциях с участием липоксигеназ 72
6.1. Бифазный характер скорости окисления 19-НЕТЕ под действием ҐІ2/15-LOX 72
6.2. Кинетическое моделирование и оценка кинетических параметров 74
6.3. Расчетная модель механизма транспорта кислорода в 12/15-LOX на основе симуляции молекулярной динамики и метода неявного лиганда 77
Глава 7. Изучение пространственной структуры r12/15-LOX в растворе 83
7.1. Вклад контактов между N-терминальным и каталитическим доменами г12/15-1 ОХ в стабильность вторичной и третичной структур белка 83
7.1.1. Анализ взаимодействия N-концевого и каталитического доменов 83
7.1.2. Функциональная роль Туг98 N-терминального домена 85
7.1.3. Структурные изменения фермента при мутациях Туг98 и Туг614 85
7.1.4. Роль N-концевого домена в стабилизации подвижной а2 спирали 89
7.1.5. Анализ третичной структуры и динамики конформационных изменений г12/15-1 ОХ дикого типа и мутантов 90
7.1.6. Вклад Arg403 в стабильность структуры М2/15-LOX 93
7.1.7. Функциональная роль Arg403 в структуре r12/15-LOX 96
7.2. Исследование межмолекулярных контактов г12/15-1 ОХ в растворе 103
7.2.1. Термодинамическая устойчивость димеров липоксигеназы 103
7.2.2. Влияние внешнего окружения на структуру г12/15-1 ОХ в растворе 104
7.2.3. Влияние лиганда на структуру и структурную подвижность г12/15 LOX 106
7.2.4. Исследования интерфейса в димере г12/15-1 ОХ с применением метода малоуглового рассеивания рентгеновских лучей и направленного мутагенеза 109
7.2.5. Изучение устойчивости димеров фермент-субстратного комплекса г12/15-1 ОХ и мутантов с использованием методов молекулярной динамики 113
7.2.6. Влияние межмолекулярных контактов в димерном интерфейсе белка на ферментативные свойствам 2/15-LOX 116
7.2.7. Роль аминокилотных остатков х18 спирали в конформационных переходах r12/15-LOX
Заключение 121
Выводы 123
Экспериментальные статьи 193
Тезисы докладов на научных конференциях 196
Список цитируемой литературы 199
- С-Терминальный домен LOX содержит субстрат-связывающий карман и каталитически активное негемовое железо
- Молекулярный кислород проникает в активный центр LOX посредством строго контролируемых механизмов
- Синтез региоизомерных по положению гидроксигруппы терминальных ацетиленов
- Анализ третичной структуры и динамики конформационных изменений г12/15-1 ОХ дикого типа и мутантов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Липоксигеназы млекопитающих (LOX) – негемовые
железосодержащие ферменты – непосредственно связаны с регуляцией
физиологических процессов и липидного гомеостаза живой клетки. Они селективно
окисляют полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) с образованием серии
биологически активных соединений – оксилипинов, являющихся как эффекторами
активации сигналов биологического ответа на то или иное событие, происходящее на
внутриклеточном уровне, так и межклеточными вторичными мессенджерами,
действующими посредством сигналов трансдукции. Расшифровка генома человека
показала наличие шести функциональных генов, кодирующих структуры различных
липоксигеназных изоферментов, которые отличаются по своим структурным и
функциональным свойствам. 5-LOX вовлечена в биосинтез лейкотриенов и, тем самым,
играет важную роль в патогенезе воспалительных и аутоиммунных заболеваний. Другие
изоферменты, такие как 12- и 15-LOX, и их продукты принимают участие в процессах
возникновения и развития атеросклероза, дифференциации клеток и их
метастазирования, а так же воспаления жировой ткани и возникновения резистентности к
инсулину. Ключевая роль липоксигеназ в патогенезе воспалительных и
гиперпролиферативных заболеваний сделала их потенциальной мишенью при лечении
ряда заболеваний. На протяжении последних 20 лет были предприняты многочисленные
попытки создания препаратов на основе ингибиторов биосинтеза оксилипинов. Так,
ингибиторы 5-LOX и ряд антагонистов рецепторов лейкотриенов в настоящее время
получили допуск к медицинскому применению в качестве «анти-астматиков». Что
касается группы ингибиторов изоферментов 12- и 15-LOX млекопитающих, то ни один из
препаратов, предложенных на их основе, не прошел клинических испытаний вследствие
их низкой специфичности и ряда побочных эффектов. Таким образом, хотя биологическая
роль большинства изоформ 12/15-LOX млекопитающих достаточно хорошо изучена,
многолетние усилия в области структурно-функциональных исследований этой группы
ферментов до настоящего времени не увенчались полноценным успехом.
Необъясненными остались аллостерические свойства 12/15-LOX, которые
предусматривают наличие альтернативных механизмов активации фермента лигандом, не укладывающихся в рамки общепринятой модели единственного субстрат-связывающего центра фермента. Главной причиной подобных неудач может служить тот
1Список сокращений, использованных в автореферате: LOX – липоксигеназа, ПНЖК –
полиненасыщенные жирные кислоты, АК – арахидоновая кислота, Ме-АК – метиловый эфир
арахидоновой кислоты, ЛК – линолевая кислота, ЕТЕ – (5Z,8Z,11Z,14Z)-эйкоза-5,8,11,14-
тетраеновая кислота, НЕТЕ – (5Z,8Z,11Z,14Z)-гидрокси-эйкоза-5,8,11,14-тетраеновая кислота,
13(S)-H(p)ODE – (13S,9Z,12Z)-13-гидро(перо)ксиоктадека-9,12-диеновая кислота, 15(S)-H(p)ЕТE–
(15S,5Z,8Z,11Z,13Е)-15-гидро(перо)ксиэйкоза-5,8,11,13-тетраеновая кислота, HMPA –
гексаметилтриамид фосфорной кислоты, BODTCM – метилоый эфир 2-бензилиден-3-оксо-2,3-дигидробензо[b]тиофен-7-карбоновой кислоты, pss – фотостационарная смесь, КД – круговой дихроизм, МРР – малоугловое рентгеновское рассеяние, PDB – банк данных 3-D структур белков и нуклеиновых кислот; GdnHCl – гуанидин гидрохлорид
факт, что большинство гипотез и стратегий в области исследований 12/15-LOX основывались на данных статической кристаллической структуры комплекса 15-LOX кролика (r12/15-LOX) с лигандом активного центра (PDB: 2P0M), не уделяя при этом должного внимания динамике внутри- и межмолекулярной организации фермента в физиологической среде.
Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в создании концептуально новой структурно-кинетической модели, в основу которой положен динамический характер взаимодействия этого фермента, как с субстратом ПНЖК, так и со вторым «неявным лигандом» - кислородом - в условиях конформационной подвижности белковой матрицы как ключевого элемента, определяющего взаимосвязь структура-функция. В качестве объекта исследования была выбрана 12/15-LOX кролика (r12/15-LOX), фермент, который по своим структурно-каталитическим свойствам наиболее близок к 12/15-LOX человека (h12/15-LOX). Для достижения поставленной цели, в первую очередь, было необходимо охарактеризовать структурные элементы белка, вступающие в непосредственное взаимодействие с субстратом в физиологической среде. Для этого, на начальном этапе исследований предстояло предложить дизайн и разработать синтез зондов активного центра фермента, наиболее близко отражающих структуру природных субстратов/лигандов LOX и способных вступать в ковалентное связывание с ферментом, а также оптимизировать технологию введения метки в молекулу r12/15-LOX. После этого предстояло более детально изучить роль второго липоксигеназного субстрата, молекулярного кислорода, в ферментативной реакции r12/15-LOX и механизмы его транспорта в активный центр фермента. Обобщающим звеном в рамках поставленных задач явились исследования в области внутри- и межмолекулярной организации r12/15-LOX в водном растворе, в том числе, в присутствии лиганда.
Научная новизна:
Предложен дизайн и разработана стратегия полного химического синтеза зондов активного центра LOX на основе новых региоизомерных аналогов арахидоновой кислоты, содержащих азидогруппу в качестве фотоаффинной метки.
С использованием полученных соединений изучены механизмы взаимодействия в ряду фермент–субстрат и впервые показана возможность непосредственного участия кислорода в процессах активации r12/15-LOX. На основе компьютерного моделирования молекулярной динамики с участием малых молекул создана экспериментально подтвержденная модель, описывающая механизмы транспорта кислорода в белковой матрице r12/15-LOX.
Впервые с применением комбинированной стратегии направленного мутагенеза, малоуглового рентгеновского рассеяния (МРР), кругового дихроизма и динамической флуоресценции проведено детальное изучение внутри- и межмолекулярной организации r12/15-LOX в растворе.
Впервые показана возможность динамического равновесия мономер-димер между молекулами r12/15-LOX, а также образования переходного димерного комплекса этого
фермента в присутствии лиганда в растворе. Полученные данные позволяют предположить, что в переходном димере r12/15-LOX обе молекулы фермента могут работать совместно, контролируя и координируя процессы связывания с субстратом и диссоциации продукта.
Практическая значимость
- Полученные результаты являются основой для формирования стратегии поиска
новых потенциальных антиатеросклеротических и противовоспалительных
лекарственных препаратов.
Предложенная междисциплинарная платформа может быть применена при изучении организации и функционирования биологических макромолекул в растворе.
Разработанные теоретические подходы для оценки энергии распределения и динамики диффузии кислорода могут быть использованы для изучения распределения других малых гидрофобных молекул, таких как NO, CO, CO2 в структуре макромолекул.
- Разработанная стратегия синтеза природных (ш/ш-4)-гидроксилированных
производных арахидоновой кислоты через ацетиленовые предшественники
обеспечивает возможность выхода к целому ряду новых перспективных, в том числе
меченых тритием соединений, и возможности реализации комбинаторного подхода
при их получении.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Изучение механизмов взаимодействия r12/15-LOX с лигандом активного центра фермента. Разработка новых подходов и стратегий в синтезе зондов активного центра фермента LOX наиболее близко отражающих структуру природного субстрата.
-
Изучение механизмов транспорта второго «неявного лиганда» - кислорода и его роль в ферментативной реакции r12/15-LOX.
-
Изучение структуры r12/15-LOX в растворе.
Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль на всех этапах исследования от теоретического обоснования гипотез и постановки задачи, организации и планировании проведения ключевых экспериментов до обсуждения и оформления полученных результатов. Кроме того, автором непосредственно выполнено подавляющее количество синтетических, молекулярно-биологических, биохимических и аналитических работ.
Апробация работы. Материалы, включенные в диссертацию, докладывались более чем на 40 всероссийских и международных симпозиумах и конференциях, в том числе на III съезде Биохимического Общества (Санкт-Петербург, 2002); International symposium on recent biomedical advances in eicosanoid research (Берлин, ФРГ, 2002); XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003); 8th International conference on eicosanoids and other bioactive lipids in cancer, inflammation and related diseases» (Чикаго, США, 2003); International prestigious research meeting Центрального
технологического университета (Блюмфонтейн, ЮАР, 2006); на ежегодном симпозиуме Европейского консорциума в области исследований эйкозаноидов Annual EICOSANOX meeting 2007 (Айген, Австрия); 10th International conference on bioactive lipids in cancer, inflammation and related diseases (Монреаль, Канада, 2007); на итоговом симпозиуме Европейского консорциума в области исследований эйкозаноидов EICOSANOX Meeting 2009 в Каролинском институте (Стокгольм, Швеция), на конференциях XVII Lipid meeting (Лейпциг, Германия, 2011) и 14th International conference on bioactive lipids in cancer, inflammation and related diseases (Будапешт, Венгрия, 2015).
Публикации. Основные результаты исследований, полученные при выполнении диссертации, изложены в 4 обзорах, 22 оригинальных статьях в рецензируемых журналах из списка ВАК и ряде тезисов докладов российских и международных конференций.
Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры ХТ
БАС при поддержке Федерального агентства по науке и инновациям, проект № МК-
2503.2003.03 «Разработка новых подходов получения ациклических производных
арахидоновой кислоты с целью изучения механизмов транспорта кислорода в активный
центр липоксигеназ млекопитающих» (Грант Президента РФ для молодых кандидатов
наук); по проекту РФФИ № 04-03-3245 «Новый подход к синтезу гидроксилированных
полиненасыщенных жирных кислот на основе асимметричных ахиральных
предшественников»; по проекту Марии Кюри № MIF1-CT-2006-021230 «Молекулярная энзимология ферментов каскада арахидоновой кислоты: от исследований механизма ферментативных реакций к разработке лекарственных препаратов» (программа «Incoming International Fellowships»); а также при поддержке исследовательской стипендии немецкого фонда Александра фон Гумбольдта № RUS-1111557 «Молекулярная энзимологии липоксигеназ».
Объем диссертации и ее структура. Диссертационная работа изложена на 235 страницах, содержит 8 схем, 21 таблицу, 51 рисунок. Она состоит из введения, литературного обзора, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (319 ссылок на литературные источники).
С-Терминальный домен LOX содержит субстрат-связывающий карман и каталитически активное негемовое железо
Малый N-терминальный домен LOX является важным структурным элементом, отвечающим за мембранное связывание и каталитическую активность. N-Терминальный (-складчатый) домен всех LOX, для которых получены кристаллические структуры, в основном состоит из антипараллельных -складок и напоминает структуру С2-домена липазы поджелудочной железы [74]. У LOX1 сои -складчатый домен содержит первые 146 остатков АКП белка. В случае r12/15-LOX и 8R-LOX кораллов -складчатые домены образованы первыми 110 и 114 аминокислотными остатками, соответственно. N- и С-концевые домены ковалентно связаны неупорядоченным олигопептидом. Хотя -складчатые домены изоформ LOX сои превышают по размеру таковые ферментов млекопитающих, их общие структуры обладают высокой степенью схожести (рис. 1). N-Терминальный домен r12/15-LOX кролика образует с С-концевым доменом поверхностный контакт общей площадью 1600 2 [31]. У LOX1 сои эта поверхность существенно больше по размерам (2600 2), что предполагает наличие более сильного междоменного взаимодействия в случае растительной LOX. Высокая степень сохранения двухдоменной структуры липоксигеназ свидетельствует о функциональной роли N-терминального р-складчатого домена. Ограниченный протеолиз LOX1 сои приводит к образованию усеченного варианта LOX, в котором отсутствует N-терминальная часть [75]. Эта «мини-LOX» каталитически активна, при этом обладает пониженным сродством к линолевой кислоте (КМ -24,2 мкМ для «мини-LOX» против 11,2 мкМ для нативной LOX) и проявляет более высокую активность (Vmax 363 с"1 для «мини-LOX» против 55 с"1 для нативного фермента). Эти данные говорят о том, что общая каталитическая эффективность «мини-LOX» (feaf/Км) повышается в результате протеолиза. Более того, усечение N-терминальной части приводит к структурным изменениям в области субстрат-связывающей полости, так как в отличие от нативного фермента негемовое железо «мини-LOX» может быть обратимо удалено из активного центра [76]. К сожалению, для «мини-LOX» данные о кристаллической структуре отсутствуют, что делает анализ структурных изменений, вызванных усечением N-терминальной части, невозможным. Усечение N-терминального -складчатого домена M2/15-LOX кролика генно-инженерными методами [77], напротив, приводит к понижению эффективности катализа (1,43 против 0,14 мкМ/с). Интересно отметить, что усеченный мутант подвергается более быстрой суицидальной инактивации в процессе окисления АК. Эти данные свидетельствуют о том, что N-терминальный р-складчатый домен может играть роль в регулировании каталитической функции фермента [77]. Обладая структурной схожестью с -складчатым доменом липазы человека [31, 78], N-терминальный домен LOX растений и млекопитающих также участвует в процессах ассоциации LOX с липидными мембранами [79, 80]. Действительно, как направленный мутагенез поверхностных остатков триптофана N-терминального домена 8R-LOX коралла и 5-LOX [59, 81], так и усечение р-складчатого домена г12/15-1_ОХ понижают способность связывания этих белков с биологическими мембранами. При этом изолированный каталитический домен г12/15-1_ОХ сохраняет способность вступать в мембранное взаимодействие, хотя и в меньшей степени. Исследования в области направленного мутагенеза показали, что в этом процессе могут участвовать остатки гидрофобных аминокислот обоих доменов, расположенные на поверхности молекулы белка [77, 82]. Протеолитическое отщепление N-терминального р-складчатого домена LOX1 сои, напротив, повышает способность фермента к мембранной ассоциации [75]. Для достижения наивысшей каталитической активности 5-LOX человека необходимо присутствие ионов Са2+ [83, 84]. Хотя в присутствии Са2+ способность M2/15-LOX кролика к мембранному связыванию повышается [82, 85], анализ поверхности р-складчатого домена фермента кролика не выявил наличия определенных структурных элементов, способных вступать во взаимодействие с ионами Ca2+. Напротив, р-складчатый домен 8R-LOX кораллов содержит остатки Asp39 и Asp45, а также Asp19, Asn44 и Glu47. Эти аминокислотные остатки, находящиеся на поверхности белка, аналогичны соответствующим аминокислотным остаткам 5-LOX человека, которые при взаимодействии с ионами Ca2+ способствуют проникновению остатков Trp41 и Тгр77 в фосфолипидный слой биомембран [59]. Так как боковые цепи аминокислотных остатков, участвующих во взаимодействии с ионами Са2+, и остатков триптофана находятся на одной стороне от предполагаемого входа в субстрат-связывающий карман, они, по-видимому, изменяют конформацию каталитического домена, облегчая проникновения ПНЖК мембранной фазы в активный центр фермента.
С-Терминальный домен LOX содержит субстрат-связывающий карман и каталитически активное негемовое железо. Каталитический домен всех известных на сегодняшний день изоформ LOX состоит, главным образом, из а-спиралей и содержит негемовое железо. Девятая спираль LOX1 сои длиной в 65 (аминокислотные остатки (а.о.) 473-518) является центральным структурным элементом каталитического домена [46]. Остальные из наиболее длинных спиралей расположены по отношению к ней как параллельно, так и антипараллельно, образуя тем самым ядро домена в виде мультиспирального пучка. В С-домене также представлены две антипараллельные р-складки [60]. В i-12/15-LOX каталитический домен (а.о. 114-663) состоит из 21-ой спирали и малого -складчатого субдомена [31]. Каталитический домен фермента кораллов (а.о. 115-694) содержит 23 спирали. В этом ферменте вторая спираль разбита на две части и расположена под углом к тройной антипараллельной -складке [60]. Каталитически активное негемовое железо всех изоформ LOX координируется в форме октаэдрической сферы пятью аминокислотными остатками. Шестым координационным лигандом служит ОН-анион. В случае LOX1 сои и 8R-LOX коралла лигандами железа являются три остатка His, один Asn и C-терминальный Ile. В кристаллической структуре Asn отдален приблизительно на 3 от иона железа, в связи с чем его роль в образовании координационного кластера довольно слаба. Несмотря на это, анализ рентгеновских координат [43] указывает на наличие обширной сети водородных связей между Asn и экваториальным лигандом His499 посредством двух аминокислотных остатков вторичной координационной сферы железа - Gin495 и Gln697 [86]. В M2/15-LOX железо координируется при помощи четырех остатков His и С-терминального Ile [87] (рис. 2). Один из остатков первичной
Первичная координационная сфера железа r12/15-LOX координационной сферы His (His545) соответствует Asn, который является лигандом железа в LOX1 сои. Что касается липоксигеназ растений, их координационные силы стабилизированы при помощи сети водородных связей при участии лигандов вторичной сферы: Glu357 (соответствует Gln495 LOX1 сои) и Gln548 (соответствует Gin697 LOX1 сои) [31]. Исходя из кристаллических структур липоксигеназ млекопитающих, известных на сегодняшний день, можно заключить, что, по сравнению с 5-LOX человека [63] и г12/15-LOX кролика [67], ионное окружение железа 12-LOX лейкоцитарного типа [65] наиболее приближено к шестикоординатной геометрии октаэдра, что предполагает более стабильную структуру кластера железа.
Молекулярный кислород проникает в активный центр LOX посредством строго контролируемых механизмов
Гены, кодирующие последовательность липоксигеназ, обнаружены в эукариотах и бактериях, но не найдены в археях. Гены LOX обнаружены в растениях [155, 156], животных [1, 113], включая ряд морских организмов [157, 158]. Недавно изоформы LOX были также обнаружены в различных прокариотах [159–161]. Для получения более подробной информации об эволюции LOX был проведен поиск на основе специфичных для LOX последовательностей ДНК с использованием баз данных GenBank, Refseq, Uniprot, Ensembl. Семейство LOX является структурно гетерогенной группой в силу того, что последовательности как ДНК, так и белка известных на сегодняшний день изоформ LOX не содержат отличительных признаков, характерных для всех представителей семейства LOX одновременно. В качестве ключевого элемента поиска были использованы фрагменты ДНК, кодирующие непосредственные лиганды железа и их ближайшее окружение. Результаты проведенного поиска сгруппированы по доменам клеточных форм жизни (рис. 12). Последовательности LOX были найдены как у эукариотов, так и у прокариотов. В археях, напротив, липоксигеназы не были обнаружены, что неудивительно, принимая во внимание исключительную среду их обитания. Для большинства архей субстрат LOX – молекулярный кислород – является токсичным. В процессе эволюционного развития LOX появились у ряда прокариотов (цианобактерии и протеобактерии), в простейших одноклеточных организмах (красные и зеленые морские водоросли), амебе (Dictyostelium discoideum), грибах, растениях (мхах и цветущих растениях) и животных (рис. 12). У животных последовательности LOX встречаются во множестве видов, начиная с пластинчатых Trichoplax adhaerens до приматов, включая кораллы, клеща, желудевого червя, рыб, лягушек, летучую мышь, ежа, мышь, дельфина, слона, обезьяну и человека. Многие виды, содержащие LOX, служат в качестве «модельных организмов», характеризующих определенные стадии развития эукариотов. Volvox carteri является одним из древних многоклеточных организмов, который существует до настоящего времени; Trichoplax adhaerens представляет собой одного из самых простых эуметазоев (лат. Eumetazoa), родственных книдариям (лат. Cnidaria) [162]. Другими «модельными организмами», содержащими последовательности LOX, являются амеба Dictyostelium discoideum (образцовая модель исследования дифференцировки клеток, хемотаксиса и апоптоза), асцидия Ciona intestinalis (считается ближайшим к человеку беспозвоночным и содержит около 80% генов
Цианобактерии Acaryochloris marina Cyanotece sp. Nostoc punctiforme Протеобактерии Burkholderia thailandensis Nitrosomonas europaea Pseudomonas aeruginosa Shewanella woodyi Photobacterium profundum Moxococcus xantus Грибы Базидомицеты Laccaria bicolor Trichlopax aghaerens Книдарии Nematostella vectensis, Clavularia viridis,Plexaura homolala, Hydra magnipapillata Иглокожие Stronglyocentrus purpuratus Членистоногие Ixodes scapularis Полухордовые Saccoglossus kowalevski Хордовые Асцидии Ciona intestinalis Головохордовые Branchiostoma floridae Лучеперные рыбы Danio rerio, Salmo salar, Takifugu rubripes, Gasterosteus aculeatus Амфибии Ambistoma mexic, Xenopus laevis Рептилии Anolis carolinesis Птицы Gallus gallus Млекопитающие Tursiops truncatus, Myotis lucifugus, Felis catus, Macropus eugenii, Omithor-hyncus anatinus, Erinaceus europeaus, Chgoleopus hoffmanni, Loxodonta africana,Mus musculus, Equus caballus, Sus scrofa, Oryctolagus cuniculus, Homo sapiens Цветковые растения Эвдикоты Glycine max Olea europeae Betuta penduta Prunus persica Vitis vinifera Nicotiana tabacum Arabidopsis thaliana Camellia sinensis Persea americana Populus trichocarpa Cucumis sativus Citrus jambhiri Однопольные Oriza sativa Sorghum bicolor Triticum aestivum Красные водоросли Porphyra purpurea Зеленые водоросли Ostreococcus lucimarinus Chlamydomonas reinhardt ii Страминопилы Phytophtora infestans Миксомицеты Dictyostelium discoideum
Наличие липоксигеназной последовательности в ДНК живых организмов. человека), ланцетник Branchiostoma floridae (наиболее тесно связан с первыми позвоночными), а также рыба фугу Tetraodon nigroviridis (имеет самый малый из известных геном позвоночных, 340 миллионов пар оснований). Danio rerio, часто используемый в исследованиях развития позвоночных и изучении функции генов, содержит несколько последовательностей LOX, некоторые из которых классифицированы как 12- и 5-LOX. В геноме других модельных организмов, таких как как Sacharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegans и Drosophila melanogaster последовательности LOX не было обнаружено.
Синтез региоизомерных по положению гидроксигруппы терминальных ацетиленов
Анализ масс-спектров полученных соединений в условиях отрицательной химической ионизации показал образование ключевых ионных фрагментов с m/z 391 [М-181] / 301 [М-181-90] для TMS-PFB эфиров соединений 22 и 33а и 389 [М-181] / 299 [М-181-90] для производных соединений 26 и 34а, соответственно. Эти данные позволили предположить, что образование побочного продукта происходит вследствие неполного каталитического гидрирования субстрата из-за пространственных затруднений, создаваемых объемным остатком бензойной кислоты (при С-16 и С-17 атомах углерода) в области С14-С15 тройной связи. 1Н-ЯМР соединения 24 показал наличие характерного сигнала триплет-триплетов 5н=5,55 м.д., что является результатом развязки С-16 протона на атомах водорода соседней 17-СН2 группы (J = 6,4 Гц) и метиленовых протонов при С-13 (J = 1,7 Гц). Эти данные указывают на положение тройной связи между С-14 и С-15, что позволяет идентифицировать соединение 24 как rac-(5Z,8Z,11Z)-16-гидроксиэйкоза-5,8,11-триен-14-иновую кислоту. На основе масс-спектральных данных и спектров двумерной гетероядерой 1Н/13С корреляции (НМВС) (рис. 15) соединение 32 было идентифицировано как метиловый эфир (R,5Z,8Z,11Z)-17-(бензоилокси)эйкоза-5,8,11-триен-14-иновой кислоты. При анализе спектральных данных наблюдалась однозначная корреляция между ближними (С-15/Н2-16) и удаленными атомами (С-15/Н-17, С-15/Н2-13). Кроме того, наличие трех перекрестных сигналов указывало на дополнительную корреляцию в ряду: С-14/Нг-13, С-14/Н-12 и С-14/Н2-16 [187]. [3Н8]-17(Я)-НЕТЕ1 (30), меченая тритием по четырем двойным связям, была впервые получена по методике [218] каталитическим гидрированием соединения 29 с использованием 3Н2 на катализаторе Линдлара в бензоле с высокой удельной активностью (175-180 Ки/ммоль) и радиохимической чистотой более 98% [212]. В случае предшественника гас-(16)-НЕТЕ (18) введение метки по всем тройным связям не применялось из-за необходимости применения ВЭЖХ для отделения побочного продукта 24, а так же дальнейшего хроматографического разделения рацемата на оптически активные соединения 21а,Ь и 25а,Ь. Получение энантиомеров метиловых эфиров 16-НЕТЕ (21) и его 14,15-дегидроаналога 25 осуществляли разделением рацемических смесей с использованием хирально-фазовой ВЭЖХ (рис. 16). Масштабирование хроматографической методики позволяло выделить оптически чистые энантиомеры 16НЕТЕ (оптическая чистота 99%) в количестве до нескольких десятков миллиграмм. Конфигурацию асимметрической ОН-группы подтверждали измерением угла оптического враще 1Введение радиоактивной метки проводили в Институте молекулярной генетики РАН ния с последующим сравнением экспериментальных данных с литературными (21а): метиловый эфир 16(fi)-НЕТЕ [a]D21 +6 (с 0,7, ацетон); 21Ь, 16(8)-энантиомер [a]D21 -6 (с 0,7, ацетон) (лит. данные [a]D23 -5.4 [205]). Для определения конфигурации хирального центра в соединениях 25а и 25Ь использовали гидрирование энантиомеров в соответствующие тетраеноаты, идентичные соединениям 21а и 21b. 17(S)-НЕТЕ (33b) и ее моноацетиленовый аналог (34Ь) получали на основе (Я)-энантиомера инверсией хирального центра с использованием реакции Мицунобу [205, 219] или полным химическим синтезом исходя из (Я)-эпихлоргидрина как описано для соединений 31 и 32.
В силу того, что высокая удельная радиоактивность [5,6,8,9,11,12,14,15-3Hs]-17(Я)-НЕТЕ (30), необходимая для ряда биологических исследований, затрудняет ее использование при проведении дальнейших модификаций в препаративном масштабе, 14,15-дегидро-16- (26) и 14,15-дегидро-17-НЕТЕ (34) были выбраны в качестве предшественников азидов. Введение азидогруппы проводили через соответствующие п-толуолсульфонаты [220], что приводило к инверсии хирального центра. Синтез через бромиды сохранял исходную конфигурацию асимметрического центра, однако замещение бромида на азид происходило не полностью. Важно отметить, что каталитическое восстановление тройной связи азидов 38а и 38Ь на катализаторе Линдлара в сухом бензоле не затрагивало азидогруппу, тогда как использование метанола приводило к восстановлению азида в амин [221, 222]. Кислоты [14,15-3Н]-17-N3-ЕТЕ (39а и 39Ь) были получены с высокой удельной активностью 40 Ки/моль и по своим свойствам идентичны немеченым производным 36а и 36Ь, синтезированным на основе 17-НЕТЕ [212]. Использование энантиомеров 16-НЕТЕ (21) и их 14,15-дегидроаналогов (25) в рамках предложенной схемы приводило к образованию лишь следовых количеств целевых продуктов вследствие низкой стабильности и высокой реакционной способности аллильных и пропаргильных азидов. В силу вышеуказанных синтетических проблем и низкой стабильности, ео-4 замещенные азидопроизводные АК в проведении дальнейших исследований не использовались.
Синтез терминальных и m-l/a-2 субтерминальных замещенных производных арахидоновой кислоты. В основу синтеза новых азидо-производных 46 и их меченых тритием аналогов 47 положена методология, разработанная для соединений 16- (22) и 17-НЕТЕ (33) (Схемы 4 и 5). гас-(5Z,8Z,11Z,14Z)-19- (44b) и гас-(57,87,117,147)-18-Гидрокси-5,8,11,14-эйкоза-тетраеновые (44а) кислоты использовались в качестве ключевых промежуточных соединений (Схема 6). (57,87,117,147)-20-Гидрокси-5,8,11,14-эйкозатетраеновая кислота (44с) была использована в работе без дальнейших модификаций. Из соображений безопасности введение азидогруппы в молекулу радиоактивно меченых гидроксикислот 45 [радиохимическая чистота 95% и удельная радиоактивность в 160 Ки/ моль] проводилось с использованием образцов разбавленных немечеными аналогами 44 в соотношении 1:100. Конечные продукты 47 были получены с выходом 26% по 2-м стадиям с удельной радиоактивностью в интервале 0,79 - 1,6 Ки/моль [217]. Идентичность радиоактивно-меченых соединений 47 их немеченым аналогам 46 показана с помощью аналитической ВЭЖХ.
Схема Условия: (a) CBr4, PPh3, CH2Cl2, 20oC, 1 ч; (b) 8, CuI, NaI, K2CO3, ДМФ, 20oC; (c) H2/3H2 катализатор Линдлара, бензол, 10oC; (d) NaOH, MeOH-H2O, 20oC; (e)TsCl, CH2Cl2, Py, 20oC, 24 ч; (f) NaN3, ДМФ, 75-80 oC, 3,5 ч
Использование ингибиторов является распространенным подходом при исследовании каталитического центра фермента, связывающих доменов регуляторных белков и пр. С целью изучения механизмов взаимодействия в ряду r12/15-LOX–лиганд были получены новые соединения 48-52, дизайн которых основан на сходстве с известными ингибиторами 5-LOX и r12/15-LOX (рис. 17), Рис. 17. Структуры ингибиторов r12/15-LOХ таких как целутон (53) [23], эбселен (54) [223, 224] и салициловая кислота (55) [225]. (Z)-Изомер метилового эфира 2-бензилиден-3-оксо-2,3-дигидробензо[b]тиофен-7-карбоновой кислоты (BODTCM) (48)2 получали реакцией тиондоксила (56) с бензальдегидом (57) (Схема 7) [226]. Облучение раствора (Z)-BODTCM в ДМСО при 405 нм приводило к изомеризации двойной связи с образованием фотостационарной смеси (pss). Определение количественного соотношения Z- и E-изомеров в смеси pss (Z/E=38:62) проводили с помощью 1Н-ЯМР спектроскопии сравнением интенсивности сигналов винильных протонов с химическим сдвигом
Анализ третичной структуры и динамики конформационных изменений г12/15-1 ОХ дикого типа и мутантов
Кинетика окисления терминальной 20-НЕТЕ (44с) и суб-терминальной 19-НЕТЕ (44Ь) в отсутствии экзогенного активатора (13(S)-HpODE) характеризуется наличием чрезвычайно длинной лаг-фазы ( 15 мин) и короткой прогрессивной фазы, за которой следует фаза обратимой инактивации фермента (рис. 27А) [241]. Наличие фазы обратимой инактивации фермента свидетельствует об образовании менее устойчивого фермент-субстратного комплекса, чем в том случае, когда АК используется в качестве субстрата. С целью выявления причин подобной кинетической зависимости были проведены исследования скорости ферментативной реакции в качестве функции от концентрации субстрата, кислорода, фермента, а также активатора (13(S)-HpODE). В качестве субстрата была выбрана гас-19-НЕТЕ (44Ь), для которой эффект был наиболее ярко выраженным. Независимо от исходных условий (рис. 27Б-27Д) кинетические кривые окисления гас-19-НЕТЕ имели нелинейный характер и практически одинаковую форму. Хотя только прогрессивная фаза скорости окисления 19-НЕТЕ (рис. 27А) может быть описана уравнением Михаэлиса-Ментена, оценочное значение величины КМ субстрата в 90 мкМ (гипоксические условия) подтверждает ранее полученные данные о том, что наличие ю/ю-4 гидроксильной группы,
Образование кетодиенов в процессе реакции M2/15-LOX с 19-НЕТЕ. (А) r12/15-LOX инкубировали с 19-НЕТЕ (87 нМ фермент, 200 M 19-НЕТЕ, 40 jM 13(S)-HpODE, 280 мМ кислород) и контролировали изменение интенсивности УФ-поглощения при 275 нм. (I - образец содержащий 19-НЕТЕ; II - образец не содержащий 19-НЕТЕ). (Б) Анализ продуктов реакции методом ВЭЖХ на обращенной фазе. Вставка: спектр УФ-поглощения, содержащий кетодиеновый хромофор и элюируемый со временем удерживания стандарта (13-KODE). Методика выделения продуктов и аналитические условия приведены в экспериментальной части. независимо от ее положения, понижает сродство фермента к ПНЖК. Интересно отметить, что в случае второго липоксигеназного субстрата, кислорода, даже при его концентрации 800 мкМ насыщения не наблюдалось. В случае 19-НЕТЕ КМ(О2) превосходила более чем в 40 раз имеющееся значения КМ(О2) для комплекса АК с ферментом (10-20 мкм). При более высокой концентрации активатора (13(S)-HрODE) сродство фермент-субстратного комплекса к кислороду возрастало (рис. 27Д), при этом увеличение концентрации кислорода ослабляло действие 13(S)-HрODE (рис. 27Б). Уменьшение скорости ферментативной реакции в условиях нелимитирующих концентраций субстратов (ПНЖК и кислород) позволяет предположить, что экзогенный активатор (13(S)-HpODE) может подвергаться ферментативному превращению за счет пероксидазной активности Fe2+-LOX. Действительно, более чем через две минуты после начала реакции 90% активатора превращались в кетодиеновое производное (рис. 28). Полученные данные показывают, что концентрация активатора постепенно снижается в процессе протекания реакции, при этом постоянное понижение концентрации 13(S)-HpODE и уменьшение ферментативной активности сопутствуют друг другу.
В свете экспериментальных данных, изложенных нами, существующая кинетическая модель липоксигеназного катализа [240, 242, 243] была дополнена и расширена с учетом ряда элементарных реакций (Схема 9): 1) Активация каталитически неактивной Fe2+-LOX зависит от концентрации кислорода и включает в себя образование кетодиенов и супероксид анионов. Первым шагом перекисной активации LOX является гомолитическое расщепление пероксидной связи [244, 245], которое сопровождается переносом электронов от Fe2+-LOX к гидроксильному радикалу, приводя к образованию алкоксильного радикала и ОН-. Алкоксильный радикал может восстанавливать кислород с формированием супероксида и кетодиеновой кислоты (R=O). Кроме того, алкоксильный радикал может быть стабилизирован посредством бета-расщепления углеводородной цепи, эпоксидирования или димеризации. 2) В случае, когда каталитически активная Fe3+-LOX катализирует отщепление водорода, образуется субстрат ферментный комплекс (EFe2+-S). Введение молекулярного кислорода в (EFe2+-S) приводит к образованию радикального комплекса (EFe2+-SОО). Оба каталитических интермедиата содержат фермент в каталитически неактивной Fe2+-форме, распад которых может привести к выходу фермента из каталитического цикла, что, как следствие, требует его дополнительной реактивации. Выход Fe2+ формы из окислительного цикла сопровождается высвобождением радикальных интермедиатов (S или SОО). Хотя причины выхода фермента из окислительного цикла неясны, наиболее вероятно это связано с природой субстрата и/или неустойчивостью фермент-субстратного комплекса. 3) Рекомбинация радикалов в активном центре. Супероксид (О2), образующийся при активации фермента
Схема может рекомбинировать с EFe2+-S. Численные значения констант скорости и обязательные параметры были получены путем валидации кинетической модели на основе экспериментальных данных. Расчетные значения параметров приведены в таблице 7. Полученная модель предполагает бифазный характер зависимости скорости реакции от концентрации кислорода (с компонентами высокого и низкого сродства к кислороду). Компонента с низким сродством может быть связана с участием кислорода в повторной реактивации каталитически неактивной Fe2+ формы, образующейся в процессе распада комплекса EFe2+-SОО. Кинетическая модель предусматривает возможность обратимой инактивации фермента (распад EFe2+-S и EFe2+-SОО комплексов). Распад комплекса EFe2+-SОО происходит с константой скорости k PO=2,2 с-1, тогда как распад EFe2+-S наименее вероятен (kPS=0,0009 с-1). Высокая степень энантиомерной специфичности является весомым аргументом в пользу этого предположения. Константа скорости активации фермента под действием 13(S)-HpODE (k+A) в два раза превышает